Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Nanomatériaux sont aujourd'hui une source d'inspiration de l'intérêt des sciences de la vie pour des applications potentielles à la biomédecine ^1. Une grande variété de matériaux inorganiques et organiques peuvent être utilisés pour produire des nano-structures de différentes formes physiques, et les caractéristiques chimiques. Parmi ces structures, nanoparticules de forme sphérique ont démontré un grand potentiel pour la médecine de diagnostic et de translation ^2. Leur noyau et la conception de surface sont entraînés par une application possible et il implique une étude approfondie des réponses des cellules cibles après un contact de nanoparticules et de l'interaction. Nanoparticules qui sont censés être délibérément administré à des sujets humains entrent en contact direct avec plusieurs types de cellules immunitaires. Leur responsabilité de maintenir l'intégrité du corps eux un sujet crucial de l'enquête dans la nanomédecine ³ fait.

La partie cellulaire du système immunitaire inné est principalement représentée par des phagocytes. Parmi eux, la lignée des monocytes / macrophages cellules dérivées, y compris les microglies résidentes du système nerveux central, jouent un rôle clé dans la défense immunitaire ^4,5. Ils sont capables de déclencher des réactions de protection au sein de quelques heures après la rencontre avec des corps étrangers. En outre, les cellules monocytaires coordonner et instruisent la réponse immunitaire adaptative par la libération de cytokines. Tous ces événements se produisent même en présence de matériaux techniques, qui sont largement perçus comme «non-soi» par le système immunitaire ^6.

Parmi les méthodes utilisées historiquement en immunologie pour l'analyse cellulaire, la cytométrie en flux représente l'un des outils les plus puissants. En outre, la disponibilité des technologies pour l'identification ou la purification d'une sous-population immunitaire spécifique (souvent en exploitant l'exclusion ou la présence d'une protéine de membrane unique) permet une enquête précise des effets d'un certain nanoparticules sur ce CE primaire particuliertype II ^7. Cependant, les cellules peuvent présenter des altérations physiologiques et morphologiques après exposition aux nanoparticules. En outre, les nanoparticules peuvent interférer avec les paramètres optiques spécifiques, telles que l'absorption ou émission de lumière à des longueurs d'onde définies, influencer les résultats obtenus ^8. Ainsi, les limites d'utilisation et les adaptations éventuelles de dosages immunologiques classiques à l'étude de nouveaux matériaux doivent être considérés.

Ce travail porte sur la détection d'interactions de nanoparticules avec les cellules immunitaires primaires, par cytométrie de flux. Pour résoudre ce problème, 50 nm FITC nanoparticules de SiO ₂ ont été utilisés comme un nanomatériau de modèle pour décrire la méthode. Les particules de silice peuvent être produits d'une manière très précise à l'échelle nanométrique. Taille, forme, et les propriétés de surface, telles que la charge ou hydrophobie, peuvent être finement réglé pour augmenter leur biocompatibilité ^9. Plusieurs caractéristiques de nanoparticules de SiO ₂ leur permettent d'être utilisés en tant quemodèle pour la livraison de drogue particules ^10. En outre, des colorants fluorescents ou quantum dots peuvent être piégés ou liés à ces particules offrant des nano-outils utiles à des fins d'imagerie ^11.

ÉTHIQUE DÉCLARATION

échantillons humains et animaux ont été traités suivant les directives du ministère italien de la Santé, de la loi 116/92 et la directive du Conseil 86/609/CEE Communautés européennes.

Une. Cultures cellulaires de monocytes

1. Culture des cellules humaines THP-1 à T-75 flacons contenant du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum humain, 50 U / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine, 0,05 mM de β-mercaptoéthanol à 37 ° C dans 5% de CO _2.
2. cultures Split quand confluent (tous les 3-5 jours).

2. Isolement de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) de Buffy Manteaux

1. Avant de commencer le protocole d'isolement, préparer une solution de tampon phosphate salin (PBS) pH 7,2, 2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA), en ajoutant 5 ml de BSA la solution mère à 95 ml de tampon (1 Rinçage: 20 dilution). Dégazer le tampon et le garder au frais (2-8° C).
   IMPORTANT: Ne pas dégazer le tampon peut entraîner moins de résultats optimaux parce que les bulles peuvent bloquer la colonne d'isolement (voir l'étape 3.2).
   Remarque: anticoagulant formule-citrate-dextrose (ACD-A) ou du dextrose citrate phosphate (DPC) peut être encore utilisé. Inversement, d'autres protéines d'albumine ou des sérums provenant d'autres espèces peuvent remplacer BSA. Ne pas utiliser de tampons contenant Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +.}
2. Obtenir des couches leucocytaires provenant de donneurs sains (âgés de 20-60 ans).
3. Préparer 50 ml tubes coniques de centrifugation en gradient de densité. Déterminer le nombre de tubes nécessaires pour traiter le sang (chaque tube peut traiter 35 ml de sang dilué) et ajouter 15 ml de Ficoll-Paque à chaque tube vide.
4. Diluer 8 ml de sang avec 24 ml de PBS / BSA / solution d'EDTA (1h04 de dilution).
5. Superposer soigneusement la solution diluée au-dessus du Ficoll-Paque (densité = 1,077 g / ml) dans chacun des 50 tubes coniques ml. Ne pas mélangerle sang et le Ficoll-Paque.
   IMPORTANT: Pour éviter le mélange du sang et de Ficoll-Paque, tenir le tube à un angle de 45 ° et la couche de mélange de sang lentement.
6. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à 4 ° C. Des cellules mononucléaires (MNC) restent à l'interface plasma-Ficoll-Paque, tandis que les granulocytes et les globules rouges en raison de sédiments densité supérieure à la pression osmotique de Ficoll-Paque.
7. Transférer les cellules en interphase (cellules mononucléées du sang périphérique, PBMC) dans un nouveau tube de 50 ml remplie de PBS / BSA / EDTA et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
8. Laver le culot deux fois avec PBS / BSA / EDTA pour éliminer les plaquettes. Tourner à 200 g pendant 10 min à 4 ° C.
9. Culture des cellules RPMI complet-1640 avec 10% de sérum humain et des antibiotiques ou procéder à la purification des monocytes.

3. Purification des monocytes primaires à partir de PBMC

1. Isoler les monocytes de PBMC par séparation par billes magnétiques utilisant Humun kit d'isolement des monocytes Pan:
   1. Passez cellules à travers un maillage de 30 um Nylon (filtres de pré-séparation, 30 pm) pour éliminer les grumeaux de cellules possibles.
   2. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hématimètre.
   3. Centrifuger la suspension de cellules à 300 xg pendant 10 min à température ambiante (RT). Aspirer le surnageant complètement.
   4. Resuspendre le culot cellulaire dans 30 ul de tampon PBS / EDTA / BSA pour 10 ⁷ cellules totales.
   5. Ajouter 10 ul FcR réactif de blocage par 10 ⁷ cellules totales.
   6. Ajouter 10 ul de cocktail biotine-anticorps par 10 ⁷ cellules totales.
   7. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 2-8 ° C.
   8. Ajouter 30 ul de tampon par 10 ⁷ cellules totales.
   9. Ajouter 20 ul d'anti-biotine microbilles par 10 ⁷ cellules totales.
   10. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à 2-8 ° C.
   11. Remettre en suspension à 10 ⁸ cellules dans 500 ul de tampon PBS / EDTA / BSA.
2. Separ magnétiqueation
   1. Par conséquent le nombre total de cellules, choisissez une colonne MACS approprié et MACS Separator (voir colonne MACS fiche technique).
   2. Placer la colonne dans le champ magnétique du séparateur MACS.
   3. Préparer colonne par rinçage avec la quantité appropriée de tampon PBS / EDTA / BSA (MS colonnes: 500 ul; LS colonnes: 3 ml).
      Remarque: Les colonnes sont "arrêt d'écoulement" et ne vont pas à sec.
   4. Appliquer une suspension de cellules dans la colonne. Recueillir accréditives contenant des cellules non marquées, représentant la fraction de monocytes enrichi.
   5. Laver la colonne 3x avec du tampon PBS / EDTA / BSA (500 pi pour MS et 3 ml de LS par lavage).
   6. Recueillir des cellules non marquées qui traversent, représentant les cellules monocytes enrichies, et ajouter à la accréditive de la section 3.2.4.
      Remarque: Laver la colonne par addition de quantités de tampon PBS / EDTA / BSA que lorsque le réservoir de la colonne est vide.
   7. (Optionnel) Enlevez colonne de laséparateur et le placer sur un tube approprié de collecte. Introduire à la pipette le tampon sur la colonne (MS colonnes: 1 ml; colonnes LS: 5 ml). Rincer immédiatement les cellules nonmonocyte magnétiquement marquées en poussant fermement le piston dans la colonne.
   8. Culture purifiée complète monocytes dans un milieu RPMI-1640 avec 10% de sérum humain et des antibiotiques.

4. Purification de monocytes primaires à partir de sang

1. Purifier les monocytes du sang total en utilisant le kit d'isolement de l'ensemble des monocytes du sang en suivant les instructions du fabricant.

5. Nanoparticules internalisation dans les leucocytes sanguins et purifiées monocytes

1. Plaque 5 x 10 ⁵ cellules / ml (1 ml / puits) des PBMC isolées ou les monocytes CD14 positives purifiées dans une plaque de 12 puits.
2. Vortex FITC-SiO ₂ nanoparticule solution mère et remettre en suspension dans un milieu complet à une concentration de travail de 100 nM.
3. Ajouter 10 ul de nanop travailarticle suspension (100 nM) pour les échantillons traités pour atteindre une nanoparticule concentration finale de 1 nM. Ajouter le même volume de milieu complet pour les témoins non traités pour chaque puits.
4. Après 1 heure, l'internalisation de recueillir les échantillons dans un tube en polypropylene de 1,5 ml et les centrifuger pendant 3 min à 6000 x g à température ambiante.
5. Laver le culot avec 1 ml de tampon courante 3 min à 6000 x g à température ambiante.
6. Remettre en suspension le culot dans 200 pl de tampon de migration. Les cellules sont maintenant prêts pour une lecture par cytométrie de flux.

6. Isolation des cultures gliales mixtes primaires (Voir Bertero et al. ⁷⁾

7. Réensemencement un gliales Confluent culture cellulaire mixte

1. Laver un flacon T-75, une fois avec 10 ml de PBS (w / o Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +),} puis ajouter 10 ml de Versene et incuber à 37 ° C pendant 5-7 min.
2. Introduire à la pipette le surnageant et à plusieurs reprises afin de détacher les cellules de la surface T-75 et dissoudredes agrégats de cellules.
3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube en polypropylene de 15 ml. Recueillir une petite quantité de suspension cellulaire à compter les cellules avec un hémocytomètre.
4. Centrifuger la suspension de cellules pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
5. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot à une concentration finale de 5 x 10 ⁵ cellules / ml dans du milieu de culture complet gliale.
6. Plate 0,5 ml / puits dans une plaque de 24 puits et laisser les cellules se contenter de 2-4 heures avant le traitement de nanoparticules.

8. Nanoparticules internalisation dans microglies

1. Ajouter 500 ul de milieu complet de culture gliale (pour les témoins non traités) ou 500 ul d'une suspension de nanoparticules 2x Rhodamine-SiO ₂ dans un milieu complet de culture gliale (pour les échantillons traités) à chaque puits.
2. Introduire à la pipette les cellules pour permettre le détachement des cellules nonrapid-adhérant aux points de temps choisis et à les recueillir dans des tubes de 2 ml en polypropylene.
3. Ajouter 500 ulde Versene à chaque puits et incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 min, puis détacher la fraction restante de la pile et de recueillir chaque échantillon avec des cellules non adhérent correspondants de l'étape précédente.
4. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 300 x g à température ambiante.
5. Reprendre le culot dans 100 ul de tampon AutoMACS en cours.

9. La coloration avec CD11b-VioBlue

1. Ajouter 10 ul d'anticorps humain / souris VioBlue-CD11b à 100 pl de suspension cellulaire (rapport 1:11) dans le tampon de migration et incuber 10 min à 4 ° C.
2. Ajouter 1 ml de tampon de migration et de mélange de la suspension cellulaire.
3. Centrifugeuse de chaque échantillon pendant 3 min à 300 x g.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 100-150 ul de tampon de migration.
5. Lire les échantillons au cytomètre (conserver les échantillons à 4 ° C entre les deux dernières étapes).
   IMPORTANT: avant d'analyser les échantillons, procéder à la compensation des signaux qui se chevauchent in spectres d'émission observé entre les différents fluorochromes (nanoparticules ou des anticorps conjugués à un fluorochrome).

10. Déversement spectrale Surcompensation

1. Ouvrez la boîte de dialogue "Paramètres d'instrument" (présent dans tous les logiciels de l'instrument).
   Remarque: Si vous utilisez un instrument différent de celui indiqué dans le tableau des matériaux, s'il vous plaît se référer au manuel spécifique de l'instrument pour les détails d'acquisition.
2. Acquérir échantillon non traité (sans nanoparticules) à basse vitesse fluidique (si permis par l'instrument). Lors de l'acquisition, ajuster manuellement avant et diffusion latérale (FSC et SSC, respectivement) en réglant les canaux de tension.
   Remarque: Modifiez les échelles des axes de la SSC et FSC pour mieux visualiser la population cellulaire totale dans l'intrigue. Une mise en modèle pour chaque type de cellule d'intérêt instrument peut être créé, enregistré et utilisé pour des acquisitions futures.
3. Ouvrez le spécifiqueOnglet "région" dans le logiciel. Dessiner une grande région appropriée ("porte") autour de la population souhaitée.
   Remarque: L'internalisation des nanoparticules induit un décalage SSC des cellules. Si la porte est trop étroitement limitée autour de la population cellulaire d'intérêt, les données acquises seront probablement manquer une partie des cellules à détecter.
4. Utilisez deux échantillons non colorés, un pour une utilisation comme échantillon à blanc et l'autre pour la compensation contre coloration PI (facultatif), un seul échantillon teinté avec le fluorochrome approprié pour chaque canal de fluorescence à être indemnisés.
   Remarque: utiliser un tube de 1,5 ml de l'échantillon différent pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome pour être utilisé dans l'étiquetage de l'expérience.
5. Ouvrez l'onglet "Compensation" dans la boîte "des paramètres de l'instrument". Augmenter ou diminuer le facteur de compensation lors de l'acquisition jusqu'à ce que l'intensité de fluorescence dans le canal de débordement est à peu près la même pour la pos fluorochromeitive et démographique négative.
6. Acquérir des échantillons de nanoparticules traitées après la compensation a été ajustée.

Cytométrie de flux est un outil utile pour identifier et caractériser des cellules différentes et il est la technique de choix pour identifier des cellules immunitaires spécifiques, telles que les monocytes, les granulocytes, les cellules T, les cellules B, les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules dendritiques (CD), et d'autres sous-populations de leucocytes.

Dans le but de mieux caractériser les globules blancs comportement en réponse à des nanoparticules, nous avons effectué des dosages d'internalisation avec les leucocytes primaires isolées à partir du sang de donneurs sains (Figures 1 et 2) et avec la lignée cellulaire de monocytes humains (cellules THP-1, la figure 3) .

Comme indiqué dans la figure 1A, les trois grandes sous-populations de leucocytes dans le sang ont été clairement identifiés par l'avant et la diffusion de côté après PBMC isolement. En outre, après FITC-SiO 2 traitements, les lymphocytes (gris), les monocytes (bleu) et les granulocytes (rouge) ont un autre ntaux d'internalisation de anoparticle comme représenté par l'intensité de fluorescence verte (figure 1B). Le protocole décrit permet la purification de CD14 monocytes primaires positifs de PBMC. Figure 2A indique la cytométrie de flux en points de monocytes CD14 + en présence de FITC-SiO 2. Figure 2B représente FITC-SiO 2 internalisation quantifiés dans les mêmes cellules et exprimés en logarithmique histogramme échelle.

Internalisation similaire expériences ont été réalisées sur des monocytes THP-1 traitées avec des concentrations croissantes de FITC-nanoparticules de SiO 2. Les cellules non traitées ont été utilisées comme témoin négatif. Figure 3A montre une augmentation dose-dépendante de la diffusion latérale avec un dispersant sans modification dans les cellules THP-1 lignée cellulaire. Sur la figure 3B, avec les histogrammes de SSC et FSC à chaque FITC-SiO 2 concentration de nanoparticules testé, l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) quantification est présenté. Ces données suggèrent que le traitement avec du FITC nanoparticules de SiO 2 induit une internalisation dépendante de la dose dans les monocytes mis en évidence par l'amélioration de granularité intracellulaire (diffusion latérale) et de fluorescence (canal vert).

Pour obtenir de nouvelles informations sur le type d'interaction entre les cellules immunitaires et les nanoparticules, les cultures mixtes gliales primaires ont été isolées et les microglies, les cellules du système nerveux central résidents du système immunitaire, a été purifié. L'utilisation d'un modèle de souris transgénique exprimant la microglie fluorescente verte permet de visualiser des mécanismes neuro-inflammatoires différentes. La souris transgénique B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J utilisée dans ce travail exprime la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur CX3CR1 12. Au bout de 7 jours in vitro (DIV), la microscopie de fluorescence montre une culture gliale primaire mélangé avec un grand nombre d'astrocytes (GFP de cellules adhérentes négatifs) et des cellules vertes (GFP positif, figure 5A). Dans ce modèle de souris, trois sous-populations gliales peuvent être distingués par cytométrie en flux avec un seul coloration CD11b-anticorps: la première CD11b - GFP - (astrocytes et d'autres cellules gliales), un second groupe distinct de + GFP cellules microgliales CD11b +, et un troisième GFP CD11b + - sous-population (figure 4A). Ces deux dernières sous-populations sont à la fois capables d'intérioriser des nanoparticules avec une légère augmentation de l'efficacité de la GFP + population (représentant la patrouille microglie immature par la transcription du promoteur CX3CR1), comme indiqué par cytométrie en flux (figure 4B). L'internalisation produite peut être en outre vérifiée par microscopie confocale en utilisant la même concentration finale de la rhodamine-nanoparticules de SiO 2, comme indiqué sur la figure 5B.

2 nanoparticule internalisation dans les monocytes CD14 + purifiées. A) avant Représentant diffusion (FSC) par rapport à la diffusion latérale (SSC) cytométrie de flux en points de monocytes positifs CD14 purifiés. B) fluorescence verte histogramme tracé de la sous-population de monocytes purifiés en présence de 1 nM FITC nanoparticules de SiO 2 (45 mV) pendant 1 heure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Effets de la FITC-SiO 2 internalisation des nanoparticules sur les cellules THP-1. A) représentatif de la diffusion vers l'avant (FSC) en fonction de scatterin latéraleg (SSC) cytométrie de flux en points de THP-1 lignée cellulaire de monocytes, après une exposition h de FITC-nanoparticules de SiO 2 augmentation de la concentration. B) Concentration dépendant variation de la diffusion latérale (SSC), diffusion vers l'avant (FSC) et vert fluorescence en présence de FITC-nanoparticules de SiO 2 (45 mV) pendant 1 heure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Rhodamine-SiO 2 nanoparticule internalisation dans les microglies primaire isolé du B6.129P-CX3CR1 souris tm1Litt / J. A) la protéine fluorescente verte (GFP) contre CD11b-VioBlue cytométrie de flux en points de prglie mixte imary isolé de B6.129P-CX3CR1 souris tm1Litt / J. CD11b + GFP + et CD11b + GFP - populations sont présentées dans la partie supérieure droite et en quadrants en bas à droite, respectivement B) parcelle fluorescence rouge superposition de l'histogramme des sous-populations de la microglie dans la présence de 1 nM rhodamine nanoparticules de SiO 2 (45 mV) pour 30. min (histogramme rouge) par rapport au contrôle (histogramme gris). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. La visualisation de GFP +-microglie. (A) La microscopie à fluorescence à 7 DIV et (B) de la microscopie confocalede la rhodamine-SiO 2 nanoparticule internalisation (flèches rouges) dans la GFP + microglie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs déclarent que Miltenyi Biotech GmbH a parrainé la présentation de ce manuscrit. HiQ-Nano Company ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) est un spin-off nanotechnologie société née de l'ITI.