Denne artikkelen beskriver en metode for å generere kimære embryoer som er utformet for å teste artsspesifikke bidrag fra neural crest og / eller andre vev til kraniofaciale utvikling.
Den generasjonen av kimære embryoer er en utbredt og kraftfull tilnærming til å studere celle skjebner, vev interaksjoner, og artsspesifikke bidrag til histologiske og morfologiske utviklingen av virveldyr embryoer. Spesielt har anvendelse av kimære embryoer etablerte viktigheten av neural crest i regi artsspesifikke morfologi av craniofacial kompleks. Metoden er beskrevet i dette dokumentet benytter to fuglearter, andebryst og vaktel, med bemerkelsesverdig annerledes craniofacial morfologi. Denne metoden blir enklere etterforskningen av molekylær og cellulær regulering av artsspesifikke mønster i kraniofaciale kompleks. Eksperimenter i vaktel og anda kimære embryoer har allerede avslørt neural crest-mediert vev interaksjoner og celle-autonom atferd som regulerer artsspesifikk mønster i kraniofaciale skjelett, muskulatur, og integument. Det store mangfoldet av neural crest derivater antyder betydelig potensialfor fremtidige anvendelser av vaktel-ande chimeriske systemet til å forstå vertebrate utvikling, sykdom og evolusjon.
Ansikts skjelett utvikler seg fra vekst og fusjon av flere ansikts prosesser som er sammensatt av neural crest og mesodermal mesenchyme omgitt av ectodermal og endodermal epiteliale lag 1-11. Morphogenetic hendelser innen hver prosess er styrt av forskjellige signal interaksjoner mellom mesenchyme og omkringliggende epithelia 12-16. Endringer i disse signal interaksjoner og / eller deres nedstrøms effektbokser bidrar til sykdoms fenotyper og kan også være relevant for utviklingen av kraniofaciale skjelett 17, 18. Derfor belyse timing og natur vev interaksjoner har et stort potensial til å øke vår forståelse av utviklingsmessige og evolusjonsbiologi av ansikts skjelett.
Bruken av kimære embryoer å undersøke vev interaksjoner har en lang historie i utviklingsbiologi. Denne tilnærmingen ble utviklet av Hans Spemann og hans labsom oppdaget embryonale "arrangørene" ved å transplantere vev mellom embryoer fra ulike amfibier. Spemann var en mester i mikro-kirurgiske teknikker som hånd-ferdigheter ble supplert med hans utvikling av spesialiserte verktøy, særlig Spemann pipette. Viktor Hamburger var en graduate student i laboratoriet av Hans Spemann i Freiburg i løpet av 1920, som er når de opprinnelige transplantasjon eksperimenter som ledet til Spemann Nobels fredspris ble utført. Når Hamburger flyttet til i St. Louis Washington University i 1935, detaljerte han prosessen med å lage en Spemann micropipette i hans Manual of Experimental Embryology 19. Drew Noden var en graduate student i Hamburger laboratorium ved Washington University til 1972. Etter å ha flyttet til University of Massachusetts, Amherst og deretter til Cornell University, Noden fortsatte fabrikkere og hjelp Spemann mikropipetter for sine kirurgiske transplantasjoner involverer vaktel-chick chimeras. &# 160;. Mens en graduate student, en av forfatterne (Rich Schneider) trente med Drew Noden ved Cornell 1995-1998 Følgende protokoll for å lage en Spemann micropipette er basert på beskrivelser som er skrevet av Hamburger og Noden, og omfatter etterfølgende endringer gjort av Schneider.
Bruken av vaktel-chick chimeras for studiet av kraniofaciale utvikling og spesielt for å forstå bidragene fra neural crest cellene ble utviklet av Noden og ved Le Douarin i 1970-årene, anmeldt i Le Douarin et al 20. Denne tilnærmingen har vært bredt vedtatt i mange studier og ved en rekke andre etterforskere 1, 4, 5, 21-38. De tilsvarende tallene for vekst og morfologi av vaktel og dama gjør transplantasjoner i dem ideelle for studier av celle skjebne og avstamning sporing. Imidlertid, på grunn av likhetene mellom vaktel og kylling, morfologiske endringer indproduseres av skipsdonorceller er vanskelige å tyde. I motsetning til dette har andre fugle kimære systemer inkludert innenlands anda som en måte for å studere mekanismene som gjør embryoer anatomisk forskjellig 39-50. Mer spesifikt gir den vaktel-ande chimeriske system flere fordeler for kresne virkningene av donor på verten, og vice versa. Først, vaktel og anda embryoer er distinkt i kroppsstørrelse og form, noe som gir en direkte måte å utforske donor-eller vertsspesifikke mekanismer av mønsterdannelse ved å analysere for differensial domener av genekspresjon (Figurene 1 A og B). For det andre, vaktel og anda embryoer har vesentlig forskjellige priser av modning, med vaktel klekking i 17 dager og duck klekking i 28 dager. Transplantert neural crest opprettholder sin iboende modningshastighet i vertsmiljøet, og dermed er det mulig å identifisere tidsmessige endringer i genekspresjon, vev-vekselvirkninger, histogenesis og morphogenesis51-57. Til slutt, den anti-vaktel atom antistoff (Q ¢ PN) kan donor-og vertcelle bidrag til å være permanent skilles fra hverandre ved å gjenkjenne et protein som er ubikvitært uttrykt i vaktel-celler, men fraværende fra ande celler.
Neural crest er en forbigående embryonale cellepopulasjon som vandrer mye i hele embryo og skiller i ulike celletyper, inkludert chondrocytes og osteoblaster, som bidrar til kraniofaciale skjelettet. Transplantere neural crest i vaktel-duck kimert systemet har bidratt sterkt til vår forståelse av vev interaksjoner og signalveier som regulerer utviklingen av kraniofaciale skjelettet. Men gitt det store potensialet av neural crest til også generere glatte muskelceller, fettceller, melanocytter, Schwann celler og nevroner, har vaktel-duck chimera system enormt potensial for fremtidige anvendelser, spesielt i forbindelse med den raske utviklingen av stamcellebiologi og regenerativ medisin. Siden vaktel og anda er både kommersielt avlet arter, en klar tilførsel av relativt billig befruktede egg er tilgjengelig fra en rekke gårder. Derfor bør denne teknikken være tilgjengelig for researchennes opererer innenfor et bredt spekter av budsjetter og anlegget plass.
Selv om denne teknikken er veldig kraftig, er det fortsatt flere begrensninger. Som andre kirurgiske teknikker, kvalitet og levedyktigheten til vaktel-duck chimeras stole på de kirurgiske ferdigheter av forsker, og derfor vil det være mer inter-og intraindividuell variasjon mellom eksperimenter som sammenlignet med andre modeller, slik som de benytter mus genetikk. Videre er det også variasjoner i satsene for utvikling og fasene av de enkelte embryoer som bidrar til reproduserbarhet og suksessen til hver transplantasjon. Avian embryoer er også svært utsatt for dehydrering og derfor kritiske trinn i løpet av kirurgi inkluderer holde lysnivåer lav, den gang under mikroskopet til et minimum, eggene forseglet med tape så mye som mulig, og høy luftfuktighet i den postoperative kuvøse til unngå uttørking.
I form av levedyktighet av chimeras, usually mellom 50-75% overlever, selv om disse prosentsatsene kan redusere den eldre samlingen scenen. I en typisk 4-6 timers sesjon for kirurgi, kan en erfaren kirurg generere 10-15 chimeras. Suksessen med transplantasjoner avhenger også i stor grad av kvaliteten av verktøyene. Gode verktøy føre til mer konsistente, reproduserbare resultater. Ved hjelp av en propanbrenner for å gjøre tungsten nåler gir utrolig skarpe nåler til å bli gjort. Typen av brenneren anvendes har stor betydning fordi den bestemmer størrelsen på flammen. Elektrolytisk skarphet kan også brukes, men denne tilnærmingen ikke engang komme i nærheten av å produsere nåler så skarp. Bruk wolfram stenger i stedet for spolet tråd, slik at nålene kan gjøres direkte.
Den Spemann mikropipette, mens tidkrevende og vanskelig å lage, er et ideelt instrument for tissue transfer. Pipetten kan tilpasses med forskjellige størrelser åpninger, og kan anvendes gjentatte ganger. En kritisk faktor for usinga Spemann mikropipette er å ha noen væske i pipetten før berøring spissen til overflaten av embryoet. Noe av fluidet vil alltid strømme ut når det kommer i kontakt med menisk over fosteret. Ved å trykke på membranen tillater fluid og transplantat-vev som skal mates ut med stor presisjon, mens lett lar seg på membranen suger forsiktig donor graft vevet inn i pipetten. Å opprettholde en litt positivt trykk på membranen holder donor graft vev på spissen av pipetten under overføring, og en liten ekstra trykk mot membranen kan donor graft vevet som skal med hensikt plassert i verten.
For beskyttelse av Spemann pipette under lagring og sterilisering, fjerne pære fra den brede enden og forsiktig sette inn konisk spiss inn i pære. Plasser Spemann pipetten i et glass prøverør, dekk toppen med aluminiumsfolie, og autoklav før operasjonen. Etter flere pipetter er reAdy skal steriliseres på nytt for kirurgi, invertere pipetter, varme dem nær ved å koke i den samme oppløsning av destillert vann og glass vaskemiddel, og deretter skylles flere ganger med destillert vann. Autoclave pipetter i sine individuelle rør. Den gummislangen som danner membranen og gummi pære bør skiftes etter flere steriliseringer eller når de blir formørket og stiv.
Mange av komponentene i denne protokollen medføre farlig utstyr. For eksempel, prosedyren for å lage en Spemann Mikropipette omfatter tre typer flammer samt oppvarming, trekking, blåser, bøying, kapping, og polering glass. Derfor, iført riktig personlig verneutstyr (PVU) som øker sikkerheten som briller og en labfrakk er kritisk. I tillegg, fordi mange mennesker lider av, eller har potensial til å utvikle, eggallergi, bruk alltid hansker ved håndtering av egg. Med disse forholdsreglene i bakhodet, vaktel-duck kimert system iSA trygg, effektiv og relativt tilgjengelig metode som har mange fremtidige søknader.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en National Institute of Dental og kraniofaciale Research (NIDCR) F32 stipend (DE021929) til JLF og en NIDCR R01 stipend DE016402 til RAS
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |