Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

L'analyse de l'interaction des nanoparticules avec des sous-populations de cellules immunitaires définies par cytométrie de flux.

L’objectif global de cette procédure est de détecter les interactions des nanoparticules fluorescentes avec les sous-populations de cellules immunitaires primaires par cytométrie en flux. Ceci est accompli en traitant d’abord les cellules d’intérêt avec les nanoparticules. Dans l’étape suivante, les cellules sont marquées avec des anticorps contre des marqueurs de surface spécifiques aux cellules, puis analysées par cytométrie en flux.

En fin de compte, l’interaction des nanoparticules avec les populations de cellules immunitaires individuelles peut être mesurée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie est qu’avec cette technique, les variations des intensités de fluorescence induites par les nanoparticules peuvent être quantifiées dans des populations cellulaires non adhérentes Pour l’internalisation des nanoparticules dans les leucocytes sanguins, ou monocytes purifiés, commencez par placage cinq fois 10 à la cinquième des cellules d’intérêt dans un millilitre par puits. Dans chaque puits d’une plaque à 12 puits.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de suspension de nanoparticules de dioxyde de silicium fluorescent fraîchement préparée dans chaque puits expérimental, en ajoutant un volume égal de milieu complet aux puits de contrôle non traités à ce moment-là également. Après une internalisation d’une heure à 37 degrés Celsius, transférez les échantillons dans des tubes individuels en polypropylène de 1,5 millilitre, puis faites tourner les échantillons pendant trois minutes à 6 000 fois G et à température ambiante pour colorer les cellules avec du CD 14 via l’incubation bleue de 100 microlitres de chaque suspension cellulaire dans 10 microlitres d’anticorps humain dans un rapport de un à 11 dans un tampon de fonctionnement pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir éliminé l’anticorps non lié dans un millilitre de tampon de coulée, remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de coulée fraîche pour l’analyse cytométrique en flux.

Ensuite, pour configurer la compensation de débordement spectral, ouvrez la boîte de paramètres de l’instrument dans le logiciel de cytométrie en flux, puis acquérez un échantillon exempt de nanoparticules d’anticorps non marqué à faible vitesse fluidique. L’ajustement des paramètres de compensation en présence de nanoparticules fluorescentes est la partie la plus délicate de la procédure car les nanoparticules peuvent interférer avec la diffusion latérale pour assurer le succès, une porte de la population cellulaire d’intérêt doit être définie Ajustez manuellement la diffusion directe et latérale en régulant les canaux de tension. Ensuite, dessinez une porte de taille appropriée autour de la population cellulaire souhaitée.

Chargez un autre échantillon non étiqueté et ouvrez l’onglet de compensation dans la boîte des paramètres de l’instrument. Ajustez le facteur de compensation pendant l’acquisition jusqu’à ce que l’intensité de fluorescence dans le canal de débordement soit à peu près la même pour les populations positives et négatives au fluorochrome. Enfin, après avoir ajusté la compensation pour chaque tube de contrôle au fluorochrome coloré, lu les échantillons traités aux nanoparticules dans le but de mieux caractériser le comportement des globules blancs en réponse aux nanoparticules, des tests d’internalisation ont été effectués comme nous venons de le démontrer.

Par exemple, dans cette expérience représentative, trois sous-populations principales de leucocytes sanguins ont été clairement identifiées par diffusion vers l’avant et sur le côté après l’isolement des PBMC. De plus, après un traitement au dioxyde de silicium fz, les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes présentaient des taux d’internalisation des nanoparticules différents, comme l’indique leur intensité de fluorescence. Dans ces images, l’internalisation des nanoparticules est démontrée dans des monocytes primaires positifs pour CD 14 purifiés à partir de pbmc.

Ces nuages de points montrent des monocytes positifs pour CD 14 en présence de nanoparticules de dioxyde de silicium de Fitz. L’histogramme illustre la quantification des cellules positives en forme exprimée en intensité de fluorescence. Des expériences d’internalisation similaires ont été réalisées avec des monocytes TP 1 traités avec des concentrations croissantes de nanoparticules de dioxyde de silicium de Fitz avec des cellules non traitées comme contrôle négatif.

Les diagrammes à points illustrent l’augmentation dose-dépendante de la diffusion latérale avec une diffusion vers l’avant inchangée dans la lignée cellulaire TP one après l’internalisation des nanoparticules. Les données de ces graphiques suggèrent que le traitement avec les nanoparticules de dioxyde de silicium de Fitz induit une internalisation dose-dépendante dans les monocytes mise en évidence par l’augmentation de la granularité intracellulaire pour mieux comprendre les interactions entre les cellules immunitaires et les nanoparticules, les microglies ont été cultivées pendant sept jours in vitro et incubées avec des nanoparticules pendant une heure. La microscopie à fluorescence a indiqué une culture mixte de cellules gliales primaires avec un grand nombre d’astrocytes non adhérents négatifs à la GFP et quelques cellules positives à la GFP.

Dans cette expérience représentative, trois sous-populations gliales ont pu être distinguées par cytométrie en flux avec un seul anticorps CD 11 B colorant CD 11 B, des astrocytes négatifs à la GFP négative et d’autres cellules gliales des cellules microgliales CD 11 B à GFP positive et une sous-population à CD 11 B positive à la GFP. Les deux dernières sous-populations sont capables d’internaliser des nanoparticules avec un déficit légèrement accru par la population positive à la GFP. L’internalisation des nanoparticules peut être vérifiée par microscopie confocale, comme le démontre cette image en utilisant des nanoparticules de dioxyde de silicium à dominante de bâtonnet.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les échantillons dans l’obscurité pour éviter le blanchiment des colorants fluorescents et de maintenir les échantillons à quatre degrés pendant l’incubation des anticorps. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la localisation intracellulaire des nanoparticules.