Suivi d'activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

Un événement crucial dans la défense antivirale de l'hôte est la détection rapide de l'agent pathogène par les soi-disant récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) ^1,2. La détection intracellulaire de l'infection par le virus à ARN est dépendante de deux hélicases d'ARN cytoplasmique, RIG-I (gène inductible par l'acide rétinoïque I) et MDA5 (différenciation des mélanomes protéine associée 5) ^3-5. RIG-I est composée de deux domaines N-terminaux recrutement de caspase (CARDS), un domaine ARN hélicase de type DECH-caisson central, et un domaine C-terminal (CTD) ^4,6. Considérant que le CTD et le domaine hélicase sont nécessaires pour la reconnaissance de la non-autonomes (ARN viraux), les cartes médiation signalisation en aval conduisant à l'établissement d'un statut d'hôte antiviral.

Si RIG-I est à l'état silencieux, c'est à dire en l'absence d'un ligand d'ARN spécifique, la deuxième carte interagit avec le domaine hélicase central et maintient RIG-I dans une conformation d'auto-inhibition de ^7-11. RIG-I se lie à court doublebrin (ds) ARN portant un 5'-triphosphate (5'PPP), à long ARN double brin et l'ARN polyU / UC-riche, structures de signature classiques qui sont présents sur les génomes de nombreux virus à ARN ^{de 12-16.} Deux caractéristiques majeures de RIG-I activation sont un commutateur à une conformation fermée ^6,17 et l'homo-oligomérisation ^6,18,19. L'interrupteur conformationnel améliore liaison à l'ARN, expose les cartes pour la signalisation en aval, et reconstitue un site ATPase actif ^8,9,11,20. La formation de complexes oligomères RIG-I conduit à accroître le recrutement de molécules d'adaptateurs en aval de la signalisation pour former une plate-forme pour la transduction du signal ¹¹ antiviral. La chaîne de signalisation RIG-I-régulé éventuellement active le facteur de transcription IRF-3, pour la régulation de l'interféron (IFN-alpha/beta) gènes et par conséquent l'expression génique de gènes stimulés par l'interféron (ISG) pour une réponse antivirale complète ^21,22 . L'un des meilleurs ISGs caractérisé est le protei ARN activén kinase (PKR) ^23. PKR appartient à la famille du facteur d'initiation de traduction eucaryote alpha 2 (eIF2α) kinases et est composé d'un domaine de liaison à N-terminal de l'ARN double brin et un domaine de kinase C-terminal. Le domaine de kinase constitue l'interface de dimérisation cruciale pour l'activation de PKR et réalise les fonctions catalytiques de la protéine. Reliure de PKR à l'ARN double brin viral conduit à son changement de conformation permettant la dimérisation et l'auto-phosphorylation sur Thr 446 entre autres résidus. PKR produit ensuite la phosphorylation de eIF2α, bloquant ainsi la traduction des ARNm viral ^23-27.

Les deux RIG-I et PKR objet d'importants réaménagements structurels, former des complexes oligomères et sont modifications post-traductionnelles par phosphorylation / déphosphorylation et ubiquitination ^{10,11,19,23,24,26-29.} Pour une meilleure compréhension de laquelle les structures d'ARN viral activent RIG-I et PKR (et à quel stade antagonistes virales pourraient binterférant e), il est important de déterminer avec précision l'état d'activation. Pour les deux PRRs il a été précédemment décrit que l'activation conduit à l'apparition de fragments de protéine résistant à la trypsine ^6,17,30 et oligomères d'ordre supérieur ^6,18,19. Toutefois, compte tenu de la richesse de la littérature sur les facteurs clés de la réponse antivirale de l'hôte ^1,2,24, l'application de méthodes directes semble relativement rare. Dans l'espoir de stimuler l'utilisation plus large, nous fournissons des protocoles pratiques et sensibles pour analyser robuste les états d'activation de RIG-I et PKR. Le compétente A549 de lignée cellulaire humaine IFN est infecté par un activateur établi de RIG-I et de PKR, le virus de la fièvre de la Vallée du Rift atténué clone mutant 13 (Cl 13) ^31,32. Après une procédure de lyse simple, les extraits de cellules infectées sont testés par digestion à la trypsine / ouest analyse limitée blot pour évaluer commutation de conformation, et par le bleu natif gel de polyacrylamide (PAGE) / analys Western blotest de mesurer la formation d'oligomères.

1. L'ensemencement des cellules A549 pour infection

1. Cultiver un flacon T75 de cellules A549 à 37 ° C et 5% _de CO2 dans du milieu de culture cellulaire (DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 526,6 mg / l de L-glutamine, 50.000 U / l de pénicilline et 50 mg / l de streptomycine).
2. Avant de commencer à récolter les cellules, réchauffer le milieu de culture cellulaire, du PBS et 0,05% de trypsine-EDTA dans un bain-marie chauffé à 37 ° C.
3. Retirez le support et laver les cellules avec 10 ml de PBS. Retirer à nouveau la PBS.
4. Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA et répartir également dans le ballon. Transférer le ballon dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
5. Lorsque toutes les cellules sont décollées, ajouter 7 ml de milieu de culture cellulaire, de remettre en suspension les cellules, et transférer la suspension de cellules dans un tube Falcon de 15 ml.
6. Centrifuger les cellules à 800 xg pendant 5 min à température ambiante, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu de culture cellulaire frais.
7. Compter les cellules avec une chambre de comptage.
8. Ajouter 2,5 x 10 ⁶ cellules dans 5 ml de milieu de culture cellulaire dans deux flacons T25 chacune. Incuber pendant 16 heures à 37 ° C et 5% de CO _2. Un flacon sert pour le contrôle maquette et une pour infection Cl 13.

2. L'infection par le virus de la Rift Valley Fever Clone 13 (Cl 13)

1. REMARQUE: Cl 13 est un mutant du virus atténué qui en Allemagne peut être manipulé dans BSL-2 conditions. S'il vous plaît se référer aux directives nationales pertinentes. D'autres inducteurs d'IFN typiques seraient virus Sendai (souche Cantell) ou le virus de la maladie de Newcastle.
2. , Un milieu exempt de sérum pré-PBS chaud, et un milieu de culture cellulaire contenant 5% de FCS.
3. Préparer 1,25 x 10 ⁷ UFP / ml de Cl 13 dans du milieu sans sérum pour infecter 2,5 x 10 ⁶ cellules A549 avec une multiplicité d'infection (MOI) de 5. Préparer une quantité légèrement (environ 10%) plus grand que nécessaire pour tenir compte de les erreurs de pipetage.
4. Laver les cellules avec du PBS comme décrit sous 1.3.
5. Ajouter 1 ml de la dilution 13 Cl oude milieu sans sérum (témoin non infecté, mock) aux cellules et incuber pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO _2. Déplacer le ballon soigneusement toutes les 15 min pour assurer une distribution égale de Cl et 13 dilution du milieu sans sérum, respectivement.
6. Après 1 h d'infection, les inoculums supprimer, ajouter 5 ml de milieu préchauffé de culture de cellules avec 5% de FCS, et incuber pendant 5 heures à 37 ° C et 5% de CO _2.

3. Préparation des lysats cellulaires

1. Préparer du PBS / 0,5% de Triton X-100 à 4 ° C. Ne pas ajouter des inhibiteurs de protease à serine.
2. Laver les cellules avec du PBS froid et ajouter 10 ml de PBS frais.
3. Grattez les cellules off, transférer la suspension de cellules dans un tube de faucon, et centrifuger à 800 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 ul de PBS / 0,5% de Triton X-100. Transférer le lysat dans un nouveau tube de 1,5 ml et incuber pendant au moins 10 min à 4 ° C.
5. Centrifuger le lysat à 10h000 x g pendant 10 min à 4 ° C et à transférer le lysat cellulaire clarifié (surnageant) dans un tube frais.
6. Déterminer la concentration en protéine par dosage de Bradford comme décrit par ailleurs ^33.
7. Conserver à -20 ° C ou procéder à la digestion de la trypsine (4.1) ou PAGE native (5.1).

4. Détermination des changements conformationnels de Pattern Recognition Receptors

1. Traitement TPCK-trypsine de Lysats de cellules
   1. Diluer L-1-tosylamido-2-phényléthyl-chlorométhyl cétone traitée (TPCK) de la trypsine dans du PBS à une concentration de travail finale de 2 ug / ul.
   2. Régler dans deux nouveaux tubes une concentration finale en protéine de 25 ug de chaque lysat de protéine (mock ou Cl. 13) dans un volume final de 9 pl avec du PBS. Par conséquent, il devrait être de quatre tubes avec 25 ng de chaque lysat, deux fois simulés et deux fois 13 Cl infection. Un jeu comme le contrôle d'entrée (non traité) et un ensemble de traitement avec TPCK-trypsine.
   3. Ajouter 1 pl de PBS (non traité)ou 1 ul de 2 ug / ul TPCK-trypsine (concentration finale: 0,2 pg / pl) pour les lysats cellulaires et les réactions mélanger par pipetage. NE PAS congeler et décongeler aliquotes de TPCK-trypsine, car il risque de compromettre l'efficacité de la digestion.
   4. Incuber les lysats à 37 ° C pendant 25 min. Arrêter la réaction en ajoutant de 5x tampon de dénaturation de l'échantillon (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% glycerol, 25% β-mercaptoéthanol, 0,5% de bleu de bromophénol) et en faisant bouillir pendant 5 min à 95 ° C. Il est important de ne pas prolonger le temps d'incubation de la trypsine. Dans le cas où aucun des fragments d'résistante aux protéases sont détectables, au moment de la digestion par la trypsine doit être raccourcie.
   5. Après l'ébullition, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C.
2. SDS sur gel de polyacrylamide (PAGE) et Western Blot
   1. Charger les échantillons sur un dodécylsulfate de sodium (SDS) gel de polyacrylamide contenant un empilement de 5% sur un gel de résolution à 12%. Séparer les protéines à 25 mA par gel jusqu'àle bleu de bromophénol s'épuise.
   2. Activer un polyfluorure de vinylidène (PVDF) pendant 30 secondes avec du methanol et le mettre dans un tampon de transfert (Tris 48 mM, glycine 39 mM, 1,3 mM de SDS, 20% de methanol).
   3. Préparer le blot avec un système de blotting semi-sec et de permettre le transfert des protéines à 10 V pendant 1 h. Prenez la membrane, rincez brièvement avec de l'eau, et laisser sécher.
   4. Réactiver la membrane en transférant peu en méthanol. Laver pendant 5 min avec du TBS. Bloc avec 10% de lait écrémé dans du TBS pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° CO / N. Laver 3x de membrane pendant 5 min chacun avec le SCT.
   5. Préparation de l'anticorps en tant que la dilution recommandée dans le tableau 1 et incuber la membrane pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° CO / N.
   6. Laver 3x de membrane pendant 10 minutes chacune avec TBS-T. Ajouter l'anticorps secondaire approprié couplé à la peroxydase de raifort à une dilution de 1:20,000 dans 1% de lait écrémé dans du TBS. Incuber 45 minutes à température ambiante.
   7. Laver 3x de membrane pendant 10 minutes chacune avec TBS-T, et oun délai supplémentaire ne SCT.
   8. Pour la détection du signal utiliser un kit de chimioluminescence commercial et un système d'imagerie numérique de gel.
3. Coloration au bleu de Coomassie G-250
   1. Effectuer SDS-PAGE comme décrit au point 4.2.1. Charger les échantillons sur un gel de polyacrylamide SDS et courent le gel à 25 mA par gel jusqu'à bleu de bromophénol s'épuise.
   2. Effectuer Coomassie coloration bleu G-250 à TA. Faire toutes les incubations sous agitation constante.
   3. Transférer le gel dans la solution de fixation contenant 40% de méthanol et d'acide acétique à 10% pendant 30 min.
   4. Échanger le tampon de la solution de décoloration (25% d'éthanol et d'acide acétique à 8%) et incuber pendant 5 min.
   5. Colorer le gel avec 0,2% de bleu de Coomassie Brillant G-250 dans 40% de methanol et d'acide acétique à 10% pendant 1 heure.
   6. Décolorer le gel avec la solution de décoloration et échanger le tampon après 10 min, 30 min et 60 min.
   7. Stocker le gel à 25% d'éthanol, de l'acide acétique à 8%, et de 4% de glycerol à 4 ° C. Effectuez l'imagerie et l'analyse comme décrit sous 4.2.8.

5. Analyse des oligomères Unis d'Pattern Recognition Receptors

1. PAGE natif
   1. Préparer 50 pg de lysat de cellules dans un volume final de 10 pl avec du PBS et ajouter 5 x tampon native de l'échantillon (250 mM Tris-HCl pH 6,8, du désoxycholate de sodium à 1%, 50% de glycerol, 0,5% bleu de bromophénol) à une concentration finale de 1x.
   2. Charger les échantillons immédiatement sur un gel de polyacrylamide natif avec 5% d'empilage et de 8% en gel de résolution. Tout retard entraînera une perte de complexes indigènes ^34.
   3. Exécuter le gel à 20 mA par gel à 4 ° C avec 50 mM de Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM de glycine comme anode et comme 50 mM de Tris pH 8,3, 384 mM glycine, le désoxycholate de sodium à 1% comme tampon de cathode. Après 1,5-2 h (bande bleu de bromophénol a quitté le gel d'environ 45 min plus tôt) l'électrophorèse est terminée.
2. Western Blot
   1. Activer une polyvinylidene fluorure (PVDF) pendant 30 secondes avec du méthanol et mettre en mémoire tampon Towbin (Tris 25 mM, glycine 192 mM, 0,1% de SDS, 20% de methanol).
   2. Monter une chambre de transfert humide selon les instructions du fabricant et remplir le réservoir avec du tampon Towin.
   3. Effectuer le blot avec 250 mA pendant 1,5 h à 4 ° C.
   4. Lorsque buvard est terminé, procédez comme décrit à partir de 4.2.3.

La reconnaissance d'un agoniste virale par RIG-I ou PKR déclenche commutation conformationnelle 6,17,30 et oligomérisation 6,18,27. Nous avons mesuré ces deux marqueurs d'activation par digestion de protéase native limitée et électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), respectivement.

Les cellules A549 humaines ont été infectées avec le virus de la fièvre du Rift Valley clone 13 (Cl 13), qui est caractérisée par une mutation de l'antagoniste de l'IFN NSs 35,36. En raison de l'absence de SN fonctionnelle, Clone 13 induit fortement RIG-I et PKR, conduisant à l'établissement d'un état ​​antiviral dans les cellules robuste 12,31,32,37.

Digestion par la trypsine de maquettes infectés lysats cellulaires entraîne une dégradation rapide de RIG-I, tandis que Cl 13 infection conduit à la génération d'un fragment de 30 kDa résistant RIG-I Figure 1A. Aussi PKR présente une résistance partielle à digestion par la trypsine dans les échantillons infectés, qui coïncide avec sa phosphorylation Figure 1A. Pour surveiller l'efficacité et la spécificité de digestion par la trypsine, gels ont été colorés avec du bleu de Coomassie G-250. Échantillons non traités montrent des quantités égales de protéines chargées figure 1B. Soumettre 13 lysats de cellules simulées et Cl à la digestion de la trypsine conduit à une diminution comparable des montants globaux de protéines. Cela démontre que le traitement à la trypsine a la même efficacité pour les échantillons 13-infectées simulées et Cl.

La formation de complexes oligomères a été testée par PAGE native. Dans les cellules non infectées, seuls monomères de RIG-I et de la PKR ont été détectés Figure 2. Comme contrôle supplémentaire, nous avons inclus le facteur de transcription IRF-3, qui est présent sous forme de monomère, mais connu de dimériser lors de l'activation par l'intermédiaire par exemple, RIG-I 38. Cl 13 infection entraîne une forte accumulation de complexes oligomères RIG-I sous forme d'un frottis et de la PKR et IRF-3 dimères / oligomères comme une bande de protéine définie.

class = "jove_content"> Ces résultats démontrent que la digestion de la trypsine limité et PAGE natif sont des outils utiles pour surveiller les changements de conformation et la formation d'oligomères de RIG-I et PKR lors de l'infection.

Figure 1. Commutateur conformationnelle de RIG-I et de PKR. Cellules A549 ont été simulé infectées ou infectées par Cl 13 à une MOI de 5. Après 5 heures, les cellules ont été lysées dans du PBS additionné de 0,5% de Triton X-100 et dégagé des lysats cellulaires étaient soit elle n'est pas traitée ou traitée à la trypsine. Les échantillons ont été soumis à une SDS-PAGE suivi d'un Western blot (A) ou une coloration au bleu de Coomassie (B). Les transferts ont été colorées contre RIG-I, PKR, PKR phosphorylée (Thr 446) et contre la FVR nucléoprotéine (RVFV N) et la bêta-actine comme l'infection et de contrôle de chargement, respectivement._blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Oligomérisation de RIG-I, la PKR, et IRF-3. Lysats cellulaires de lysats de cellules 13 infectées par des simulations et Cl ont été soumis à une PAGE native suivie par une analyse Western blot. La coloration a été réalisée avec des anticorps contre RIG-I, PKR, IRF-3, et de la bêta-actine comme contrôle de charge. Oligomères PKR représentent très probablement dimères 27. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.