Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d'anticorps synthétiques phage

Résumé

Une méthode est décrite avec accompagnement visuel pour mener évolutives, des sélections à haut débit à partir de banques d'anticorps combinatoires synthétiques de phages contre des centaines d'antigènes simultanément. En utilisant cette approche parallèle, nous avons isolé des fragments d'anticorps qui présentent une affinité et une spécificité pour divers antigènes qui sont fonctionnelles dans des dosages immunologiques standard.

Résumé

La demande pour les anticorps qui répondent aux besoins des deux applications de la recherche fondamentale et clinique est élevé et va augmenter considérablement dans l'avenir. Cependant, il est évident que les techniques traditionnelles monoclonaux ne sont pas seuls à cette entrée. Cela a conduit au développement de méthodes alternatives pour satisfaire la demande de haute qualité et de réactifs d'affinité renouvelables accessibles à tous les éléments du protéome. À cette fin, méthodes à haut débit pour la conduite des sélections de bibliothèques d'anticorps synthétiques phages ont été conçus pour des applications impliquant divers antigènes et optimisé pour un débit rapide et le succès. Ici, un protocole est décrit en détail qui illustre avec la sélection vidéo manifestation parallèle clones de Fab-phage à partir de bibliothèques de grande diversité contre des centaines de cibles à l'aide soit d'un gestionnaire de liquide 96 manuel de canal automatique ou système robotique. En utilisant ce protocole, un seul utilisateur peut générer des centaines d'antigènes,sélectionner des anticorps à eux en parallèle et valider contraignant dans les six à huit semaines anticorps. Surbrillance sont: i) un format de l'antigène viable, ii) l'antigène pré-sélection caractérisation, iii) les étapes critiques qui influencent la sélection de clones spécifiques et de haute affinité, et iv) les moyens de l'efficacité de la sélection de la surveillance et stade précoce anticorps clone caractérisation. Avec cette approche, nous avons obtenu des fragments d'anticorps synthétiques (FABS) à de nombreuses catégories de cibles, y compris les récepteurs à passage unique membranaires, hormones protéiques sécrétées et les protéines intracellulaires multi-domaines. Ces fragments sont facilement convertis à des anticorps pleine longueur et ont été validés à présenter une grande affinité et spécificité. En outre, il a été démontré pour être fonctionnels dans une variété de dosages immunologiques standard, y compris Western blot, ELISA, l'immunofluorescence cellulaire, des dosages d'immunoprécipitation et connexes. Cette méthodologie permettra d'accélérer la découverte d'anticorps et, finalement, de nous rapprocher de la réalisation de l'objectif of générer renouvelables, des anticorps de haute qualité à la protéome.

Introduction

Avec le début de l'ère post-génomique, la disponibilité des réactifs de liaison de haute qualité pour caractériser et de moduler les protéines est essentiel pour ouvrir de nouvelles recherches et avenues thérapeutiques. Anticorps continuent d'être critique à la fois aux chercheurs universitaires et industriels que la recherche fondamentale et outils de diagnostic et thérapeutiques potentiels. Sans surprise, il ya eu une croissance impressionnante des entreprises de développement d'anticorps du contrat, dont la plupart se appuient sur des technologies classiques d'hybridomes pour générer des anticorps personnalisés. Néanmoins, la sélection in vitro en utilisant des bibliothèques d'anticorps phages devient une technologie alternative puissante qui peut offrir des avantages et des succès uniques où les technologies conventionnelles peuvent rencontrer des limitations ^{1, 2.}

À la lumière de la demande considérable pour les anticorps de haute qualité comme outils de recherche, deux principaux défis pour générer des anticorps renouvelables sont 1) le débit de sélection et 2) l'antigène availability. Un certain nombre de groupes ont maintenant décrit dans les pipelines de sélection in vitro visant à augmenter le débit et le taux de l'identification d'anticorps. Ces descriptions en détail une variété d'approches viables qui incluent le choix soit sur ​​toute la longueur cible ^{3,4, 5,6,7} ou des domaines structurellement liée, en utilisant soit ^6,8 ou une plaque à base de ^3,4 régimes antigène d'immobilisation sur la base de perles. En outre, l'adoption croissante des technologies de synthèse de gènes ^neuf a fait la production de l'antigène systématique, en particulier des domaines isolés, raisonnablement rentable et peut potentiellement atténuer la difficulté d'obtenir des quantités suffisantes de l'antigène purifié, pleine longueur. En utilisant les deux technologies en tandem, un pipeline autonome et la production de l'antigène évolutive et la sélection d'anticorps a été conçu qui permettrait l'isolement d'anticorps parallèle pour les grands ensembles de domaines antigène exprimé et faciliter le développement de réactifs pour characterizing classes entières de protéines structurellement ou fonctionnellement liés.

Vers cet objectif, un pipeline intégré que les couples dans l'identification in silico de domaines d'antigène exprimables, synthèse de gènes, expression bactérienne à haut débit des antigènes et des sélections d'anticorps de phages évolutives a été développé. Ce pipeline ne nécessite que l'infrastructure de base disponible pour la plupart des laboratoires de sciences de la vie (y compris les bibliothèques d'anticorps qui sont de plus en plus disponible via une licence ou un accord de transfert de matériel), mais est également prête à l'automatisation pour une utilisation à l'échelle industrielle. En utilisant ce protocole, il est possible de générer des centaines de domaines d'antigène étiqueté par affinité, et d'isoler des fragments d'anticorps habituellement hautement spécifiques à un grand nombre de ces antigènes.

La technologie de présentation de phage a montré la compatibilité démontrée avec une grande variété de formats de réactifs d'affinité recombinants, y compris les fragments Fab, scFv, Fv et des domaines autonomes et unnombre croissant de petites «cadres alternatifs» (protéines de répétition ankyrine conçus (DARPINS), fibronectine (Fn), domaines de LIPOCALINE et plus ^10). Discussion est limité dans cet exemple à l'isolement de fragments d'anticorps Fab, même si on suppose ces procédés peuvent être adaptés à d'autres types de bibliothèques. En utilisant cette technologie, Fab ayant un faible nanomolaire affinité à petit, tagged domaines de protéines y compris des domaines de facteurs de transcription, des domaines SH2, de l'ARN des protéines de liaison et d'autres ont été sélectionnés avec succès, dont plusieurs se lient protéine de pleine longueur et sont fonctionnels dans des analyses immunologiques telles que l'immunofluorescence , immunoprécipitation et immunohistochimie. Fait important, les clones de liaison recombinantes sont entièrement renouvelables et peuvent être re-générés à partir de constructions d'expression via bactérienne offre de production accrue cohérence, la reproductibilité et la rentabilité, justifiant ainsi la charge de la validation de clone rigoureuse.

Dans cette protocol et vidéo qui l'accompagne, les méthodes de base pour la sélection d'anticorps à partir de banques de phages en utilisant les domaines d'antigènes immobilisés sont démontrés. Cette méthode particulière emploie domaines protéiques étiquetée GST immobilisées par adsorption passive dans des plaques de microtitration, bien que d'autres mots-clés ^11,12,13 et les formats de sélection ^13,14,2 ont également été utilisés avec succès. Considérations critiques pour la configuration et la conduite des sélections avec contrôle parallèle de paramètres de sélection visant à identifier et isoler anticorps monoclonaux spécifiquement enrichis pour la validation sont détaillées.

Protocole

1. Antigène Generation

REMARQUE: domaines antigène peut être synthétisé et clone par une variété de fournisseurs commerciaux dans un produit d'assemblage d'expression inductible par l'IPTG approprié.

1. Transformer constructions d'expression dans chimiquement compétente, T1-phage résistant, BL21 E. cellules de E. coli en mélangeant 10 ng d'ADN codant dans 20 ul de KCM 1X sur de la glace dans une plaque à 96 puits PCR suivi par l'ajout de 20 L de cellules chimiquement compétentes.
2. Incuber le mélange cellules / ADN sur de la glace pendant 20 min, à température ambiante pendant 10 min, puis sur la glace à nouveau pendant 2 minutes avant de sauver avec 100 pi de super bouillon optimale préchauffé avec glucose (SOC) médias, couvrant avec un joint de plaque respirant et agitation à 37 ° C pendant 1 heure à 200 rpm dans un agitateur orbital de 2,5 cm.
3. Planche 5 ul de cellules transformées sur de Luria-Bertani (LB) / plaques de gélose complété avec de la carbénicilline (100 g / ml) et de se développer O / N afin d'obtenir des colonies uniques utilisées pourgénérer des stocks de glycerol.
4. Inoculer 1 ml de milieu 2YT / carb avec 5 pi stock de glycérol et de croître pendant 12 heures à 37 ° C dans un bloc de 96 puits en puits profond avec agitation à 200 tpm dans un agitateur orbital de 2,5 cm.
5. Inoculer NZY media15 (complété avec 0,05% de glucose, 2% de lactose et 100 g / ml de carbénicilline) avec une dilution 1:40 de cette culture, puis agiter pendant 6-8 heures à 30 ° C et 200 tpm dans un 2,5 cm orbitale shaker.
6. bactéries Pellet et purifier des protéines antigéniques à haut débit dans une plaque filtrante à 96 puits contenant 100 pi de résine Ni-NTA selon protocols16,17 précédemment publié.
7. Déterminer la concentration de protéines purifiées par Bradford assay18 de fixation de colorant et de caractériser la taille et la pureté par séparation et la visualisation de 10-50 ug avec Coomassie sur un gel SDS-page (voir Figure 2).
   NOTE: A ce stade protéines peut être caractérisé par des méthodes qui permettent d'évaluer l'agrégation des protéines ¹⁹ ou de pliage ²⁰ en fonction de la nature de l'antigène et les exigences de la canalisation de sélection.

2. Préparation et titrage de la Bibliothèque Phage

1. Choisissez une seule colonie de E. T1 résistants aux phages coli cellules dans 1 ml de milieu 2YT additionné de 50 ug / ml de tetracycline.
2. Une fois que la croissance cellulaire est établie visuellement, diluer la culture dans un plus grand volume de milieu 2YT additionné de 50 ug / ml de tetracycline pour assurer un volume suffisant de cellules pour l'infection (généralement de 45 ul par dilution bibliothèque, voir ci-dessous.).
3. Préparation de la bibliothèque pour une utilisation par précipitation du phage à partir du tampon de stockage avec 1 / 5ème du volume de l'autoclave 20% de PEG-8000, 2,5 M de NaCl (PEG-NaCl) à incuber sur de la glace pendant 30 min et la granulation phage précipité par centrifugation à 12 000 x g.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le phage précipité dans un volume approprié de PBS 1x pH 7,4, 0,2% de BSA et 0,05% de Tween (PBT), en ajustant to une concentration de phage appropriée pour les sélections (si nécessaire) pour assurer une couverture adéquate de la bibliothèque. Voir l'étape 2.9 et discussion.
5. Diluer une aliquote de 5 ul phage dans 45 pi de PBS 1x pH 7,4 dans une plaque multi-puits stérile, mélanger, et de créer une série de 10 dilutions dans le même tampon.
6. Ajouter 5 ul de chaque dilution de phage à 45 ul de phage T1-E résistant. coli cellules en phase de croissance journal (DO ₆₀₀ = 0,4 à 0,8) dans une autre plaque multi-puits, couvrir avec un joint respirant et incuber à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute pendant 30 min dans un agitateur orbital de 2,5 cm.
7. Planche 5 ul de cellules infectées de chacun des puits sur une plaque de gélose préchauffé additionné de 100 g / ml de carbénicilline et de croître O / N à 37 ° C jusqu'à ce que des colonies soient visibles.
8. Calculez le total phage / ml comme suit:
   Phage / ml = nombre de colonies sur une plaque carbénicilline dans le diluer échantillon x 200 x 10 ⁱ (où i = le num plupart maximalebre de dilutions dans lequel les colonies sont visibles).
9. Pour déterminer le nombre de puits revêtus d'antigène pour assurer une couverture de la diversité bibliothèque, calculer comme suit:
   Nombre de puits revêtus d'antigène requise =
   Pli couverture souhaitée * la diversité de la bibliothèque
   # De phage pour 100 ul

3. Anticorps Sélection de bibliothèques de phages

3.1) Immobilisation Antigen

1. Pour éviter les cycles de gel-dégel peuvent affecter la qualité antigène et pour faciliter dilutions, préparer une plaque de protéine antigène stock normalisée à 100x concentrations de travail (par exemple, 500 g / ml) et aliquotes dans des plaques à 96 puits non contraignant.
2. Préparer des plaques recouvertes d'antigène de solutions de protéines du stock un jour avant chaque tour de sélections par dilution du stock plaques avec du PBS.
3. Manteau 96 puits polystyrène plaques de liaison de protéines avec 100 pi de TPS-étiqueté protéine d'antigène ou contrôle négatif protein (TPS, BSA, neutravidine, etc.) à 5 ug / ml dans PBS. Agiter à 250 rpm 4 ° CO / N sur un agitateur de microplaques.
4. Enlever la solution de protéine à partir de l'enduit microplaques, bloquer les plaques revêtues d'antigène et de sélection négative avec 200 pi de tampon de blocage (0,2% de BSA dans PBS 1x pH 7,4) et agiter à 250 rpm à température ambiante pendant 1-2 heures.
5. Après blocage, les plaques de laver revêtus de protéine bloqués quatre fois avec 200 ul de 1 x PBS, pH 7,4 avec 0,05% de Tween (PT) en mémoire tampon soit manuellement, soit en utilisant un laveur de microplaques automatique.

3.2) Bibliothèque pré-dédouanement et Antigen-phage Incubation

1. Appauvrissent la bibliothèque de non (ou tag-) fragment de liaison d'anticorps clones spécifiques de phages par virement de 100 pi (10 ¹² phages) de bibliothèque de phages préparés dans un tampon PBT à un certain nombre de puits revêtus de protéine de contrôle négatif ou sans étiquette d'affinité protéine (par exemple, TPS) équivalent au nombre de cibles et incuber phagedans les puits pour 1-2 heures à température ambiante avec agitation à 250 rpm.
   Remarque: Comme alternative ou d'autres moyens de sélection négative, l'incubation peut également être effectuée en présence d'un excès (5 à 25 uM) protéine soluble dans l'étiquette d'affinité (par exemple, TPS) pour éliminer davantage les clones de balises de liaison et améliorer la récupération de la cible spécifique clones de liaison.
2. Transfert phage surnageant de sélection négative sur des plaques revêtues d'antigène et incuber pendant 2/1 heure à température ambiante avec agitation par secousses à 250 tours par minute pour la capture de clones de liaison spécifique.
3. Retirer les phages non liés et laver les puits de la microplaque 8-15 fois avec un tampon de PT soit manuellement ou en utilisant un laveur de microplaques. Éliminer le tampon de lavage en excès juste avant élution.

3.3) élution, maladies infectieuses et Phage Amplification

1. Tôt le jour de sélections, choisissez une seule colonie de E. T1 résistants aux phages coli cellules dans 1 ml de milieu 2YT additionné de 50 ug / ml de tetracycline et de croissance à 37 ° C wie agitation à 200 rpm dans un shaker ou équivalent orbitale 2,5 cm.
2. Une fois que la croissance cellulaire est établie et peut être vu à l'oeil nu, d'augmenter le volume de milieu 2YT avec additionné de 50 ug / ml de tetracycline pour assurer un volume suffisant de cellules pour l'infection (généralement 100 ul par puits sélection).
3. Cultiver les cellules jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,4-0,8 est atteint (environ 5-7 heures), puis à éluer le phage lié ajouter 100 pi de cellules à la plaque d'antigène lavé et agiter à 37 ° C pendant 30 min.
4. Ajouter le phage auxiliaire M13K07 à une concentration finale de 1 x 10 ¹⁰ cfu / ml et incuber à 37 ° C pendant 45 min sous agitation à 200 tours par minute.
5. cellules de transfert à 1,2 ml de 2YT complétées avec 150 pg / ml de carbénicilline et 75 pg / ml de kanamycine dans un 96 puits bloc profonde de bien avec V-bas et de grandir O / N à 37 ° C sous agitation à 200 tpm dans un 2,5 cm agitateur orbital.

3.4) Phage Préparation et cycles répétés de Selection

1. Bactéries pellets par centrifugation à 4000 g pendant 15 min à 4 ° C.
2. Mélanger des volumes égaux de surnageant de phages à partir de plaques répliquées dans un mini-tube de 96 puits boîte bleue de microplaque stérile, neutraliser avec 1/10 ^ème volume de 10X PBT et mélanger. Répéter les tours de sélection (à partir de l'étape 3.1.1) pendant 3-4 tours ou jusqu'à ce que l'enrichissement est observée (voir les sections 4. et 7.) par rapport à la protéine de contrôle négatif.
   NOTE: Dans les premiers tours de sélection lorsque ne est pas prévu enrichissement significatif / détectable (par exemple, les séries 1 et 2), la quantification des titres d'entrée et de sortie phages (décrites à la section 7 et des résultats représentatifs de la figure 3) peut être utile pour se assurer concentrations minimales de phages pour les sélections succès (décrites dans Discussion) et sont plus appropriées que ELISA communs.

4. Caractérisation par Pooled ELISA

1. Manteau de 96 puits à haute valeur protéique-bindtion des plaques de polystyrène avec 100 pi de TPS-étiqueté protéine d'antigène ou une protéine de contrôle négatif (TPS, BSA, neutravidine etc.) à 2 pg / ml conformément à la section 3.1 et agiter à 4 ° CO / N.
2. Retirer l'excès d'antigène, bloquer la plaque avec 200 pi de tampon de blocage avec agitation pendant 1-2 heures à la température ambiante à 250 tpm sur un agitateur de microplaque et laver quatre fois avec le tampon de PT 200 pi soit à la main ou en automatique de lavage de plaques.
3. Appliquer 100 pi de surnageant de phage (dilué 1: 10-1: 20 dans un tampon PBT), serrer à 250 tours par minute pendant 15 min à température ambiante, et laver la plaque huit fois avec le tampon de PT 200 pi.
4. Ajouter 100 ul d'anticorps anti-M13-HRP (1: 5000 dans du tampon PBT). Agiter à 200 tours par minute pendant 30 min à température ambiante, puis laver la plaque six fois avec le tampon de PT 200 pi et deux fois avec 200 pi de PBS.
5. Appliquer 100 pi de 1: 1 substrat de TMB et développer pour 5-15 min (ou jusqu'à ce que la couleur substantielle a développé), puis arrêter la réaction par addition de 100 pi d'une MH ₃ PO ₄ et de lire la plaque à 450 nm.
6. En général, l'enrichissement en pools de phage peut être observé dans les tours 4/3 comme un rapport de liaison spécifique par rapport à la liaison non spécifique de> 2 (voir figure 4)
   NOTE: Il est instructif de noter que signal élevé liaison absolue sur la protéine affinité tag indique enrichissement de liants spécifiques tag (plutôt que liants cibles), et que le signal de liaison absolue élevée sur la protéine de contrôle négatif indique enrichissement de non-spécifique ou " «liants collantes.

5. Clone sélection, séquençage et la caractérisation

5.1) Isolement de simples Fab-phage Clones

1. Pour isoler les clones individuels pour le séquençage et la caractérisation, infecter 1/10 ^ème volume du pool de phages amplifiés dans de phage T1 résistant E. coli cellules en phase logarithmique de croissance (DO ₆₀₀ = 0,4 à 0,8) dans une plaque de microtitrage à fond rond, couvrent avec un Breathajoint de plaque ble et incuber sous agitation à 200 tours par minute pendant 30 minutes à 37 ° C.
2. Préparer 10 fois des dilutions en série dans un milieu 2YT et plaque sur des plaques d'agar-agar supplémenté avec distinctes 100 g / ml de carbénicilline.
3. Prélever des colonies simples dans 450 pi de milieu 2YT / carb complétées avec 1 x 10 ⁹ M13K07 phage / ml et de grandir O / N dans un mini-tube de 96 de la boîte bleue de puits de microplaque stérile incubation à 37 ° C avec agitation à 200 rpm.
4. Bactéries pellets par centrifugation à 4000 g pendant 10 min à 4 ° C.
5. Clonale phage surnageant peut être utilisé pour le séquençage de clones Fab-phage (comme décrit à la section 5.4) ou pour clonale directe contraignant ELISA pour déterminer la spécificité contre des antigènes immobilisés (comme décrit dans les sections 5.3 et ²¹⁾ pour lesquels des résultats représentatifs sont présentés dans la figure 5.

5.2) Expression de clones Fab pour la caractérisation

1. Après clonage dans un e appropriéevecteur xpression (voir Discussion), prendre seul E. coli colonies transformées avec constructions d'expression dans 1 ml de milieu 2YT / carb dans une plaque de 96 puits profonds puits en utilisant un cure-dent ou embout de pipette stérile et croître pendant 12-16 heures à 37 ° C avec agitation à 200 rpm. Cela peut être fait soit manuellement ou avec un sélecteur de colonie automatisé.
2. Transfert 40 ul de culture en croissance à 1,5 ml de milieu NZY supplémenté avec du glucose / lactose / glycérol dans un bloc et à arbre long 96 selon la méthode de Studier et al. ¹⁵
   NOTE: En variante, les cellules peuvent être cultivées pendant 3-4 h (DO de 0,8 à 1,0) dans l'expression non supplémenté et la protéine induite par l'addition de 1 mM IPTG.
3. Couvrir le bloc (s) de culture avec un joint respirante et d'exprimer clones Fab pour 6-8 heures à 30 ° C avec agitation à 200 rpm. plaques de tourner à 4000 g pendant 15 min pour sédimenter les cellules bactériennes, éliminer le surnageant, plaques de recouvrement avec un sceau de papier d'aluminium et congeler pastilles à -20 ° C jusqu'à ce que la lyse.
4. Libérer Fab exprimés à partir de granulés collectés avec 100 ul de tampon de lyse (Tris HCl 50 mM, NaCl 200 mM, 1,25% de Triton X-100 à pH 8,0 avec 1 mg / ml de lysozyme et 10 des inhibiteurs de la benzonase / culture et la protéase ml U) et agitation pendant 2 h à 4 ° C.
5. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 4000 g pendant 15 min à 4 ° C et de recueillir brut surnageant de lysat pour une utilisation dans la caractérisation initiale de spécificité par des plaques ELISA (voir section 5.3).

5.3) Caractérisation Clone par liaison directe de clones Fab ELISA

1. Immobiliser antigènes comme décrit dans la section 3.1 à la place aliquotage 30 pi de 2 pg antigène / ml dans du PBS dans les puits d'une plaque de 384 puits. Dispositions de l'antigène à base de Quad-dans la plaque peuvent faciliter le transfert de réactif lors de l'utilisation 96 têtes de distribution basés sur un canal. Lavez et blocs plaques ELISA conformément à la section 3.1.
2. Lysats clarifiés recueillies auprès Section 5.2 peut être appliqué directement à l'antigène immobilisé pour Evaluation de la liaison. Incuber 30 ul de lysat par puits pendant 15 min à température ambiante avec agitation par secousses à 200 tours par minute.
   Remarque: Purified Fab protéine clone peut alternativement être utilisée par dilution à 10 pg / ml dans du tampon PBT et en appliquant 30 ul de chaque clone dans des puits bloqués contenant l'antigène ou négatif protéine de contrôle (TPS, BSA, etc.) et le développement de la même manière que décrit ci-dessous. En variante, Fab-phage peut également être utilisé en diluant 10 ul de surnageant de phage (décrite dans la Section 5.1) dans 20 ul de tampon PBT (1: 3) et la détection avec des anticorps anti-M13-HRP (décrit dans les étapes 4.4 à 4.5)
3. Enlever l'excès de lysat et laver puits soit manuellement, soit en utilisant une plaque automatisé lavé 8x avec 100 pi de tampon PT et enlever l'excès de tampon.
4. Incuber 30 ul d'une dilution 1: 5000 d'anticorps secondaire anti-FLAG dans du tampon PBT pendant 30 min à température ambiante avec agitation par secousses à 200 tours par minute.
5. Laver, développer et quantifier selon Sections 4.3 à 4.5.
   REMARQUE: Les résultats représentatifsillustrant les clones de liaison à la fois spécifiques et non spécifiques sont présentés sur la figure 5.

5.4) Clone séquençage

1. Préparer un mélange maître PCR comme indiqué dans le tableau 2.
2. Ajouter 2 pi de la matrice de PCR approprié (ou surnageant de phage remis en suspension seule colonie bactérienne contenant un phagémide-) à 20 pi de mélange maître préparé par PCR avec les amorces appropriées dans les puits d'une plaque PCR.
   REMARQUE: Les mélanges maîtres distincts sont nécessaires pour le séquençage des deux gènes de chaînes lourdes et légères.
3. Exécutez la réaction PCR en utilisant les paramètres listés dans le Tableau 2 - Paramètres de PCR.
4. Vérifier le succès de la réaction PCR en mélangeant 5 ul de la réaction se est achevée avec colorant de charge sur un gel d'agarose à 1% complété avec de l'ADN de visualisation et d'imagerie tache sur un transilluminateur 300 nm.
5. Ajouter 2 ul de produit de PCR de 10 ul d'eau stérile contenant 0,2; Ul de chaque exonucléase et phosphatase alcaline de crevette et incuber à 37 ° C pendant 20 min suivie d'une inactivation enzymatique à 80 ° C pendant 10 min pour éliminer les amorces en excès dans la préparation pour le séquençage.

6. Mise à l'échelle des sélections automatiques

6.1) sur la base de la pipette Liquid Handling

1. Préparer un 1% (p / v) de bleu de bromophénol dans de l'eau et éliminer les particules insolubles en utilisant un filtre de 0,45 ml.
2. Pour déterminer la gamme linéaire de l'absorbance sur le lecteur de plaque, préparer un 1: 1000 dilution de la solution de bleu de bromophénol 1% dans l'eau, et continuer avec deux dilutions successives (16 dilutions au total).
3. Transférer 100 ul de chaque dilution à un fond plat plaque de 96 puits et lire l'absorbance à 590 nm. Terrain absorbance absolue par rapport facteur de dilution et choisissez une dilution au milieu à haut de gamme de la gamme linéaire pour les essais suivants.
4. Ajouter le bleu de bromophénol à l'eau ou à la solution réellequi sera introduit à la pipette sur la base de la dilution choisie à l'étape précédente dans un volume suffisant pour le pipetage de trois plaques à 96 puits, ainsi que le volume mort dans le réservoir.
5. Étalonner une pipette à canal unique de livrer le volume de test par pipetage eau sur une balance analytique (100 pi d'eau pèse 100 mg à la température ambiante.)
6. Utilisation de la pipette calibrée, transférer le volume d'essai de la solution teints à au moins trois puits d'une plaque de 96 puits fond plat et lire leurs absorbances à 590 nm, en trois exemplaires.
7. Peser trois vides à fond plat de 96 plaques ainsi sur une balance analytique et enregistrer leurs masses.
8. volume d'essai de la pipette à partir du réservoir à chacune des trois plaques de 96 puits et de mesurer leurs absorbances à 590 nm, en triple.
9. Peser chaque plaque et calculer la différence de masse.
10. Tout d'abord, évaluer si les absorbances dans chaque puits sont uniformes dans la plage de tolérance (par exemple., +/- 5%) et si elles sont compatibles avec eabsorbances e obtenus par la main-pipetage avec le Pipetman calibré. Si des canaux particuliers sont constamment sur- ou sous-prestation (voir par exemple la figure 6), suivre les procédures de réparation et répéter la procédure d'évaluation jusqu'à ce que tous les canaux offrent volumes uniformes.
11. Deuxièmement, une fois tous les canaux sont confirmées de livrer des volumes uniformes, vérifier l'exactitude de ce volume en calculant la différence de masse moyenne, par puits. Par exemple, un ensemble de manipulateur de liquide parfaitement calibrée pour 100 pi livrera 9,60 g d'eau par plaque, ou 0,10 g d'eau par puits. Si le volume réel délivrée est toujours supérieur ou inférieur au volume prévu, alors un facteur de correction peut être appliquée, à savoir 110 pi de programmation afin de délivrer en fait 100 ul.
    NOTE: Pour les petits volumes, par exemple, 10 pi, utiliser dix fois plus de bleu de bromophénol dans la solution teinte, et pré-partie aliquote de 90 ul d'eau pour les plaques à 96 puits à la main, pour se assurer que l'absorbances sont mesurables et à l'automne dans le domaine linéaire.

6.2) à laver automatique de plaques

1. Immobiliser cible positive et protéines de contrôle négatif dans des puits séparés de microplaques 96 puits (deux plaques pour chaque condition à tester) tels que décrits dans la section 3.1.
2. Bloquer les sites de liaison non spécifiques par incubation avec une solution de blocage pendant une heure à température ambiante.
3. Ajouter des parties aliquotes identiques de 100 ul d'une 10 ¹³ cfu / ml, solution cible de liaison Fab-phage dans du PBT à tous les puits dans les plaques et incuber sous agitation douce à température ambiante pendant 2 h.
4. Laver deux plaques en fonction de chaque état, une plaque d'infection et de titrage et une plaque pour ELISA.
5. Évaluer l'efficacité du lavage par une infection directe dans des bactéries et titration (tels que décrits dans la section 3.3 (sans ajout M13K07) et 7.2.1) ou de développement avec anticorps anti-M13 HRP et substrat colorimétrique (comme décrit à la section 4).
6. Titres de phages from clones spécifiques seront souvent donné dans la plage de 10 ⁵ -10 ⁷ phage / ml à partir d'une protéine immobilisée contre le clone qui se lie spécifiquement. Certains liaison résiduelle à la protéine de contrôle négatif (par exemple, BSA) est à prévoir et généralement 10 ² -10 ⁵ phage / ml sont observées, cependant très faibles titres (ie., <10 ¹⁾ peut signaler laver trop rigoureuses, ce qui peut compromettre une sélection.
7. Pour phage liaison déterminée par ELISA, comparer les signaux de liaison absolus pour les protéines de contrôle positifs et négatifs afin de déterminer si le lavage robotique est équivalent aux résultats de lavage des mains établies (figure 7).

6.3) laveur de plaques Décontamination

1. Pour démarrer, exécuter le protocole de décontamination à tester.
   NOTE: Nous vous recommandons d'utiliser au moins le double du volume totale de la ligne, et le premier et faire tremper la tête de la rondelle pour l'hypochlorite de sodium à 5 min à 0,5%, fr fraîchement diluéeeau de javel commerciale om (typiquement hypochlorite de sodium 6%).
2. Premier et faire tremper la tête de la rondelle pendant 5 min dans (autoclave) de l'eau stérile et enfin, amorcer le système jusqu'à ce que les lignes sont pleins d'air.
3. Premier les lignes avec de l'eau stérile ou un tampon de lavage.
4. Laver une microplaque 96 puits stérile fois, retirez de la laveuse et sceller avec joint de plaque stérile. Ce est la plaque de commande pré-contamination.
5. Aliquoter 100 ul de S / N amplifiés culture surnageant de phage à tous les puits d'une plaque à 96 puits.
6. Laver la plaque contenant phage-fois, puis retirez de la laveuse et sceller avec un joint de plaque de plastique ou du papier. Il se agit de la plaque de contrôle de la contamination.
7. Effectuer le protocole de décontamination à l'essai. Dans cet exemple, répétez les étapes 6.3.1 et 6.3.2.
8. Laver microplaque stérile une fois, puis retirer de la rondelle et le joint. Ce est la plaque d'essai de décontamination.
9. Plate 50 pi de phase log E. coli sur des plaques de titrage; ce est le pré-infectionplaque de contrôle de la tion.
10. Desceller pré-contamination, la contamination et la décontamination des plaques à 96 puits et ajouter 100 ul de E. coli dans le stade de croissance en phase logarithmique à tous les puits, en utilisant de nouvelles astuces pour chaque puits.
11. Sceller et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes à 200 tours par minute.
12. Plate 50 pi de cellules infectées de trois puits aléatoires de chaque plaque de 96 puits à 10 cm plaques 2YT / glucides et incuber à 37 ° CO / N.
13. Transférer 50 ul de cellules infectées à partir de tous les puits de chaque plaque sur des plaques à puits profonds contenant 1 ml de 2YT, plus 100 g / ml de carbénicilline par puits et croître O / N à 37 ° C.
14. Répétez le protocole de décontamination et de laisser la rondelle lignes sécher.
    NOTE: Non O / N croissance sur des plaques ou en milieu liquide doit être observée sur les plaques pré-commande de l'infection, de contrôle de pré-contamination ou essai de décontamination. Beaucoup de colonies et la croissance doivent être respectées sur la plaque de contrôle de la contamination; Sinon, pas de conclusions quant à l'efficacité de laprotocole de décontamination peut être effectuée. Idéalement, les plaques de décontamination produiront pas de colonies et ne O / N croissance dans l'un des puits dans les plaques d'O / N. La stringence du protocole de décontamination peut être augmentée avec des concentrations plus élevées d'agent de blanchiment, plus tremper temps et des cycles supplémentaires.

7. Entrée / titrages de sortie

7.1) Les titrages de phages d'entrée

1. Diluer une aliquote de 5 ul de phage à 50 ul avec du PBS filtré stérile et mélanger.
2. Préparer série 10 dilution dans du PBS stérile filtrée à 10 ¹⁰ en utilisant une pipette multicanaux ou une pipette 96 canaux.
3. Inoculer 5 ul de phage dilué dans 45 pi de E. T1 résistants aux phages cellules coli Identifiant phase de croissance (DO 0,6 à 0,8) et incuber recouvert d'un joint respirant pendant 30 min à 37 ° C.
4. Planche 5 pi de cellules infectées sur une / plaque de gélose LB additionné de 100 pg / ml de carbénicilline et incuber O / N at 37 ° C.
5. La concentration de phage peut être estimée à partir de l'échantillon le plus dilué dans lequel les colonies apparaissent selon les calculs détaillés à la section 2.8.

7.2) Sortie Phage Pitrations

1. Après l'élution des phages liés en forme de plaque par l'addition de E. coli cellules, diluer une partie aliquote de 5 ul de cellules infectées par le phage à 50 ul avec des milieux 2YT autoclavées
2. Préparer une dilution en série 10 fois dans un milieu 2YT autoclave à 10 ⁶ à l'aide d'une pipette multi-canal ou canal 96 pipette.
3. Planche 5 ul de cellules infectées sur une plaque de gélose complété avec 100 ug / ml de carbénicilline et incuber O / N à 37 ° C.
4. La concentration de phage peut être estimée à partir de l'échantillon le plus dilué dans lequel les colonies apparaissent selon les calculs détaillés à la section 2.8.
   NOTE: Dans les deux cas (ce est à dire, les titres d'entrée et de sortie phages, la comparaison avec le nombre de colonies à la fois sur la tétracycline (cel totalel Numéro) et à la kanamycine (phage auxiliaire titre) peuvent également être informatif.

Résultats

Le protocole décrit ci-après a été utilisé pour isoler des fragments d'anticorps à une variété de deux domaines antigéniques structurellement et fonctionnellement liées à partir de banques combinatoires de phages de Fab en parallèle. Les problèmes liés à la disponibilité de l'antigène peuvent être contournés, dans de nombreux cas, par l'identification in silico des domaines antigéniques exprimables qui sont appropriés pour la sélection ²³ d'anticorps. En couplant l'expression d'antigènes à la sélection d'anti...

Discussion

Lors de la conduite dans les sélections d'anticorps in vitro, les deux principaux déterminants de la réussite de sélection sont: 1) l'isolement des cibles antigéniques bien pliés de sélection sur et 2) la disponibilité d'une bibliothèque d'anticorps de la diversité fonctionnelle élevée. Dans de nombreux cas, la disponibilité de quantités suffisantes de bien plié, protéine de pleine longueur peut être un facteur limitant. Une approche pour surmonter cette limitation est d'utiliser de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MATÉRIAUX
Nouveau-Brunswick Innova44 agitateur d’incubateur empilable	Eppendorf	M1282-0004
Liquidator 96 canaux système de pipetage manuel de paillasse	Anachem Ltd	LIQ-96-200
Agitateur de microplaques	VWR	12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 centrifugeuse de paillasse	Thermo Product
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer	Biotek	ELX405USD
Robot de sélection automatisée de phages à haut débit personnalisé	S& P Robotics
Tube Falcon conique en plastique : 50 ml	VWR	21008-178
Tube Falcon conique en plastique : 15 ml	VWR	89039-668
Tubes microcentrifuges Axygen 1,7 ml	Corning	MCT-175-L-C
Plaque Maxisorp 96 puits/384 puits	Sigma	M9410-1CS
Corning Bloc à puits profonds à fond en V 96 puits	Corning	3960
Axygen Mini-tube 96 puits microplaque stérile boîte bleue	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
Film d’étanchéité de plaque adhésive respirante	VWR	60941-084
RÉACTIFS Nom	Entreprise
polyéthylène glycol	Bioshop	PEG800.1
extrait de levure	Bioshop	YEX401.1
bio-tryptone	Bioshop	TRP402.1
N-Z amine	Sigma	C7290
glucose	Sigma	G8270-1KG
lactose	Bioshop	LAC234
glycérol	Bioshop	GLY001.500
carbénicille  ;	Bioshop	CAR544.10
kanamycine	Bioshop	KAN201.25
tétracycline  ;	Bioshop	TET701.25
Tween 20	Bioshop	TWN510.500
monobasique phophe de potassium	Bioshop	PPM302.1
phosphate de sodium dibasique	Anachemia	84486-440
chlorure de sodium	Bioshop	SOD001.10
chlorure de potassium	Bioshop	POC308.1
chlorure de calcium		Bioshop CCL302.500
sulfate de magnésium	EMD	MX0070-1
chlorure de magnésium	Bioshop	MAG510.500
NH4Cl	Amresco	0621-1KG
Na2SO4	Bioshop	SOS513.500
gélose	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe Coloration au gel d’ADN	Invitrogen	S33102
acide phosphorique	Acros Organics	201140010
lysozyme	Bioshop	LYS702.25
benzonase	Novagen	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
cocktail d’inhibiteurs de protéase comprimés	Roche	11 836 170 001
Résine Ni-NTA  ;	Qiagen	1018240
1 000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage par ml)	NEB	N0315S
HRP anticorps conjugué spécifique de M13 (anti-M13-HRP).	GE Healthcare	27-9241-01
Substrat TMB : mélanger des volumes égaux de substrat TMB et H2O2 suboxydase  ;	KPL	50-76-00
dNTPs	Biobasic	DD0056
Taq polymérase	Genscript	E00007
Exonucléase	GE Healthcare  ;	EZ0073X-EZ
Crevette phosphatase alcaline	GE Healthcare	E70092Z-EZ