Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux
28 mars 2014
L'analyse de l'interaction des nanoparticules avec des sous-populations de cellules immunitaires définies par cytométrie de flux.
L’objectif global de cette procédure est de détecter les interactions des nanoparticules fluorescentes avec les sous-populations de cellules immunitaires primaires par cytométrie en flux. Ceci est accompli en traitant d’abord les cellules d’intérêt avec les nanoparticules. Dans l’étape suivante, les cellules sont marquées avec des anticorps contre des marqueurs de surface spécifiques aux cellules, puis analysées par cytométrie en flux.
En fin de compte, l’interaction des nanoparticules avec les populations de cellules immunitaires individuelles peut être mesurée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie est qu’avec cette technique, les variations des intensités de fluorescence induites par les nanoparticules peuvent être quantifiées dans des populations cellulaires non adhérentes Pour l’internalisation des nanoparticules dans les leucocytes sanguins, ou monocytes purifiés, commencez par placage cinq fois 10 à la cinquième des cellules d’intérêt dans un millilitre par puits. Dans chaque puits d’une plaque à 12 puits.
Ajoutez ensuite 10 microlitres de suspension de nanoparticules de dioxyde de silicium fluorescent fraîchement préparée dans chaque puits expérimental, en ajoutant un volume égal de milieu complet aux puits de contrôle non traités à ce moment-là également. Après une internalisation d’une heure à 37 degrés Celsius, transférez les échantillons dans des tubes individuels en polypropylène de 1,5 millilitre, puis faites tourner les échantillons pendant trois minutes à 6 000 fois G et à température ambiante pour colorer les cellules avec du CD 14 via l’incubation bleue de 100 microlitres de chaque suspension cellulaire dans 10 microlitres d’anticorps humain dans un rapport de un à 11 dans un tampon de fonctionnement pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir éliminé l’anticorps non lié dans un millilitre de tampon de coulée, remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de coulée fraîche pour l’analyse cytométrique en flux.
Ensuite, pour configurer la compensation de débordement spectral, ouvrez la boîte de paramètres de l’instrument dans le logiciel de cytométrie en flux, puis acquérez un échantillon exempt de nanoparticules d’anticorps non marqué à faible vitesse fluidique. L’ajustement des paramètres de compensation en présence de nanoparticules fluorescentes est la partie la plus délicate de la procédure car les nanoparticules peuvent interférer avec la diffusion latérale pour assurer le succès, une porte de la population cellulaire d’intérêt doit être définie Ajustez manuellement la diffusion directe et latérale en régulant les canaux de tension. Ensuite, dessinez une porte de taille appropriée autour de la population cellulaire souhaitée.
Chargez un autre échantillon non étiqueté et ouvrez l’onglet de compensation dans la boîte des paramètres de l’instrument. Ajustez le facteur de compensation pendant l’acquisition jusqu’à ce que l’intensité de fluorescence dans le canal de débordement soit à peu près la même pour les populations positives et négatives au fluorochrome. Enfin, après avoir ajusté la compensation pour chaque tube de contrôle au fluorochrome coloré, lu les échantillons traités aux nanoparticules dans le but de mieux caractériser le comportement des globules blancs en réponse aux nanoparticules, des tests d’internalisation ont été effectués comme nous venons de le démontrer.
Par exemple, dans cette expérience représentative, trois sous-populations principales de leucocytes sanguins ont été clairement identifiées par diffusion vers l’avant et sur le côté après l’isolement des PBMC. De plus, après un traitement au dioxyde de silicium fz, les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes présentaient des taux d’internalisation des nanoparticules différents, comme l’indique leur intensité de fluorescence. Dans ces images, l’internalisation des nanoparticules est démontrée dans des monocytes primaires positifs pour CD 14 purifiés à partir de pbmc.
Ces nuages de points montrent des monocytes positifs pour CD 14 en présence de nanoparticules de dioxyde de silicium de Fitz. L’histogramme illustre la quantification des cellules positives en forme exprimée en intensité de fluorescence. Des expériences d’internalisation similaires ont été réalisées avec des monocytes TP 1 traités avec des concentrations croissantes de nanoparticules de dioxyde de silicium de Fitz avec des cellules non traitées comme contrôle négatif.
Les diagrammes à points illustrent l’augmentation dose-dépendante de la diffusion latérale avec une diffusion vers l’avant inchangée dans la lignée cellulaire TP one après l’internalisation des nanoparticules. Les données de ces graphiques suggèrent que le traitement avec les nanoparticules de dioxyde de silicium de Fitz induit une internalisation dose-dépendante dans les monocytes mise en évidence par l’augmentation de la granularité intracellulaire pour mieux comprendre les interactions entre les cellules immunitaires et les nanoparticules, les microglies ont été cultivées pendant sept jours in vitro et incubées avec des nanoparticules pendant une heure. La microscopie à fluorescence a indiqué une culture mixte de cellules gliales primaires avec un grand nombre d’astrocytes non adhérents négatifs à la GFP et quelques cellules positives à la GFP.
Dans cette expérience représentative, trois sous-populations gliales ont pu être distinguées par cytométrie en flux avec un seul anticorps CD 11 B colorant CD 11 B, des astrocytes négatifs à la GFP négative et d’autres cellules gliales des cellules microgliales CD 11 B à GFP positive et une sous-population à CD 11 B positive à la GFP. Les deux dernières sous-populations sont capables d’internaliser des nanoparticules avec un déficit légèrement accru par la population positive à la GFP. L’internalisation des nanoparticules peut être vérifiée par microscopie confocale, comme le démontre cette image en utilisant des nanoparticules de dioxyde de silicium à dominante de bâtonnet.
Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les échantillons dans l’obscurité pour éviter le blanchiment des colorants fluorescents et de maintenir les échantillons à quatre degrés pendant l’incubation des anticorps. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la localisation intracellulaire des nanoparticules.
Aperçu
Cette étude porte sur l'interaction de nanoparticules fluorescentes avec des sous-populations de cellules immunitaires primaires à l'aide de la cytométrie en flux. La méthode permet de quantifier l'internalisation des nanoparticules dans diverses cellules immunitaires, offrant ainsi des informations sur leur comportement.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Nanotechnologie
- Cytométrie en flux
Contexte
- Les nanoparticules peuvent être utilisées pour étudier les interactions entre cellules immunitaires.
- La cytométrie en flux présente des avantages par rapport à la microscopie pour la quantification de la fluorescence.
- La compréhension de l'internalisation des nanoparticules peut guider les stratégies thérapeutiques.
- Différents types de cellules immunitaires peuvent présenter des réponses variables aux nanoparticules.
Objectif de l'étude
- Analyser l'interaction des nanoparticules avec les sous-populations de cellules immunitaires.
- Quantifier les taux d'internalisation des nanoparticules dans différents types cellulaires.
- Améliorer la compréhension des réponses immunitaires au traitement par nanoparticules.
Méthodes utilisées
- Des cellules immunitaires primaires ont été traitées avec des nanoparticules fluorescentes de dioxyde de silicium.
- Les cellules ont été marquées avec des anticorps spécifiques pour une analyse en cytométrie en flux.
- Les réglages de compensation ont été ajustés pour tenir compte de l'interférence des nanoparticules.
- Des tests d'internalisation ont été réalisés pour évaluer l'absorption des nanoparticules.
Résultats principaux
- Différentes populations de cellules immunitaires ont présenté des taux variables d'internalisation des nanoparticules.
- La cytométrie en flux a permis de distinguer efficacement les types cellulaires selon l'intensité de fluorescence.
- L'internalisation a été confirmée par des techniques complémentaires de microscopie.
- Les résultats ont révélé une relation dose-dépendante dans l'absorption des nanoparticules par les monocytes.
Conclusions
- L'étude démontre l'utilité de la cytométrie en flux pour analyser les interactions entre les nanoparticules et les cellules immunitaires.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la manière dont les nanoparticules peuvent influencer les réponses immunitaires.
- Des recherches ultérieures pourraient explorer les applications thérapeutiques des nanoparticules en immunologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une évaluation quantitative de l'internalisation des nanoparticules dans des sous-populations de cellules immunitaires primaires, soutenant ainsi la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans le développement de nanothérapeutiques. En fournissant des données d'absorption dépendantes de la dose et spécifiques aux types cellulaires, elle renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte et oriente les décisions de poursuite ou d'abandon pour les interventions basées sur les nanoparticules. L'approche répond à un défi majeur en phase de découverte : traduire les interactions nanoparticules-cellules en indicateurs exploitables et reproductibles pour la priorisation des portefeuilles de projets.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en quantifiant l'absorption de nanoparticules parmi les sous-ensembles immunitaires, précisant ainsi quelles populations cellulaires interagissent avec les nanovecteurs.
- Valeur opérationnelle : Permet une détection biologique des risques grâce à une mesure standardisée et reproductible de l'internalisation, basée sur l'intensité de fluorescence et les variations de la lumière latéralement diffusée.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en identifiant les types cellulaires présentant une affinité élevée ou faible pour les nanoparticules, orientant ainsi le choix des cibles pour les nanothérapies immunomodulatrices.
Développement de criblages et de tests
- Préparation du test : Prépare des systèmes de cellules immunitaires validés pour des criblages ultérieurs en établissant des profils de base d'interaction avec les nanoparticules.
- Résultats quantitatifs : Génère des mesures d'intensité de fluorescence et de diffusion latérale (SSC) permettant des lectures standardisées et comparables entre différentes conditions et points temporels.
- Réutilisation de la plateforme : Permet des protocoles de criblage évolutifs grâce à des stratégies constantes de sélection des populations cellulaires, de compensation et de marquage par anticorps, applicables à diverses formulations de nanoparticules.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : S'étend aux microglies primaires de souris mutantes, permettant des études sur les nanoparticules ciblant le SNC dans des modèles immunitaires pertinents pour la maladie.
- Continuité translationnelle : Relie les résultats de cytométrie en flux à la confirmation par microscopie confocale, renforçant l'interprétation mécanistique pour la validation préclinique.
- Progression ajustée au risque : Éclaire les décisions d'avancement en révélant des taux d'internalisation différentiels, comme des sous-populations de microglies positives pour la GFP montrant une absorption modifiée des nanoparticules.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage précoce de l'interaction avec la cible à l'évaluation mécanistique préclinique, en particulier pour les nanothérapies immunomodulatrices où les profils d'interaction avec les cellules immunitaires sont essentiels.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en associant l'exposition aux nanoparticules à des modifications mesurables de la granularité cellulaire et de la fluorescence, permettant de préciser les mécanismes d'activation ou de modulation des cellules immunitaires.
- Triage : Assure la préparation des tests grâce à des étapes standardisées d'isolement, de marquage et de compensation, garantissant une quantification reproductible des interactions nanoparticules-cellules.
- Analyse : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (intensité de fluorescence, décalages de la diffusion latérale) permettant de comparer l'internalisation entre différents types cellulaires, concentrations et points temporels.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la validation préclinique par une confirmation orthogonale au moyen de la microscopie confocale, en accord avec une dé-risquisation mécanistique axée sur des biomarqueurs.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une capacité réutilisable pour divers formats de nanoparticules (par exemple, FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) et modèles immunitaires (leucocytes sanguins humains, microglies murines), réduisant ainsi le développement redondant de méthodes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant des données quantitatives à résolution cellulaire sur l'internalisation des nanoparticules, améliorant ainsi la confiance dans les stratégies d'immunomodulation.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité grâce à des protocoles de compensation et des panels d'anticorps définis, minimisant les variations entre utilisateurs et sites.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en identifiant précocement les sous-ensembles immunitaires susceptibles d'interagir avec les nanoparticules, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée du développement de nanothérapeutiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en mettant en évidence les formulations de nanoparticules présentant des profils d'interaction avec les cellules immunitaires favorables ou indésirables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en compensation en cytométrie en flux, en particulier pour corriger les interférences induites par les nanoparticules sur la diffusion latérale lors de la correction du recouvrement spectral.
- Dépend de l'accès à des cytomètres en flux dotés de capacités de détection de la fluorescence et de la diffusion, ainsi que de panels d'anticorps pour l'identification des sous-populations cellulaires immunitaires.
- Exige une standardisation inter-équipes des stratégies de gating et des paramètres de compensation afin d'assurer une interprétation cohérente des données entre les groupes de recherche et précliniques.
- Requiert une adaptation lors de son application à différents systèmes modèles (par exemple, cellules adhérentes versus non adhérentes, cellules primaires humaines versus murines) afin de maintenir la fidélité du test.
- Limite pratique : les propriétés de fluorescence ou de diffusion des nanoparticules peuvent interférer avec certains fluorochromes, nécessitant une conception minutieuse du panel et une validation rigoureuse de la compensation, comme indiqué dans le protocole.
