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Article de méthode

Super-résolution d'imagerie de neurones vésicules à cœur dense

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DOI :

10.3791/51394

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2 juillet 2014

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1Department of Physics, Lewis & Clark College, 2Program in Biochemistry and Molecular Biology, Lewis & Clark College, 3Jungers Center for Neuroscience Research, Oregon Health & Science University, 4Department of Chemistry, Lewis & Clark College

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons comment mettre en œuvre photoactivée microscopie localisation (PALM) à base des études de vésicules dans fixes, des neurones en culture. Les éléments clés de notre protocole comprennent l'étiquetage des vésicules avec des chimères photoconvertible, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et de traitement des images brutes afin de produire une image de super-résolution.

Résumé

Détection de la fluorescence fournit la base pour de nombreuses techniques de microscopie largement utilisés et les progrès rapides utilisés dans des applications biologiques et médicales modernes. Points forts de fluorescence comprennent la sensibilité, la spécificité et la compatibilité avec l'imagerie en direct. Malheureusement, les formes classiques de la microscopie de fluorescence souffrent d'une faiblesse, une résolution limitée par la diffraction principal dans le plan de formation d'image, ce qui entrave les études de structures ayant des dimensions inférieures à ~ 250 nm. Récemment, cette limitation a été surmontée avec l'introduction de super-résolution des techniques de microscopie de fluorescence, comme la microscopie de localisation photoactivée (PALM). Contrairement à ses homologues conventionnels, PALM peut produire des images avec une résolution latérale de quelques dizaines de nanomètres. Il est donc maintenant possible d'utiliser la fluorescence, avec ses forces multiples, pour élucider un spectre d'attributs précédemment inaccessibles de la structure cellulaire et de l'organisation. _content "> Malheureusement, PALM n'est pas trivial à mettre en œuvre, et des stratégies efficaces doit souvent être adapté au type de système à l'étude. Dans cet article, nous montrons comment mettre en œuvre une seule couleur études de paume de structures vésiculaires dans des neurones cultivés fixes. PALM est idéalement adapté à l'étude de vésicules, qui ont des dimensions qui vont généralement de ~ 50-250 nm. étapes clés de notre approche comprennent l'étiquetage des neurones avec photoconvertible (du vert au rouge) chimères de fret de la vésicule, la collecte des images brutes faiblement échantillonnées avec un système de microscopie de super-résolution, et le traitement des images brutes afin de produire une image de PALM haute résolution. Nous démontrons également l'efficacité de notre approche en présentant des images exceptionnellement bien résolus de vésicules à cœur dense (VJC) dans les neurones d'hippocampe en culture, qui réfute l'hypothèse que le trafic extrasynaptique de VJCs est médiée principalement par les pôles de DCV.

Introduction

Un certain nombre de processus cellulaires dépendent de trafic précis et efficace des vésicules médiée par des biomolécules sous-cellulaires à des destinations spécifiques. Un exemple frappant est l'assemblage synaptique, qui est précédé par une longue-distance, la livraison des vésicules synaptiques à médiation des constituants à partir de sites de la biogenèse du soma neuronal de sites pré-et post-synaptiques potentiellement distales 1.

La microscopie à fluorescence est une méthode puissante et populaire d'étudier le trafic vésiculaire. Points forts de la technique sont sa sensibilité, la spécificité, et la compatibilité avec l'imagerie en direct 2. Malheureusement, jusqu'à relativement récemment, la technique a souffert d'une faiblesse majeure, la résolution limitée par la diffraction 2, ce qui entrave les études de structures avec des dimensions inférieures à ~ 250 nm. Récemment, la résolution latérale en microscopie à fluorescence a dépassé la barrière de diffraction avec l'introduction de mi de fluorescence super-résolutiontechniques croscopy, tels que PALM 3. La résolution latérale de PALM, des dizaines de nanomètres, est idéalement adapté à l'étude de vésicules, qui ont des dimensions qui vont généralement de ~ 50-250 nm 4. Il est donc maintenant possible d'utiliser la fluorescence, avec ses forces multiples, pour élucider un spectre d'attributs précédemment inaccessibles de vésicules, y compris certains aspects de leur trafic vers les sites sous-cellulaires spécifiques.

PALM n'est pas trivial à mettre en œuvre, et des stratégies efficaces doit souvent être adapté au type de système à l'étude. Nous décrivons ici comment mettre en œuvre des études paume de structures vésiculaires, et nous démontrons l'efficacité de notre approche pour le cas de VJCs dans les neurones de l'hippocampe. En particulier, nous utilisons PALM à vérifier l'hypothèse que le trafic de VJCs de synapses dans les neurones de l'hippocampe est médiée par les pôles de DCV 5-8.

trafic de cluster médiation de vésicules de synapses dans le développement de neurons est une possibilité intéressante, car elle peut faciliter la stabilisation synaptique rapide et assemblage 9,10. Les partisans de la traite cluster de VJCs citent la taille apparente de puncta fluorescent extrasynaptique hébergement fret DCV exogène comme preuve à l'appui regroupement 6. Toutefois, ces points lacrymaux apparaissent dans les images générées en utilisant des techniques de microscopie de fluorescence diffraction limitée, qui ne sont pas adaptés à des effets de taille marquantes émanant diffraction de ceux découlant de clustering.

Pour résoudre ce problème, nous avons recueilli de fluorescence à champ large classique et images paume de neurones de l'hippocampe exprimant des chimères ciblées à VJCs. L'analyse de ces images a révélé que> 92% de présumés groupes de DCV extrasynaptiques en images classiques sont résolus 80 nm (DCV taille individuelle) 11 points lacrymaux en images PALM. Ainsi, ces données invalident largement l'hypothèse de regroupement tel qu'il est appliqué à l'élaboration VJCs hippocaneurones MPAL.

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Protocole

1. Préparation de l'échantillon

  1. Préparer l'ADN codant pour une chimère photoconvertible ou photoactivable de VJCs ciblée, en utilisant des techniques de biologie moléculaire standard.
    Remarque: Une possibilité est l'ADN codant pour un activateur tissulaire du plasminogène-Dendra2 chimère (tPA-Dendra2). Dendra2 est une protéine photoconvertible qui passe du vert au rouge émission lors de l'exposition à la lumière ultraviolette 12.
  2. Culture neurones de l'hippocampe sur la haute performance # 1.5 couvercle glisse pour ~ 5-10 jours, à la suite de protocoles standard 13.
  3. Transfecter le développement des neurones d'hippocampe en utilisant un réactif lipidique cationique.
    Remarque: L'infection virale médiée est plus efficace pour les neurones matures. Cette approche alternative a été décrite en détail par ailleurs 14.
    1. Préparer un tube de 1,5 ml contenant ~ 1 pg d'ADN et 250 microlitres de milieu minimum essentiel (MEM) et un second tube de 1,5 ml contenant 4 pi de réactif lipidique cationique et 250 ulMEM.
    2. Incuber les solutions pendant 5 min.
    3. On combine les deux solutions et laisser incuber le mélange résultant pendant 30 min supplémentaires.
    4. Au cours de l'incubation, préparer un plat contenant plusieurs ml de milieu de culture chauffé à 37 ° C.
    5. Transférer doucement lamelles contenant les neurones dans le plat contenant un milieu chaud et ajouter le mélange de transfection.
    6. Inclinez le plat doucement puis le placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 90 min.
    7. Neurones revenir à leur «plat de la maison" et attendre ~ 12-18 heures.
  4. Fixer les cellules pendant 45 min dans du paraformaldéhyde 4% / 4% de saccharose dans du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4) chauffé à 37 ° C.
    Remarque: Dans les expériences PALM, il est important d'obtenir une bonne conservation de l'ultrastructure et protocoles formaldéhyde de fixation standards utilisés pour la coloration par immunofluorescence sont généralement pas suffisant 15. Une raison importante pour mauvaise conservation structurelle est insuffisante ftemps de ixation parce formaldéhyde fixation implique la formation de produit d'addition et la réticulation de protéines, et le dernier procédé est assez lent 16. A 45 min de fixation permet d'atténuer ce problème sans perte induite de overfixation détectable de la fluorescence.
  5. couverture de lavage glisse ~ 10x avec filtre PBS.
    Note: Ceci réduit les contaminants fluorescents. échantillons d'image relativement rapidement après la fixation. Dans les cellules, des magasins intermédiaires à 4 ° C dans PBS filtrée dans un récipient étanche à la lumière.
  6. Lamelles de montage contenant les neurones dans une chambre en filtrée PBS.
    Note: L'échantillon doit être placé dans un milieu aqueux, comme du PBS, avec l'indice de réfraction plus faible que celle du verre, à mettre en oeuvre une fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) à base d'illumination. Éclairage à base FRBR-est très utile car seuls couverture fluorophores glissement proximale sont excités, et il ya une baisse importante associée à la fluorescence de fond 17.

Image 2. Acquisition

  1. Allumez le système d'imagerie super-résolution.
    1. Allumer la lampe à arc.
    2. Retournez le "système / PC" et interrupteurs «composants» (sur l'interrupteur de puissance) sur «on».
    3. Allumez l'ordinateur (après la station comprimé / d'accueil de contrôle de microscope vient sur).
      Note: La station d'accueil peut être utilisé pour contrôler et surveiller de nombreux attributs de l'optique et chemin de lumière, notamment le choix de l'objectif et de concentration.
    4. Double-cliquez sur l'icône du logiciel et choisissez l'option "système de démarrage" dans la boîte de dialogue de connexion.
  2. Examiner l'échantillon.
    1. Ouvrez le capot avant et les panneaux d'accès haut sur l'armoire de sécurité laser.
    2. Inclinez le bras de lumière transmise pour accéder à la scène et objectifs.
    3. Mettez l'huile sur le Plan-Apochromat 100X ouverture numérique alpha / NA = 1,46 (FRBR) objectif.
      Remarque: Un objectif 63X haute NA peut être utilisé en lieu et place de la 100X.
    4. Monter l'échantillon sur la scène, et augmenter èmeobjectif de e vers l'échantillon.
    5. Surveiller la position de la lentille en utilisant la fonction XYZ de la station d'accueil. Arrêtez-vous lorsque la lentille est dans le stade de mise au point (par exemple, z ~ 2,50 mm).
    6. Fermer complètement les panneaux d'accès.
      Remarque: Pour engager la sécurité laser.
    7. Affiner la mise au point avec les oculaires et des boutons dans l'onglet localiser.
      Remarque: L'onglet localiser donne accès à des boutons qui produisent un éclairage sur la base de la lampe à arc et facilite l'observation directe de l'échantillon avec les oculaires. De même, l'onglet d'acquisition donne accès à des outils qui produisent un éclairage au laser et facilite la capture d'image par la caméra.
      1. Allez à l'onglet localiser, choisissez "Trans On».
      2. Cliquez sur le symbole d'extension oculaire.
        Note: Ceci nous amène à un schéma de la trajectoire de la lumière. Attributs de la trajectoire de la lumière peuvent être modifiés en cliquant gauche icônes appropriées dans le schéma ou en utilisant l'écran tactile de la station d'accueil. Par exemple, un filtreadapté pour les émissions de Dendra2 peut être choisie en utilisant l'icône réflecteur revolver.
      3. Regardez dans les oculaires, et d'amener les cellules au point en utilisant la station d'accueil comme un guide.
        Note: L'échantillon sera très peu peuplée avec des cellules fluorescentes parce que les neurones de l'hippocampe sont difficiles à transfecter, et il peut donc être un peu difficile de se concentrer en utilisant un éclairage réfléchi. Si tel est le cas, utiliser l'éclairage par transmission et z lecture de la station d'accueil en tant que guide.
      4. Basculer la lumière "Off" après mise au point.
  3. Identifier une cellule qui est assez lumineux, présente fluorescence ponctuée, et a une morphologie classique qui est indicatif d'une bonne santé.
    1. Choisissez la lumière réfléchie et la filtre approprié pour la visualisation émission verte de Dendra2.
    2. Balayez la lamelle de cellules exprimant des chimères Dendra2 utilisant la lumière faible d'excitation d'intensité.
  4. Passez à l'acquisition onglet.
    1. Utilisez le «gestionnaire de l'expérience" pour charger une configuration d'acquisition PALM qui est bien conçu ou modifié facilement.
      Remarque: Si aucune expérience existe, concevoir une configuration expérimentale de départ en utilisant les paramètres suivants comme guide: curseurs de puissance de laser: 405 nm (~ 0,01% pour un laser de 50 mW); 488 nm (~ 3% pour un laser de 100 mW); 561 nm (~ 40%, pour un laser de 100 mW); Temps d'exposition: ~ 50 ms; le gain de la caméra: ~ 200; Acquisition multidimensionnelle: séries chronologiques (cycles = 30 000, intervalle = 0); Tracks: 488 nm avec épi-illumination, et 561 nm avec un éclairage à base de la FRBR (voir l'étape 2.5.1); Objectif: 100X (NA = 1,46); angle de la FRBR curseur: angle d'incidence ~ 67-72 °; La taille du pixel: 100 nm; Champ de vision: la FRBR (les choix alternatifs donnent aux plus hautes intensités laser et sont utilisés pour des fluorophores qui sont plus difficiles à blanchir).
    2. Cliquez sur "oui" quand un menu pop-up apparaît avec une requête sur le passage sur les lasers.
  5. Apportez l'imagede la cellule en lumière au niveau du plan de la caméra.
    1. Choisissez l'épi-illumination piste de laser de 488 nm.
      Remarque: les pistes sont des configurations de faisceaux utilisés lors de l'imagerie. Ici, les noms de piste sont déterminées par la longueur d'onde d'excitation qui produit l'émission qui est transmis à l'appareil photo. Par exemple, la piste nm 561 utilise à la fois le 405 et 561 nm lignes laser, mais le cube de filtre ne laisse passer que les émissions de photoconverted Dendra2 excité par 561 nm lumière de la caméra.
    2. Concentrer l'image de la cellule de l'appareil photo en utilisant le bouton d'acquisition "continu".
  6. Recueillir une image à grand champ conventionnel.
    1. Utilisez le bouton "Snap".
    2. Enregistrez l'image en allant dans le menu "Fichier" et choisir "Enregistrer / Enregistrer sous."
  7. Mettre en place l'éclairage en fonction de la FRBR.
    1. Choisissez la piste 488 et passer à "la FRBR" en utilisant le bouton PEV / de la FRBR.
    2. Choisissez acquisition "continu".
    3. Réglez téclairage curseur il basé FRBR.
      Remarque: la FRBR est atteint quand il ya un assombrissement soudain de fond et l'échantillon peut être porté dans un plan 18. Si de nouvelles fonctionnalités apparaissent via concentrant vers le haut dans l'échantillon, l'angle d'incidence est trop faible parce que dans la FRBR il ya seulement un plan de mise au point.
    4. Vérifiez l'angle de la FRBR en utilisant la piste 561 avec le laser à 405 nm "off".
    5. Tournez le laser à 405 nm de retour "sur" avant de lancer une expérience PALM.
  8. Recueillir des données PALM.
    1. Appuyez sur "commencer l'expérience."
      Remarque: Si vous le souhaitez, ouvrez l'onglet "options de traitement en ligne" et cochez la case "PALM ligne de traitement" et "Fit Gauss2D" (avant l'expérience) pour contrôler l'image de PALM reconstruit lors de la collecte de données brutes. Ceci facilitera l'évaluation de la qualité des données, et donc la valeur de la poursuite du processus de collecte de données relativement beaucoup de temps.
    2. Visuellementsurveiller photoconversion.
    3. Augmentez l'intensité du laser 405 nm (photoconverting) quand Dendra2 photoconversion diminue (généralement après l'acquisition de ~ 10 000 images brutes).
    4. Poursuivre l'expérience si photoconversion augmente. Sinon, arrêter l'expérience (sans perte de données) en appuyant sur le bouton "stop" courant de l'étape.
    5. Enregistrez les images lorsque la collecte des données est terminée (après environ 15 min).

3. Traitement de l'image, l'affichage et l'analyse

  1. En l'absence de traitement des images brutes, processus en ligne qui ont été enregistrés sur le disque.
    1. Cliquez sur l'onglet de traitement, ouvrez l'onglet de la méthode, et sélectionnez "PALM".
    2. Choisissez "PALM" nouveau des quatre sous-options.
    3. Allez dans le menu fichier, ouvrir et afficher le fichier d'intérêt, et appuyez sur "Select".
    4. Cliquez sur "appliquer".
      Note: Ceci lancera pic / fluorophore constatation et le pic localisation avec optimisme par défautons. Si nécessaire, les pics peuvent également être regroupés en utilisant l'onglet "PAL-groupe". Regroupement affecte pics qui apparaissent dans plusieurs trames consécutives à une seule molécule si les coordonnées de pointe sont suffisamment similaires. En outre, les données peuvent être corrigées pour la dérive de l'échantillon à l'aide de l'option d'alignement de dérive basée sur un modèle de logiciel.
  2. Filtrer les composants mal localisés et mal échantillonnées dans les données de pic-localisée.
    1. Jeter fluorophores avec une précision de localisation, σ,> 35 nm en utilisant l'outil "PAL-Filter".
    2. Jeter fluorophores dans les zones où la distance moyenne entre les pics, d, est trop grand pour résoudre des vésicules de diamètre, D.
      1. Extrait de la précision moyenne de localisation, σ, de l'histogramme de précision de la localisation.
      2. Calculer une valeur maximale acceptable pour d basé sur σ, et la criteron Shannon-Nyquist 19, incarnée dans la résolution approximation 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
      3. Régler le seuil de l'outil "Supprimer les valeurs aberrantes PALM" pour supprimer les pics entourés de moins de nD 2 / (4d 2) voisins dans un cercle de rayon D / 2.
    3. Convertir les données de PALM transformé en une image de PALM en utilisant l'outil "PAL-rendu"; Voir Figure 1.
    4. Quantifier les tailles et les séparations en choisissant la fonction "Profil".
      1. Vérifiez la ligne associée et options de table, et tracer une ligne le long de la direction souhaitée dans l'image.
      2. Quantifier diamètres par la détermination des largeurs à mi-intensité maximale.
      3. Quantifier les séparations par détermination des espacements de profils d'intensité de crête à crête.

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Résultats

La figure 1 montre un produit de l'imagerie et le traitement de fin. Dans cette image de PALM, coordonnées latérales de fluorophores localisées sont présentés en utilisant le mode d'affichage centre de gravité, et l'image de super-résolution de la DCV associé est montré à l'aide du mode d'affichage de Gauss.

La figure 2A montre grand champ analogue et images PALM du soma et processus proximaux de huit jours en neurone hippocampiq...

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Discussion

PALM et des techniques de microscopie de fluorescence super-résolution connexes ont récemment émergé comme un complément précieux aux formes les mieux établies de la microscopie optique et la microscopie électronique (EM) 22-24. Attributs positifs de PALM comprennent la préparation de l'échantillon relativement simple et l'échantillon minimal perturbation. En principe, PALM peut également être utilisé pour étudier des cellules vivantes. Probablement le principal attribut négatif de PALM est l'acqu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde 2 R15 GM061539-02 (à BAS), 2 R15 NS40425-03 (à JEL), MH 66179 (Dr Gary banquier de l'Oregon Health & Science University / OHSU), et P30 NS061800 (Dr Sue Aicher de OHSU). Nous remercions Barbara Smoody pour un large soutien à la culture de neurones de l'hippocampe, et les Drs. Brian Long et James Abney pour une lecture critique de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Zeiss PALMCarl Zeiss, Inc.Elyra PS.1avec le logiciel Zeiss Efficient Navigation (ZEN) et le filtre de fluorescence Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633  ;
Lipofectamine 2000 Réactif de transfectionLife Technologies11668-019
Minimum Essential Medium LifeTechnologies11095-080
Phosphate Buffered SalineLife Technologies10010049
ParaformaldehydeMicroscopie électroniqueSciences 19208
SaccharoseSigma-AldrichS-8501
Lamelles de protection en verre de croissance 18 mm 1.5DFisher ScientificNC0059095

Références

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