Abstract
La hemorragia intracerebral (ICH) es una forma común de enfermedad cerebrovascular y se asocia con morbilidad y mortalidad significativas. La falta de tratamiento y el fracaso efectivo de grandes ensayos clínicos dirigidos a la hemostasia y la eliminación de coágulos demostrar la necesidad de una mayor investigación mecanismo impulsado de ICH. Esta investigación se puede realizar a través del marco establecido por los modelos preclínicos. Dos modelos murinos en uso popular incluyen (ganglios basales) inyección intraestriatal de sangre entera autóloga o colagenasa clostridial. Dado que, cada modelo representa claramente diferentes características fisiopatológicas relacionadas con la ICH, el uso de un modelo en particular se puede seleccionar sobre la base de qué aspecto de la enfermedad es a ser estudiado. Por ejemplo, la inyección de sangre autóloga representa con mayor precisión la respuesta del cerebro a la presencia de sangre intraparenquimatosa, y puede reproducir más de cerca posible hemorragia lobar. Inyección de colagenasa clostridial representa con mayor precisión las sruptura de los vasos centro comercial y hematoma evolución característico de hemorragias profundas. Por lo tanto, cada uno de los resultados del modelo en diferente formación de hematomas, neuroinflammatory respuesta, el desarrollo de edema cerebral, y los resultados neuroconductuales. La robustez de una intervención terapéutica pretendida puede ser mejor evaluada usando ambos modelos. En este protocolo, la inducción de ICH con modelos de demostración, post-operatorio inmediato de la lesión, y las técnicas de atención postoperatoria temprana se demuestran. Ambos modelos resultan en lesiones reproducibles, volúmenes hematoma, y déficits neuroconductuales. Debido a la heterogeneidad de ICH humana, se necesitan varios modelos preclínicos para explorar a fondo los mecanismos fisiopatológicos y probar estrategias terapéuticas potenciales.
Introduction
La hemorragia intracerebral (HIC) es una forma relativamente común de enfermedad cerebrovascular con aproximadamente el 40-50% de los pacientes afectados de morir dentro de 30 días 1. Desafortunadamente, pocas mejoras se han hecho en la tasa de mortalidad en los últimos 20 años 2. Los informes de los Institutos Nacionales de Salud 3 y las directrices de la American Heart Association 4 subrayaron la importancia de desarrollar modelos clínicamente relevantes de ICH para ampliar la comprensión de la fisiopatología y desarrollar objetivos para nuevos enfoques terapéuticos.
Existen varios modelos para imitar ICH humana 5. Como la comprensión de la fisiopatología de la ICH madura, se ha hecho evidente que una variedad de modelos puede ser utilizado para examinar diferentes aspectos de la enfermedad. Modelos utilizados anteriormente incluyen angiopatía amiloide murino 6, inserción microbalón intraparenquimatosa y la inflación 7, y la sangre arterial directainfiltración de 8,9. Lobar hemorragia de angiopatía amiloide se ha modelado con el uso de ratones transgénicos y representa un subtipo de la ICH distinta. Modelos microbalón imitan el efecto de masa aguda de la formación de hematomas, pero no logran captar la respuesta celular del cerebro a la presencia de sangre. Por último, la infiltración de sangre arterial directa somete el cerebro a las presiones arteriales de la arteria femoral. Por lo tanto, este modelo imita presiones arteriales y la presencia de sangre, pero no somete al cerebro a la lesión microvascular de pequeña ruptura de los vasos sanguíneos. Además, este modelo tiene inherentemente alta variabilidad. Curiosamente, las ratas espontáneamente hipertensas 10 desarrollan HIC espontánea a medida que envejecen. El estudio de estos animales después del desarrollo de la ICH puede imitar la enfermedad en presencia de uno de los principales comorbilidades que predisponen a los seres humanos de la ICH. Si bien existen estos otros modelos, la inyección de intraestriatal clostridial colagenasa 11 o inyección instrastiatal de unsangre entera utologous 12 son, en la actualidad, los dos modelos más comunes utilizados en la investigación preclínica ICH.
La selección del modelo de la ICH debe hacerse con base en el objetivo de la pregunta experimental, incluyendo la selección y el método de inducir la formación de hematomas especies. Por ejemplo, los cerdos son animales grandes con volúmenes relativamente grandes de la materia blanca del cerebro en comparación con los ratones. Por lo tanto, son adecuados modelos porcinos para estudiar la materia blanca fisiopatología siguiente ICH. En contraste, los cerebros de roedores son materia principalmente de color gris, pero los sistemas transgénicos hacen roedores útil para evaluar los mecanismos moleculares de la lesión y la recuperación después de la ICH. Cada modelo tiene sus fortalezas y debilidades (Tabla 1) inherentes, que debe ser considerado cuidadosamente antes de la experimentación.
Los siguientes protocolos demuestran los modelos de sangre y de inyección de colagenasa autólogas en ratones. Estos modelos han sido cada uno traducida de modelos desarrollados originalmente en ratas13,14 y permitir el uso de la tecnología transgénica ampliamente disponibles para explorar los mecanismos moleculares asociados con la muerte celular después de la ICH. Ambos representan claramente diferentes mecanismos de lesión de ICH humano, y ambos tienen muy diferentes resultados esperados en términos de medidas conductuales e histológicas. Por lo tanto, ciertas hipótesis pueden prestarse a un modelo sobre el otro, pero muchas ideas pueden requerir la validación en ambos modelos.
Tabla 1. Comparación de las características de los modelos de hemorragia intracerebral inyección de sangre autóloga colagenasa-e.
| La inyección de colagenasa | Inyección de sangre | |
| Facilidad de Uso | + + + | + + | + + | + + |
| Control de la Hemorragia Tamaño | + + | + + + |
| El reflujo de sangre | + | + + |
| Simula Enfermedades Humanas | + | - |
| Sencillez | + + | + + |
| El uso en múltiples especies | + + | + + |
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Protocol
Declaración de Ética: Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de la Universidad de Duke Institucional Cuidado de Animales y Uso y sigue todas las pautas para el uso ético de los animales.
1. Preparación de Equipo
- Autoclave las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía.
- Desinfectar el aparato estereotáctico con etanol al 70%.
- Encienda el baño de agua y mantener la temperatura del agua a 42 ° C.
- Disolver Tipo IV-S clostridial colagenasa en solución salina normal a una concentración de 0,075 U por 0,4 l.
2. Colagenasa Modelo Inyección
- Pesar el ratón.
- Anestesiar el ratón en una cámara de inducción con 5% de isoflurano en el 30% O 2/70% N 2. Anestesia adecuada se indica después de aproximadamente 2 minutos, cuando la respiración de ratón han reducido a 1 por segundo.
- Intubar la tráquea con una G catéter intravenoso 30 mm 20.
- Conectar el catéter a unrespirador de roedores y ventilar mecánicamente los pulmones con el 1,6% de isoflurano en el 30% O 2/70% N 2, a razón de 105 respiraciones por minuto, con un volumen corriente entregado de 0,75 ml ..
- Afeitar el cuero cabelludo con una máquina de afeitar electrónica. Una vez que el ratón se anestesia y intubado, moverlo a una estación de trabajo diferente para el afeitado y luego regresó a la banca quirúrgica.
- Asegure la cabeza en un marco estereotáctico y nivelar la cabeza con la sutura coronal y sagital tanto como puntos de referencia.
- Aplique una pomada oftálmica para los ojos.
- Inserte una sonda de temperatura rectal. Mantenga la temperatura rectal a 37,0 ± 0,2 ° C por medio de una cama de agua que circula debajo de la carrocería.
- Limpie el área quirúrgica con betadine seguido con etanol al 70% y repetir 3 veces.
- Haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo 1 cm y limpie periostio lateralmente con un aplicador con punta de algodón estéril para exponer bregma.
- Taladro 1 mm de diámetro agujero de trépano de 2,2 mm dejó latEral al bregma con un taladro refrigerado por agua.
- Gire vial colagenasa 5 veces, luego lavar una jeringa de 0,5 l con 25 G aguja (que se adjunta al marco estereotáctico) con 0,5 l solución de colagenasa 5 veces (Deja 0,5 l de solución de colagenasa en la jeringa después de la última de lavado).
- Alinee la punta de la aguja con orificio de trepanación luego expulsar a 0,1 l de la jeringa y limpie bisel de la aguja con la maquinilla de afeitar de desprenderse.
- El uso de un micromanipulador, avanzar la aguja de 3 mm de profundidad de la corteza y dejar inmóvil durante 30 segundos.
- Inyectar 0,4 l más de 90 seg.
- Disminuir isoflurano al 1% y dejar inmóvil aguja durante 5 min.
- Retire la aguja lentamente.
- Aplique 1-2 gotas de 0,25% por vía subcutánea bupivacaína y suturar la piel.
- Apague vaporizador isoflurano y quitar ratón del marco estereotáctico.
- Permita ratón para recuperar la ventilación espontánea con extubación traqueal posterior.
- Ratón Regreso a una jaula limpia y permitir el libre acceso aalimentos y agua.
3. Autólogo Modelo Inyección de sangre
- Siga los pasos de 02.01 a 02.11 para el modelo de inyección de colagenasa.
- Dibujar 50 l de solución salina normal estéril en una jeringa de 30 l G 50.
- Coloque la jeringa de microlitro con un tubo PE10 70 cm.
- Expulsar todo la solución salina normal de la jeringa en el tubo de microlitro a un tubo de PE10-air de completamente.
- Tire de la jeringa de pistón microlitro a cabo 1 mm para hacer una burbuja de aire en la abertura distal del aparato de jeringuilla de tubo de PE10-microlitro para evitar la mezcla de solución salina y la sangre durante los procedimientos posteriores.
- Limpiar la región de la arteria central de la cola distal del ratón con etanol al 70%, y cortar la arteria con una maquinilla de afeitar de 0,5 a 1 cm a la punta de la cola.
- Recoger 40 l de sangre de la cola cortada en el aparato de jeringuilla de tubo de microlitro-PE10. Nota: que la heparina no se utiliza en la aguja, tubo, o el ratón.
- Conecte la jeringa de microlitro a la injebomba cción.
- Conectar la porción de cánula de metal de una aguja de 27 G para el extremo del tubo de PE10, y asegurar la aguja a un micromanipulador en el marco estereotáctico.
- Expulsar a 2 l de sangre de 27 G de la aguja y limpie bisel de la aguja con la maquinilla de afeitar de desprenderse.
- Alinee la punta de la aguja con orificio de trepanación e inserte la aguja 3 mm de profundidad de la corteza.
- Inyectar 35 l de sangre autóloga a razón de 2 l por min.
- Disminuir isoflurano al 1% y dejar inmóvil aguja durante 10 min.
- Retire la aguja durante 30 s.
- Aplique 1-2 gotas de 0,25% por vía subcutánea bupivacaína y suturar la piel.
- Apague vaporizador isoflurano y quitar ratón del marco estereotáctico.
- Permita ratón para recuperar la ventilación espontánea con la posterior de la extubación.
- Ratón Regreso a una jaula limpia y permitir el acceso libre a comida y agua.
4. Sham Operación
- Siga los mismos procedimientos para injectio colagenasamodelo n, excepto que sin la inyección después de la inserción de la aguja.
5. Cuidados después de la cirugía
- Inyectar 0,5 ml de solución salina normal por vía subcutánea en la noche de la intervención quirúrgica en la parte posterior del cuello del animal.
- Proporcionar alimentos ablandada con agua y la comida en gel en pequeñas tazas de plástico colocadas en el suelo de la jaula. Vuelva a colocar la comida al día durante 7 días.
- Compruebe si hay pérdida de peso, cicatrización de heridas y signos de malestar al día durante 7 días.
- Si se requieren intervalos de recuperación de más de 7 días, retirada de la sutura se puede realizar bajo anestesia ligera con inhalada (aproximadamente 1% de isoflurano en 30% de O 2/70% N 2), si es necesario.
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Representative Results
Debido a las diferencias en la formación de un hematoma (Figura 1), giro ipsilateral se muestra inmediatamente después de despertar para los ratones inyectados de sangre autóloga y dentro de 2 a 4 horas después de la inyección de colagenasa, como la expansión del hematoma se produce (Figura 2). Ausencia de giro ipsilateral debe plantear la preocupación por la ausencia de lesiones significativas. En el primer día después de la lesión, los ratones en ambos modelos deben demostrar los déficits neurológicos significativos (Figura 3). A las 24 h después de la inyección, hemisferios ipsilaterales muestran volúmenes hematoma estables (Figura 4); Además, a las 24 horas después de la inyección, el contenido de agua del cerebro se debe esperar a ser 79,8 + 0,34% en ratones colagenasa-inyectado y 79,3 + 0,23% en los ratones inyectados de sangre autólogas. La mortalidad se debe esperar que se produzca entre el 10 - 25% de los ratones de la colagenasa-inyectado y menos de 10% de los ratones inyectados de sangre autólogas. Muerte inevitable debido al volumen del hematoma, edema cerebral, y increapresión intracraneal sed por lo general ocurre dentro de los primeros 24 a 48 horas después de la inyección intraestriatal. La muerte ocurre después de 72 hr a menudo se puede evitar con cuidado después de la lesión adecuada (por ejemplo., El fácil acceso a los alimentos y el agua ablandada). La recuperación funcional se inicia generalmente por día post lesión 2 con ratones inyectados de sangre autólogas recuperación significativamente más rápido que los ratones inyectados con colagenasa.
Figura 1. Formación de imágenes de resonancia magnética de serie de cerebros de ratón que comparan sangre autóloga y la colagenasa modelos de inyección de hemorragia intracerebral. Después de la inducción hemorragia intracerebral mediante una inyección intraestriatal izquierdo de 35 l de sangre autóloga (A) o 0,075 U Tipo IV-S colagenasa clostridial (B) en 10 - 12 semanas de edad ratones machos C57/Bl6, serial im resonancia magnéticaenvejecimiento demuestra la expansión de hematoma en los ratones de colagenasa-inyectado en comparación con la formación de hematomas estable en los ratones inyectados de sangre autólogas. Hematoma volúmenes son 10.1, 23.1, 29.9 mm 3 en 1, 6, y 12 horas después de la inyección de colagenasa, respectivamente, y 7.0, 5.8, 3.2 mm 3 en 1, 6, y 24 horas después de la inyección de sangre total, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 2 test vez Corner en ratones 24 horas después de la hemorragia intracerebral Tomado inmediatamente después de la inyección de colagenasa intraestriatal en los ganglios basales izquierdos, la presencia de la respuesta de giro ipsilateral se espera en 10 -. 12 semanas de edad ratones C57/Bl6 masculino denota lesión adecuada. Esta inflexióndebe ocurrir inmediatamente después de la lesión significativa en los ratones inyectados con sangre autóloga y dentro de 2 - 4 horas en ratones colagenasa-inyectado. Los ratones de ambos modelos mostraron más giros a la izquierda después de la lesión en comparación con los ratones no lesionado (** p <0,01; ANOVA de una vía con post-hoc test de Scheffe, n = 10/grupo).
. Figura 3 el rendimiento de Rotarod después de la hemorragia intracerebral en ratones de línea de base y después de la lesión latencias rotorod de 10 -. Ratones macho C57/Bl6 12 semanas de edad durante una semana después de izquierda intraestriatales 35 l autóloga de sangre, 0.075 U Tipo IV-S clostridial colagenasa-inyección o cirugía simulada (* p = 0,022; repitió medidas ANOVA con post-hoc test de Scheffe, valor F = 12,726; n = 10/grupo). Los ratones son evaluados a través de pruebas rotorod cada dos días después de la lesión para evitar un sesgo importante de capacitación. </ P>
. Figura 4 hematoxilina y eosina de cerebro de ratón después de la hemorragia intracerebral microfotografías de 10 -. C57/Bl6 masculinos cerebros 12 semanas de edad ratones a las 24 horas después de la inyección izquierda intraestriatal de 35 l de sangre autóloga (derecha) o 0.075 U Tipo IV-S clostridiales colagenasa (izquierda). Hematoma volúmenes son 20,2 mm 3 después de la inyección de colagenasa y 6,4 mm 3 después de la inyección de sangre entera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A pesar de que emerge la investigación preclínica y grandes ensayos clínicos resultantes de la promesa de la terapéutica de 15-18, no hay intervenciones farmacológicas demostradas para mejorar el resultado en el ICH, y la atención se mantiene en gran medida de apoyo. Las listas de posibles terapias pueden ser generados por tecnologías de alto rendimiento, como el trabajo transcriptómica y proteómica. Si bien estas tecnologías siguen avanzando nuestro conocimiento de posibles dianas terapéuticas, Traducción directa e inversa de objetivos prometedores pueden ser mejor examinar a través del uso de modelos preclínicos de relevancia clínica 19-22. Tales modelos son útiles porque permiten un rápido rendimiento de los candidatos seleccionados, el examen de los mecanismos in vivo, la investigación de bajo costo de dosificación, ventana terapéutica, y otros parámetros germano para el desarrollo de ensayos clínicos 23-25. Aunque existen evidentes ventajas en el uso de modelos preclínicos, el modelado debe ocurrir en el más clínicamente relevante but sistema logísticamente factible disponible. Si bien existen modelos de animales de orden "superiores" como los primates, el uso de ratones para modelar enfermedades humanas proporciona un alto rendimiento de bajo costo, y la tecnología de gran alcance para el examen de los mecanismos patológicos y efectos terapéuticos. La incorporación de sistemas transgénicos permite evaluar aún más sólida de las vías mecanicistas y poblaciones de células que participan.
Actualmente dos modelos murinos son de uso común: sangre autóloga intraestriatal o inyección de colagenasa. Ambos modelos son versátiles y fáciles de usar, en relación con otros modelos de accidente cerebrovascular. Ambos modelos pueden inducir ICH en diferentes áreas del cerebro 26, lo que permite la evaluación de las respuestas regionales; volumen del hematoma puede ser controlado y cambiado, lo que permite la evaluación de la lesión leve, moderada y severa; y la fisiología clínicamente relevante (por ejemplo., presión sanguínea, temperatura, etc) puede ser controlado. Por último, mientras que cada modelo se desarrolló originalmente enla rata, tanto desde entonces se han traducido en ratones para permitir el uso de sistemas transgénicos 21,24,25,27. Sin embargo, cada modelo se presta al estudio de diferentes aspectos de la ICH, como cada uno representa claramente diferentes componentes de la ICH. Sangre-inyección autóloga puede recrear la respuesta del cerebro a la exposición a la sangre intraparenquimatosa. Por lo tanto, la masa inicial afecta y las fuerzas de corte, los cambios inflamatorios leves, la apoptosis y la reabsorción de la sangre pueden todos ser estudiado 10,28. Además, las recientes modificaciones a este modelo se han traducido en la capacidad de imitar la expansión del hematoma 29,30. Sin embargo, este modelo no invoca el componente de la lesión vascular y / o expansión del hematoma que se encuentra en la enfermedad humana. Por el contrario, la colagenasa-inyección añade los elementos de ruptura vascular, hematoma expansión temprana y aumento del efecto neuroinflamatoria. Aunque existen preocupaciones obvias sobre la contribución de los artefactos de la colagenasa a este efecto inflamatorio, hay una falta de fuerza eas pruebas para este 31, y nuestros propios datos (no publicados) sugieren que la colagenasa en forma aislada no induce una respuesta inflamatoria marcada en cultivo celular.
Desde un punto de vista procesal, ambos modelos requieren de la habilidad limitada con microcirugía y, por lo tanto, se aprende fácilmente con el fin de obtener efectos reproducibles. Errores que hay que evitar son: 1) la invasión de la duramadre o la creación de una lesión cerebral térmica al taladrar, 2) o la penetración del sistema ventricular con la inserción de la aguja. Lesión dural permite el reflujo de inyectante, y los resultados de inyección intraventricular en poca o ninguna formación de hematomas intraparenquimatosa. Además, se debe tener cuidado al retirar la aguja para no perturbar recién formado / hematoma formando. La mortalidad es de esperar en un cierto porcentaje de los ratones, pero está directamente relacionada con el tamaño del hematoma y el grado de lesión deseado; por lo tanto, este resultado puede ajustarse por inyectante volumen / concentración.
Al igual que con todos los modelos, proprotocolos serán optimizados para el uso de operadores concretos. Debido a la variabilidad inherente a todos los sistemas in vivo, la experiencia con un modelo determinado como un factor clave para el éxito no puede ser exagerada. Características distintivas de un modelo, la experiencia del operador con un modelo dado, las métricas de resultado de interés, y los factores logísticos deben todos tenerse en cuenta a la hora de seleccionar el mejor modelo posible experimental.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | 51603 | |
| Probe holder with corner clamp | Stoelting Co. | 51631 | |
| Mini grinder | Power Glide | Model 60100002 | |
| 0.5 μl syringe | Microliter | 86259 | 25 G needle |
| 5 μl syringe | Microliter | 7637-01 | |
| 30 G microliter syringe | Microliter | 7762-03 | |
| Syringe pump | KD Scientific | Model 100 | |
| Heat therapy water pump | Gaymar Industries, Inc. | Model# TP650 | |
| Circulating waterbed | CMS Tool & Die, Inc. | ||
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Isoflurane vaporizer | Drager | Vapor 19.1 | |
| Air flowmeter | Cole Parmer | Model PMR1-010295 | |
| Induction chamber | Self made | ||
| Otoscope | Welch Allyn | 22820 | |
| Intravenous catheter | Becton-Dickinson | 381534 | 20 G, 1.16 inch Insyte-W |
| Isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC10019-360-69 | |
| Collagenase Type IV-S | Sigma | C1889 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton-Dickinson | 427401 | |
| 27 G 1 1/4 inch needle | Becton-Dickinson | 305136 | |
| Surgical scissors | Miltex | 21-539 | |
| Forceps | Miltex | 17-307 | |
| Needle holder | Boboz | RS-7840 | |
| Monofilament suture | Ethicon | 8698 | Size 5-0 |
| Indicating controller | YSI | 73ATD |
References
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