Article de méthode

Imagerie en temps réel de l'unité d'ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

DOI :

10.3791/51544

⸱

6 août 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Balises bimoléculaires Ratiométrique (de RBMBs) peuvent être utilisés pour une seule image transcrits d'ARN modifiées dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation et la purification de RBMBs, livraison de RBMBs dans les cellules par microporation et l'imagerie de fluorescence de transcrits d'ARN simples en temps réel.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prise de conscience croissante que le règlement de temporelle et spatiale de l'expression du gène peut avoir des conséquences importantes sur la fonction cellulaire a conduit au développement de diverses techniques de visualiser des transcrits d'ARN dans les cellules individuelles de vie simples. Une technique prometteuse qui vient d'être décrite utilise une sonde à base d'oligonucléotide-optique, ratiométrique balise bimoléculaire (RBMB), pour détecter des transcrits d'ARN qui ont été modifiées pour contenir au moins quatre répétitions en tandem de la séquence cible d'RBMB dans la région 3 'non traduite. RBMBs sont spécifiquement conçus pour émettre un signal fluorescent lumineux par hybridation à l'ARN complémentaire, mais autrement, restent éteints. L'utilisation d'une sonde synthétique dans cette approche permet photostable, décalé vers le rouge, et des colorants organiques fortement émissifs à être utilisé pour l'imagerie. La liaison de plusieurs RBMBs les ARN transcrits les résultats d'ingénierie dans les points de fluorescence discrets lorsqu'on les examine sous un microscope à fluorescence à champ large. Par conséquent, le mouvement de transcrits d'ARN individuels peuvent être facilement visualisées en temps réel en prenant une série temporelle d'images fluorescentes. Nous décrivons ici la préparation et la purification de RBMBs, la livraison dans les cellules par microporation et vivons-cellule imagerie de transcrits d'ARN simple.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'expression et la régulation des transcrits d'ARN est un processus complexe et dynamique qui est en grande partie responsable de contrôler le comportement des cellules et sort. Bien que l'importance de l'ARN dans la fonction des cellules dicter est connue depuis un certain temps, il est souvent difficile d'établir des liens clairs entre les deux puisque la plupart des outils d'analyse de l'ARN n'ont pas la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour capturer les événements réglementaires importants tels que la transcription éclatement, de l'ARN la traite, et le traitement de l'ARN localisée. Cela a conduit à l'apparition de plusieurs techniques qui permettent de transcription d'ARN différents à être visualisés dans des cellules vivantes en temps réel 1. Peut-être le plus important de ces techniques utilise une protéine de fusion GFP-MS2 à l'ARN cible qui a été modifié pour contenir des répétitions en tandem du site de liaison de MS2 dans la 3'-UTR de 2,3. En apportant de multiples molécules de GFP en proximité, transcrits d'ARN individuelles apparaissent comme des taches fluorescentes brillantespar microscopie de fluorescence. Le système GFP-MS2 a fourni un aperçu sans précédent sur ​​le comportement de l'ARN, y compris la visualisation directe et mesures de transcription éclatement 4,5, la détection de la localisation et de la transformation 6-9 uniques sub-cellulaire et l'imagerie en temps réel du transport de l'ARN 10. Cependant, en dépit de l'énorme potentiel du système GFP-MS2, des protéines de fusion GFP-MS2 non liés peuvent créer un signal fluorescent de fond élevé qui limite la polyvalence et la gamme dynamique de cette technique. Plusieurs approches ont été développées pour limiter ce signal de fond, y compris le cloisonnement subcellulaire de la GFP-MS2 non lié 10, fragment de protéine complémentation 11, et des protéines de liaison d'ARN et d'autres cibles 12. Cependant, toutes ces approches restent sensibles à l'expression relative et totale de l'ARN cible et GFP-MS2 protéine de fusion.

A titre d'unLTERNATIVE aux systèmes GFP-MS2, les balises moléculaires ont également été utilisées pour détecter des transcrits d'ARN modifiées avec des répétitions en tandem du site de liaison complémentaire à l'extrémité 3 'UTR 13,14. Les balises moléculaires sont des sondes oligonucléotidiques formant épingle à cheveux qui sont marqués à une extrémité avec un agent d'extinction et à l'autre extrémité avec un rapporteur fluorescent. Quand il n'est pas lié à l'ARN cible le rapporteur fluorescent et un extincteur rester à proximité, ce qui entraîne un état de faible fluorescent. Lors de l'hybridation, le rapporteur fluorescent et extincteur sont écartées et la fluorescence est rétabli. Similaire au système GFP-MS2, la liaison de balises moléculaires multiples sur un seul résultat de la transcription de l'ARN dans un endroit lumineux fluorescent qui peut être identifiée par microscopie à fluorescence; cependant, la fluorescence de fond devrait être beaucoup plus faible, en raison de la configuration de trempe balises moléculaires non liés. Malheureusement, malgré le mécanisme d'activation intelligente qui est incorporé dans la mconception de balise olecular, il ya maintenant plus de preuves que non hybridée balises moléculaires ne restent pas dans la conformation en épingle à cheveux lorsqu'il est introduit dans des cellules vivantes. Par conséquent, ils génèrent un signal de faux-positifs, qui réduit de manière significative le rapport signal sur fond. Pour pallier cet inconvénient, nous avons récemment développé une nouvelle sonde de synthèse de l'ARN d'imagerie des cellules vivantes, balises bimoléculaires ratiométriques (RBMBs; Figure 1A) 15,16. RBMBs sont composées de deux brins d'oligonucléotides 2'-O-méthyle qui forment une structure hybride avec des caractéristiques à la fois de l'ARN court en épingle à cheveux (shRNA) et des balises moléculaires. Le mécanisme d'activation de la boucle et la fluorescence est similaire à la balise moléculaire, tandis que le long double brin domaine avec un surplomb en 3 'UU est plus caractéristique des shRNA. Les caractéristiques shRNA sont conçus pour conduire l'exportation nucléaire, que nous avons trouvé une augmentation vie intracellulaire de> 24 h, à la dégradation observable minimale, etempêche l'ouverture non-spécifique de la boucle. En conséquence RBMBs présentent un fond signal-significativement plus élevé que les balises moléculaires.

Il est à noter que RBMBs ne peut être préparé en utilisant des oligonucléotides d'ADN, puisque les sondes à base d'ADN ne possèdent pas les mêmes capacités d'exportation nucléaires que des sondes à base d'ARN. Structurellement, la boucle de RBMB est généralement conçue pour être comprise entre 15 et 21 bases de long, à créer un équilibre entre la spécificité et la sélectivité de l'hybridation sur l'ARN. La tige courte qui se forme à partir de deux domaines auto-complémentaires est généralement conçu pour être quatre bases. Si une tige plus longue est choisie, le taux d'hybridation entre la boucle de RBMB et l'ARN cible est significativement ralentie 17,18. A l'inverse, quand une séquence de tige plus courte est sélectionnée, la température de fusion est souvent trop faible pour maintenir la structure tige-boucle à 37 ° C, conduisant à un signal de fond élevé. La spécificité de la RBMB est également rougeuced que la longueur de la tige est raccourcie. Depuis la séquence de la tige-boucle de RBMB peut également influer sur les performances de RBMB, il doit être soigneusement sélectionné 19. En particulier, les séquences de boucle idéal devrait avoir une structure secondaire minimale, s'hybrider à des séquences d'ARN avec une structure secondaire minimale, d'éviter les sites de liaison de protéines, et éviter hors cible de liaison. Prédictions des deux RBMB et structure secondaire d'ARN peuvent être obtenues en utilisant un logiciel tel que mfold 20. Sites complémentaires hors-cible peuvent identifiés à l'aide d'un nucléotide base locale Affectation outil de recherche (BLAST). Cependant, en raison d'incohérences dans les prédictions du modèle et de la difficulté à identifier les sites de protéines Biding, la spécificité de tous les RBMBs doit finalement être validée expérimentalement.

Si on le souhaite, un colorant de référence non éteint qui est insensible à l'état d'hybridation peut être ajouté à la RBMB 15. L'addition d'un colorant de référence peut prOvide un marqueur pour la livraison de la sonde et être utilisés pour l'imagerie ratiométrique, si des mesures plus précises de fluorescence cellulaire total sont nécessaires. Les colorants de référence permet d'ajuster les mesures de différences de fond dues aux variations de cellule à cellule dans la livraison. Cependant, lors de l'imagerie de l'ARN transcrits colorant individuel de référence n'est pas nécessaire. Notamment, certains colorants de référence peuvent interférer avec l'exportation de RBMBs à partir du noyau, ce qui conduit à un signal d'arrière-plan légèrement plus élevée dans le noyau.

Lorsqu'ils sont bien conçus, RBMBs peuvent être utilisés pour l'image des transcrits d'ARN dans les cellules individuelles de vie simples, si l'ARN cible est conçue pour contenir au moins quatre sites de liaison de RBMB (figure 1B) 16. RBMBs peuvent être efficacement délivrés dans une large gamme de types de cellules par l'intermédiaire de microporation, avec peu ou pas d'effet sur ​​la viabilité des cellules 21, et des mesures quantitatives de l'expression de gènes peuvent êtreacquis dans les 30 minutes. De plus, la méthode est assez peu sensible à des niveaux de concentration de RBMB et ARN cible, étant donné que la fluorescence de RBMBs non liés est efficacement stoppée. Ici, nous fournissons une description détaillée de la méthodologie utilisée pour préparer et purifier RBMBs, ainsi que d'un mode opératoire général pour la prestation de RBMBs en cellules vivantes par microporation et l'imagerie des transcrits d'ARN simples en temps réel.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, un oligonucléotide (RBMB1) a été marquée à son extrémité 5 'avec un colorant rapporteur CF640R et a la séquence: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3'. domaines auto-complémentaires, qui déterminent la formation de la structure en épingle à cheveux, sont en caractères gras. Le deuxième oligonucléotide (RBMB2) a été marqué à l'extrémité 3 'avec un extincteur Noir Iowa RQ-Sp et a la séquence: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.

1 Préparation de RBMBs

  1. Effectuer une rotation rapide des tubes contenant les RBMB1 et RBMB2 oligonucleotides, afin d'assurer l'oligonucléotide est séché à la partie inférieure du tube, et remettre en suspension dans l'eau et de la DNase exempte de RNase à une concentration finale de 100 uM. Par exemple, un échantillon de 10 nmoles de l'oligonucléotide doit être remis en suspension dans 100 ul d'eau.
  2. Measure de la concentration exacte des échantillons de RBMB1 RBMB2 licence et par spectroscopie UV-vis.
    1. Mélanger 3 pl de l'échantillon de RBMB avec 117 ul de DPBS (sans calcium et magnésium) dans un microtube de centrifugation.
    2. Blank spectrophotomètre avec du DPBS et mesurer l'absorbance de 200 à 800 nm. Note: Pic absorbances à 260 nm et 650 nm doit être visible.
    3. Calculer la concentration des stocks des échantillons de RBMB basées sur l'absorbance à 260 nm (ou 650 nm pour RBMB1), en utilisant l'équation:
      Stock Concentration (M) = A 260 * facteur de dilution / coefficient d'extinction où A 260 est l'absorbance à 260 nm et le facteur de dilution est de 40.
      Remarque: Le coefficient d'extinction pour la RBMB se trouve sur la fiche technique fournie par le fabricant d'oligonucléotides. Le coefficient de CF640R d'extinction à 650 nm est 103000.
  3. Mélanger 20 pi de 100 uM RBMB1, 30 pl de 100 uM RBMB2, 6 pi 10x, Un tampon de phosphate (10x tampon phosphate 480 mM, K 2 HPO 4, 45 mM de KH 2 PO 4, 140 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) et 4 ul d'eau et de la DNase sans RNase. Incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 min. Note: Ceci est généralement suffisante pour environ 50 études.
  4. Préparer une colonne de chromatographie liquide en utilisant 75 Superdex qualité prép pour éliminer tous les oligonucléotides non hybridés RBMB2. Utiliser un 8 ml (0,7 x 20 cm) de colonne de chromatographie en phase liquide avec un volume de ~ 4 ml de lit de purifier le petit volume de sondes mixtes.
  5. Laver et s'équilibrer avec la Superdex ~ 50 ml de tampon phosphate de 1x en utilisant une pompe de seringue en cours d'exécution à un écoulement à un débit de 0,6 ml / min. Avant tout le fluide pénètre dans le volume du lit, arrêter la pompe de la seringue, retirez-le, et laissez le liquide restant passent par la colonne par gravité.
  6. Charger le mélange RBMB (60 pl) sur la colonne de chromatographie.
    1. Après que l'échantillon de RBMB a complètemententrée dans le lit, ajouter lentement encore 250 ul de tampon phosphate de 1x à la partie supérieure du lit de sorte que tout l'échantillon soit complètement entré dans la colonne.
    2. Remplir la colonne de la jante avec un tampon de phosphate 1x. Fermer le haut, et démarrer la pompe de la seringue - la seringue doit être rempli avec ~ 50 ml PBS 1x et de fonctionner à un taux de 0,6 ml / min.
    3. Une fois que le RBMB se rapproche de la partie inférieure de la colonne - l'échantillon de RBMB peut généralement être facilement visualisé en raison de la couleur du colorant incorporé dans la sonde - recueillir le flux continu à deux gouttes par microtube (1,5 ml). Arrêter la collecte de l'échantillon, une fois la couleur dans les microtubes devient clair.
  7. Mélanger les tubes contenant l'échantillon de RBMB couleur - généralement 5-6 tubes - et charger dans un dispositif de filtre centrifuge (10 000 MW de coupure). Centrifuger l'échantillon à 10 000 RCF pendant 20 min ou jusqu'à ce que le volume désiré. Remarque: Ces vitesses et les durées généralementobtenir un volume final de 30 ul ~.
  8. Mesurer la concentration exacte de l'échantillon de RBMB purifié par spectroscopie UV-Vis.
    1. Prendre 3 ml de l'échantillon de RBMB concentrée et mélanger avec 117 DPBS ul dans un tube à centrifuger.
    2. Blank spectrophotomètre avec du DPBS et mesurer l'absorbance de 200 à 800 nm. Note: Pic absorbances à 260 nm et 650 nm doit être visible.
    3. Calculer la concentration de l'action de la RBMB hybride basé sur l'absorption à 650 nm, en utilisant l'équation:
      Stock Concentration (M) = A 650 * facteur de dilution / coefficient disparu où A 650 est l'absorbance à 650 nm, le facteur de dilution est de 40.
      Remarque: Le coefficient d'extinction pour CF640R à 650 nm est de 103.000 et le coefficient d'extinction pour l'Iowa noir RQ est ~ 20000. Les coefficients d'extinction sont additives et ne sont pas sensibles à l'hybridation. Par conséquent, l'échantillon de stock RBMB a un coefficient d'extinction combiné de approximately 123 000 à 650 nm.
  9. Etiqueter le tube de façon appropriée avec le nom et la concentration et conserver à -20 ° C pour une utilisation future.

2 Préparation de poly-D-lysine couché 8 bien chambré lamelle couvre-objet

  1. Préparer une solution à 0,2 mg / ml de poly-D-lysine par dissolution de 5 mg de poly-D-lysine (poudre lyophilisée, g irradié) dans 25 ml d'eau stérilisée dans un environnement stérile.
  2. Ajouter 200 ul de l'/ ml de solution de poly-D-lysine 0,2 mg dans chaque puits d'une lamelle de 8 puits à chambre, dans un environnement stérile.
  3. Incuber à température ambiante pendant 16 à 18 heures sous la hotte de culture cellulaire.
  4. Aspirer la Poly-D-lysine et laver le bien 3 fois avec de l'eau distillée stérile. Remarque: Les diapositives de la chambre enrobés peuvent être conservés à 4 ° C.

3 Sonde livraison

Remarque: Le système cellulaire utilisé doit contenir un gène chimère intégré qui exprime l'ARN avec au moins 4 séquentielle bindtion des sites pour la RBMB dans la région 3 'non traduite (UTR). Les séquences cibles doivent être complémentaires à la boucle de la RBMB. Il est conseillé que comme contrôle négatif, la même lignée de cellules est conçu pour exprimer la même construction génétique, mais sans les répétitions en tandem. Dans ce protocole, une lignée cellulaire de fibrosarcome humain HT1080, a été modifiée pour exprimer l'ARN de GFP avec 96 répétitions en tandem de la séquence cible d'RBMB dans la 3'-UTR. La lignée cellulaire de commande a été conçu pour exprimer un ARN de GFP de type sauvage.

  1. cellules de plaque dans une fiole de T25 à 40-50% de confluence un jour avant la livraison de la sonde. Culture des cellules avec du milieu DMEM supplémenté avec 1% de pen / strep et 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  2. Le lendemain, allumer le microporateur et configurer les paramètres de microporation à 950 V, 2 impulsions, 25 ms. Note: Ces paramètres ont été optimisés pour les cellules HT1080, mais ils sont d'un type cellulaire dépendante et peut être adjusted pour d'autres types de cellules comme décrit dans les instructions du fabricant.
  3. Remplir le tube de microporation avec 4 ml de tampon électrolytique et placez-le sur la station de microporation.
  4. Sortez le stock échantillon de RBMB purifié et dégivrer. Diluer plusieurs microlitres à une concentration finale de 12 uM avec du tampon phosphate de 1x. 1 ul sont nécessaires pour chaque microporation.
  5. Introduire à la pipette 1 ml de milieu de culture avec du FBS, sans antibiotiques, mais dans un tube à centrifuger. Remarque: Il sera utilisé pour les cellules en suspension immédiatement après microporation et peut être annulée, à proximité du dispositif de microporation, pour le moment. L'inclusion d'antibiotiques dans les milieux de culture diminue la viabilité des cellules après microporation.
  6. Retirer les milieux de culture cellulaire à partir des cellules HT1080 modifiées (60-80% de confluence), laver les cellules avec 1 ml de Ca2 + et Mg2 + Les DPBS -Free une fois, et on incube avec 1 ml de trypsine pendant 1-2 min.
  7. Arrêtez le trypsinization en ajoutant 1 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, des antibiotiques et sans rouge de phénol, et transférer les cellules dans deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation.
  8. Centrifuger les cellules dans le tube à centrifuger à 200 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant, remettre en suspension et mélanger les culots de cellules dans un volume final de 1 ml de DPBS.
  9. Prenez 10 ul de la suspension cellulaire bien mélangé et compter les cellules.
  10. Introduire à la pipette les cellules de haut en bas plusieurs fois pour s'assurer qu'ils sont bien dispersés et transférer 300 000 cellules avec DPBS dans un nouveau tube de 1,5 ml et centrifuger à 200 g pendant 5 min.
  11. Eliminer le surnageant, en faisant attention de ne pas perturber le culot cellulaire. Reprendre le culot dans 11 ul de tampon de remise en suspension et la pipette de haut en bas plusieurs fois pour s'assurer que les cellules sont bien dispersées. Veillez à ne pas générer des bulles d'air. Remarque: Les bulles d'air vont provoquer une étincelle pendant microporation et aboutir à la livraison de RBMB pauvres et la mort cellulaire.
  12. Ajouter 1 pl de la RBMB dilué (12 M) et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Encore une fois veiller à ne pas générer des bulles d'air.
  13. Aspirer 10 pl du mélange RBMB-cellule, à l'aide de la pipette de microporation, et insérer la pipette dans le tube de microporation. Appuyez sur le bouton start pour démarrer le microporation. Remarque: Il doit y avoir aucune bulle d'air visibles dans la pointe.
  14. Lorsque l'écran de la montre microporateur fin, retirer la pipette de la gare, expulser le mélange de 10 pi dans le tube à centrifuger qui a été préparé plus tôt, avec 1 ml de milieu de culture avec du FBS mais sans antibiotiques. Mélanger doucement en faisant basculer le tube d'un côté à côté à plusieurs reprises.
  15. Faites tourner les cellules à 200 g pendant 5 min et laver les cellules deux fois, dans 1 ml de phénol rouge milieu de culture sans FBS avec mais sans antibiotiques, pour enlever les RBMBs qui n'ont pas été livrés dans les cellules. Remettre en suspension avec 400 ul de phénol milieu de culture sans rouge avec du FBS mais sansantibiotiques.
  16. Plate cellules micropore dans la lamelle revêtue de 8 puits chambré à 200 ul par puits ou à la confluence souhaitée Poly-D-lysine.
  17. Facultatif: Si il est souhaitable de l'image du noyau, ajouter Hoechst 33342 à des cellules à une concentration finale de 0,01 mg / ml.
  18. Placez les lamelle chambré dans un incubateur de culture cellulaire. Incuber les cellules pendant 1-2 heures avant l'imagerie, de sorte que les cellules aient suffisamment de temps pour s'installer sur la surface de la lamelle. Remarque: L'imagerie peut être effectuée dès 30 min post-microporation.

4 Image Acquisition

  1. Allumer le système supérieur d'incubation en direct de l'étage de cellule et s'équilibrer jusqu'à ce qu'il atteigne 37 ° C, 5% CO 2 et 75% d'humidité.
  2. Allumez la source de lumière microscope et fluorescent et ouvrir le logiciel Metamorph. Remarque: Les autres logiciels similaires pour le contrôle de microscope et d'acquisition d'image peuvent également être utilisés.
  3. Appliquer de l'huile Immersol à l'objectif.
  4. Transférer la lamelle chambré avec des cellules micropore au système haut d'incubation en direct au stade de cellule. Incuber le système d'étape haut jusqu'à ce que la température et la concentration de CO 2 sont stabilisées.
  5. Ouvrez l'onglet Acquérir, dans le logiciel Metamorph. Cliquez sur le bouton Show Live de trouver le terrain, la mise au point sous une lumière blanche et cliquez sur le bouton Stop Live.
  6. Sous l'onglet Acquisition, cliquez sur le bouton et ouvrir de pop-up acquisition de flux, et de configurer les paramètres d'acquisition de films souhaités. Acquérir 150 images en utilisant le filtre Cy5 / CF640R et enregistrez les images sur le disque dur.

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Résultats

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Peu de temps après la microporation de cellules HT1080 en présence d'RBMBs, des transcrits d'ARN individuels qui ont été modifiés pour contenir de multiples sites de liaison de RBMB à leur extrémité 3 'UTR apparaissent des taches fluorescentes comme lumineuses lorsque imagé par l'ensemble du domaine de la microscopie à fluorescence (figure 2). Alors que les transcrits d'ARN individuelles avec les sites de liaison aussi peu que quatre de RBMB peuvent être visualisés dans les cellules vivantes, plus les s...

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Discussion

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La capacité d'une seule image de transcription d'ARN dans des cellules vivantes modifiées à l'aide d'un microscope à champ large classique nécessite un signal lumineux fluorescent et photostable à être associée à chaque produit de transcription d'ARN et un faible bruit de fond de fluorescence émanant de sondes fluorescentes non liés. Dans ce procédé, un signal lumineux fluorescent est obtenu par hybridation multiple (jusqu'à 96) des sondes fluorescentes à base d'oligonucléotides, à savoir...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Mark Behlke et le Dr Ling Huang sont employés par IDT qui offre des oligonucléotides à vendre proche de certains des composés décrits dans le manuscrit. IDT est, cependant, pas une société cotée en bourse et ils ne possèdent pas personnellement des actions / fonds propres dans IDT.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le Prix National Science Foundation CARRIÈRE (0953583) et l'Institut national de la santé NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Eau sans nucléasesLife TechnologiesAM9932sans DPBS traité DEPC
Technologies14190-144Sans Ca2+ et Mg2+
Cary 100 Spectrophotomètre UV-VisAgilent Technologies
Phosphate de potassium dibasiqueFisher ScientificP290-500
Phosphate de potassium monobasiqueFisher ScientificP284-500
Phosphate de sodium monobasiqueFisher ScientificS381-500
Tubes à microcentrifugerEppendorf223641111,5 ml
Colonne de chromatographieKimble Chase Life Science420400-07200,7 x 20 cm
Superdex 75 prep gradeGE healthcare17-1044-01
Pompe à seringueBraintree ScientificBS-300
SeringueBD30103560 ml, embout Luer-lok
Unités de filtration centrifugesMilliporeUFC501096MW 10 000
coupure Centrifugeuse 5418Eppendorf
Poly-D-lysineSigma-AldrichP7280-5MGpoudre lyophilisée, irradiée g
Verre de protection à 8 puitsFisher Scientific155409Volume de travail 0,2-0,5 ml
HT1080ATCCCCL-121Lignée cellulaire de fibrosarcome humain
Fiole de culture cellulaireCorning43063925 cm2
DMEMLife Technologies11965084DMEM à haute teneur
en glucose sans rouge de phénolTechnologies21063029
Sérum fœtal bovinSigma-AldrichF2442-500ML
Pénicilline/streptomycineLife Technologies15140122
TrypsineLife Technologies253000540,05 % Trypsine-EDTA
Système de transfection au néonLife TechnologiesMPK5000
Kit de système de transfection au néonLife TechnologiesMPK1096
HémacytomètreFisher Scientific02-671-10
Hoescht 33342Life TechnologiesH1399
IX-81 Microscope à fluorescence inverséeOlympus
SOLA light engineLumencor
MetamorphMolecular DevicesContrôle logiciel microscope
Immersol huile 518FFisher Scientific12-624-66B
Life Life à haute teneur en glucose

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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