Article de méthode

High Yield purification de

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DOI :

10.3791/51590

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17 juillet 2014

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1Division of Infection and Immunity, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2Department of Medical Biology, University of Melbourne

Dans cet article

Résumé

Fonction de mesure d'anticorps est la clé de la compréhension de l'immunité au paludisme à Plasmodium falciparum. Cette méthode décrit la purification de mérozoïtes viables, et la mesure de la phagocytose dépendante de l'opsonisation par cytométrie de flux.

Résumé

Plasmodium falciparum antigènes de mérozoïtes sont en cours de développement en tant que vaccins potentiels contre le paludisme. Un aspect de l'immunité contre la malaria est l'élimination des mérozoïtes libres du sang par les cellules phagocytaires. Cependant l'évaluation de l'efficacité fonctionnelle des anticorps spécifiques de mérozoïtes opsonisation est difficile en raison de la courte demi-vie de mérozoïtes et la variabilité des cellules phagocytaires primaires. Décrit en détail est ici un procédé pour générer des mérozoïtes viables en utilisant l'inhibiteur de la protéase E64, et un dosage de mérozoïte opsonin phagocytose dépendante en utilisant la lignée cellulaire pro-monocytaire THP-1. E64 empêche la rupture des schizontes tout en permettant le développement de mérozoïtes qui sont libérés par filtration de schizontes traités. Le bromure d'éthidium mérozoïtes marqués sont opsonisés avec des échantillons de plasma humain et ajoutés aux cellules THP-1. La phagocytose est évaluée par un protocole à haut débit normalisé. Mérozoïtes viables sont une ressource précieuse pour évaluer numeraspects UO de P. biologie falciparum, y compris l'évaluation de la fonction immunitaire. Les niveaux d'anticorps mesurés par ce test sont associés à l'immunité clinique de paludisme chez les individus exposés naturellement. Le dosage peut également être utile pour l'évaluation des anticorps induits par la vaccination.

Introduction

L'importance de l'anticorps de l'immunité au paludisme à Plasmodium falciparum a été montré il ya 40 ans, quand immunoglobulines des adultes hyperimmuns été transférés passivement aux enfants souffrant de paludisme grave entraînant une maladie allégé 1. Par conséquent, des efforts considérables ont cherché à identifier les cibles de l'immunité antipaludique de protection, la plupart du temps par la mesure des titres d'anticorps à des peptides ou des protéines exprimées par des bactéries par ELISA. Sérologie ELISA à base s'est également révélée très variable entre les études, et ne traite pas la fonctionnalité d'anticorps 2. De nombreux antigènes du paludisme induisent une IgG1 et IgG3 cytophile profil d'anticorps, en particulier les mérozoïtes antigènes de surface 3. Ce biais de la sous-classe indique que l'anticorps-récepteur Fc (FcR) les interactions avec les phagocytes sont importantes pour les fonctions effectrices des anticorps opsonisants antimerozoite 4. Plusieurs vaccins antigène mérozoïte en cours de développement sont conçus poursusciter des fonctions effectrices phagocytaires 5, 6 et bien des preuves significatives de l'importance des interactions anticorps-FcR dans des modèles de rongeurs paludisme existe 7-9, et quelques études récentes corroborent l'importance d'anticorps fonctionnels et fonctions phagocyte effectrices de l'immunité au paludisme chez l'homme 10, 11, ce domaine reste peu étudiée. Étude en anticorps spécifiques opsonisants mérozoïtes a été limitée par deux facteurs; la difficulté à isoler bonnes mérozoïtes de qualité; et les variables des réponses de phagocytose de cellules primaires.

Jusqu'à récemment, la centrifugation à grande vitesse ou de densité Percoll gradients ont été utilisés pour isoler les mérozoïtes de surnageants de culture de la rupture des schizontes cultures. Ces mérozoïtes étaient rarement viable, et souvent davantage manipulés par centrifugation de densité et lavage plusieurs étapes 12, 11 ou cryoconservation avant utilisation dans des essais. Ce processes potentiellement détachent de nombreuses protéines associées à la périphérie de la surface du mérozoïte, des protéines connues pour être des cibles antigéniques de l'immunité antipaludique 13. Récemment, le inhibiteur de la cystéine protéase trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E64) a été utilisé pour générer les mérozoïtes viables. E64 empêche la rupture des schizontes, générant membrane clos mérozoïtes 14, qui peut être perturbé par filtration pour libérer mérozoïtes viables 15, 16. Cette technique a conduit à la résolution spatiale de nombreuses protéines au cours de l'invasion des érythrocytes 15, 17 à 19 et a clarifié l'effet spécifique de la phase de plusieurs médicaments antipaludiques 16, 20. Toutefois, la génération de mérozoïtes viables demeure un défi technique. Pour aider à la diffusion de cette technique et l'application de tests fonctionnels de l'immunité, un protocole détaillé pour la purification des mérozoïtes viable et leur utilisation dans undosage fonctionnel standardisé de l'anticorps: la coopération cellulaire dans l'opsonisation et de la phagocytose est décrit ici.

Cette technique démontre une avancée significative par rapport analyses précédentes in vitro de mérozoïtes opsonisation, comme rafale neutrophiles respiratoire, dépendante des anticorps cellulaire Inhibition (ADCI), et d'autres essais mérozoïtes de phagocytose. Ces dosages sont peu reproductibles à cause de variations dans les entrées de parasites et l'activité des cellules phagocytaires primaires 11, 21. Hemozoin contamination peut également affecter profondément la fonction phagocytaire 22. Un essai de phagocytose mérozoïte robuste et reproductible récemment rapporté 23 utilise la lignée cellulaire promonocytaire THP-1 24. Il s'agit d'un type de cellule idéale pour des analyses de cytométrie de flux à haut débit car il est non adhérente et réalise Fc Receptor phagocytose médiée 25, 26 spécifiquement. Une complexité supplémentaire pendant investisseurstigating phagocytose est que le degré de la phagocytose est dépendante du nombre de mérozoïtes par rapport aux cellules THP-1 et la concentration plasmatique. Pour assurer la reproductibilité entre les expériences, les mérozoïtes doivent être énumérés et une concentration définie utilisés. En raison de leur petite taille, le débit quantification par cytométrie est nécessaire.

Le procédé décrit ici élimine hemozoin et génère des mérozoïtes viables, et décrit une application de ces mérozoïtes pour cytométrie en flux dénombrement des mérozoïtes suivie d'opsonisation et de la phagocytose. Bien que techniquement exigeante, les techniques décrites peuvent s'avérer utiles dans la compréhension de la contribution des réponses d'anticorps spécifiques de la surface des mérozoïtes de naturellement acquise et l'immunité induite par le vaccin.

Protocole

Remarque: Toutes les étapes, en plus de la centrifugation et la cytométrie en flux, doivent être effectuées à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire afin de maintenir la stérilité. Prendre les précautions appropriées sont prises concernant la manipulation des échantillons humains. Le test est très sensible pour de petites quantités de plasma. Les dilutions prévues sont optimales pour résoudre des réponses allant de 5 à 78% avec le plasma des enfants semi-immuns de la Papouasie-Nouvelle-Guinée (PNG). La dilution optimale peut varier selon les écrans plasma testés, et par conséquent, il est recommandé que le plasma est titré pour déterminer les conditions expérimentales pour chaque application. Assurer l'inclusion de deux contrôles négatifs cellules THP-1 avec mérozoïtes en l'absence de plasma; et cellules THP-1 avec mérozoïtes opsonisés avec un pool de plasma de paludisme naïfs. Ceci permettra de contrôler le respect des mérozoïtes de cellules THP-1 et pour permettre rigoureux cytométrie de flux de déclenchement d'événements de phagocytose.

L'utilisation d'échantillons de plasma était PNGapprouvé par le Comité consultatif de la recherche médicale, de la Papouasie-Nouvelle-Guinée ministère de la Santé, Walter et Eliza Comité hall Institut humain éthique de la recherche (numéro de projet 04/04). Consentement écrit a été obtenu des parents / tuteurs de tous les participants.

1. THP-1 Culture

  1. Maintenir la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 en milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% sérum de veau foetal (FCS) et 55 uM de 2-mercapthoethanol (THP-1 moyenne) et à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5%.
  2. Maintenir les cellules à une densité inférieure à 5 x 10 5 cellules / ml. NOTE: Prolifération se traduira par une différenciation en cellules adhérentes et la régulation négative de récepteurs Fc. Une fois les cellules ont été repiquées environ 10 fois, décongeler un nouveau flacon pour maintenir le phénotype cellulaire.

2. Préparation de l'échantillon d'anticorps et de dilution

  1. Chaleur inactiver le plasma à tester et le paludisme naïfs contrôle plasma par incubation à 56 °; C pendant 30 minutes
  2. Diluer en série des échantillons de plasma à 1/2, 000 THP-1 moyen.
  3. Plasma magasin dilué à -20 ° C.

3. Culture de très synchronisée P. falciparum

NOTE: La ligne de parasite exprimant la GFP D10-PfPHG 27 avait été utilisée en raison de son cycle de vie 48 heures qui assiste la synchronisation des parasites et le moment de l'addition contrôlée E64. En outre, parce que cette ligne exprimant la GFP dans le cytosol, cette ligne permet la détection de la parasitémie et mérozoïtes libres par la détection par cytométrie en flux de la GFP. Cependant, l'intensité de fluorescence de la GFP n'est pas suffisante pour assurer une visualisation à l'intérieur de cellules THP-1 et, par conséquent, les mérozoïtes sont contre-colorées avec le bromure d'éthidium (BET). D'autres souches du parasite peuvent être utilisées, à condition que la synchronie étanche est réalisable. Synchroniser les parasites en utilisant une combinaison de sorbitol traitement pour lyser les formes matures 28 et de l'héparine pour inhiber l'invasion 15 .

  1. Maintenir P. falciparum parasites en O + erythrocytes humains (RBC) à 3% d'hématocrite dans un milieu RPMI-1640 (pH 7,4) supplémentée avec 25 mg / ml d'HEPES, 50 ng / hypoxanthine ml, 10% de sérum humain regroupé, 2 mg / ml de bicarbonate de sodium, et 20 ug / ml de gentamycine (milieu de parasite). Ajouter 5 mg / ml de blasticidine S-chlorhydrate dans le milieu de culture pour sélectionner des parasites GFP +.
  2. Incuber les cultures à l'air boîtes étanches ou des flacons de culture alternative à double scellées à 37 ° C dans une atmosphère de 1% O 2, 4% de CO 2 et 95% de N 2.
  3. Préparer des lames de frottis minces, fixer à 100% de méthanol pendant 10 secondes, et la tache avec une solution de 10% de Giemsa à 6,7 mM (pH 7,1) de tampon phosphate (solution Giemsa) pendant 10 min pour contrôler la parasitémie. Après coloration, rincer la lame dans l'eau et sécher à l'air. Évaluer la parasitémie en utilisant une lentille 100X à immersion d'huile.
  4. Maintenir les cultures des parasites à une parasitémie inférieure à 5% RBC infecté en divisant les cultures et en ajoutant non infectéRBC selon les besoins.
  5. Pour synchroniser avec l'héparine, ajouter 20 UI / ml d'héparine de qualité médicale à sonner stade cultures.
  6. Lorsque la majorité des parasites sont au stade schizonte, un culot de cellules à 300 g pendant 5 min, éliminer le milieu contenant de l'héparine et remettre en suspension dans un milieu de parasite pour permettre schizonte rupture et l'invasion des mérozoïtes.
  7. Après 4 heures, ajouter 20 UI / ml d'héparine retour aux cultures, bloquant toute nouvelle invasion des mérozoïtes. NOTE: Plusieurs cycles de sorbitol et le traitement à l'héparine peuvent être nécessaires avant que les parasites sont suffisamment synchronisées. Pour générer un nombre adéquat de mérozoïtes, préparer 150 ml de culture de parasite de 3 - 5% parasitémie.

4. Isolation de Late Phase P. falciparum Trophozoïtes

  1. Trente-six heures après le retour de l'héparine de cultures, un culot de cellules cultivées à 300 g pendant 5 min, et remettre le culot en milieu de parasite à 25% d'hématocrite.
  2. Attacher une grande colonne magnétique (volume de la matrice de 6,3ml) à un aimant, et équilibrer la colonne avec du milieu de parasite, en s'assurant que toutes les bulles d'air sont éliminées.
  3. Ajouter le P. remis en suspension culture falciparum à la colonne, et régler le débit à une goutte par seconde.
  4. Une fois la culture a traversé la colonne, laver la colonne avec le milieu de parasite jusqu'à ce que le flux continu soit claire.
  5. Éluer les parasites provenant de la colonne dans 30 ml de milieu de 37 ° C parasite.
  6. Préparer un frottis mince de parasites, fixer à 100% de méthanol pendant 10 secondes, et tacher avec une solution Giemsa pendant 3 min. Examiner la lame sous le microscope, et veiller à ce que les parasites remplissent presque le globule rouge, et semblent être à des stades schizontes début. Si les parasites n'ont pas atteint le stade de maturation approprié, retourner parasites purifiés à un incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de 1% O 2, 4% de CO 2 et 95% de N 2 jusqu'au développé convenablement. REMARQUE: La pureté de plus de 90% des globules rouges infectés doit veiller à RBC Ne pas contaminer les préparations mérozoïtes.
  7. Traiter schizontes isolés avec 10 uM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E64) pour 6 - 10 h REMARQUE:. Plus longs temps d'incubation avec E64 sont possibles, mais les mérozoïtes produits ne seront plus invasive.

5. Isolement de P. falciparum mérozoïtes

  1. Après incubation avec E64, salir parasites, fixer les cellules dans 100% de méthanol, et la tache avec une solution de Giemsa à évaluer la formation de mérozoïtes membraneux. NOTE: Un bon rendement de mérozoïtes sera obtenu si plus de 50% des parasites ont formé membrane mérozoïtes clos.
  2. Schizontes Pellet E64-traitée à 1900 g pendant 8 min. Laver avec 50 ml de RT du milieu RPMI-1640 (pH 7,4) supplémentée avec 25 mg / ml d'HEPES, 50 ng / hypoxanthine ml, 2 mg / ml de bicarbonate de sodium, et 20 ug / ml de gentamycine (milieu de lavage) pour éliminer le restant du sérum humain .
  3. Remettre en suspension le culot dans 2 ml de milieu de lavage. REMARQUE: L'utilisation de FCS contenant THP-1 médias produira mousser lors de la filtration.
  4. Filtrer les 2 ml de remise en suspension E64-schizontes à travers un filtre à seringue de 1,2 μm/32 mm. Recueillir le filtrat dans un tube de 10 ml. NOTE: Le filtrat contient mérozoïtes et des cristaux de hémozoïne, avec schizontes et les débris de l'ONU-rupture recueillies dans le filtre.
  5. Fixez une petite colonne magnétique d'un aimant, et s'équilibrer avec 500 pi THP-1 moyen.
  6. Passer le filtrat sur la colonne magnétique. Recueillir l'écoulement. NOTE: hémozoïne va se lier à la colonne, tandis que les mérozoïtes vont passer à travers.
  7. Passez le flux continu sur la colonne deux fois de plus pour éliminer hemozoin, la collecte de l'écoulement à travers chaque fois.
  8. Rincer la colonne avec 2 ml de THP-1 RT moyen pour collecter des mérozoïtes restants.
  9. Ajouter BET à 10 pg / ml (concentration finale) et la tache pendant 30 min à température ambiante. Protéger de la lumière pour éviter photoblanchiment. Remarque: Veiller à ce que tout le liquide et p BET contaminésdéchets Lastic est évacué d'une manière appropriée pour les produits chimiques cytotoxiques. Mérozoïtes ne sont plus invasive la suite de cette incubation.
  10. Isoler mérozoïtes à 4000 g pendant 10 min.
  11. Rejeter le surnageant dans un contenant à déchets approprié.
  12. Reprendre mérozoïtes culot dans 4 ml THP-1 moyen, et centrifuger à 4000 g pendant 10 min.
  13. Ajouter THP-1 moyen jusqu'à un volume de 15 ml, et protéger de la lumière.

6. Quantification Merozoite Concentration par cytométrie en flux

  1. Apportez compter perles à RT.
  2. Préparer PBS avec 0,5% de BSA pour diluer les mérozoïtes.
  3. Comptez mérozoïtes à 3 dilutions; 1 à 100; 1 à 50 et 1 à 25. Préparer tubes 3 FACS avec 940, 930 et 910 pi de PBS 0,5% de BSA, respectivement. Ajouter 10, 20 et 40 pi de mérozoïtes purifiés par tube, respectivement.
  4. Vortex perles de comptage pour 30 secondes, et ajouter 50 ul de billes par tube FACS contenant les mérozoïtes dilué.
  5. Exécutez les trois dilbué échantillons de mérozoïtes sur un cytomètre de flux équipé d'un laser de 488 nm. Définir une grille rigoureuse pour mérozoïtes basées sur BET et fluorescence de la GFP double fluorescence, et des perles porte de comptage par fluorescence dans un canal séparé. Acquérir des événements jusqu'à 2000 billes sont collectées. Remarque: Ces instructions se réfèrent à compter GFP + mérozoïtes qui ont été contre-colorées avec du BET. Si ce n'est pas l'utilisation de la GFP exprimant parasites alors fixés portes mérozoïtes basé sur la dispersion latérale et BET fluorescence.
  6. Déterminer le rapport des mérozoïtes: perles en divisant le nombre d'événements de mérozoïtes par les 2.000 comptage des événements de perles, de calculer un ratio pour chaque dilution. Utilisez les spécifications de lots comptage de perles pour déterminer le nombre de perles dans les 50 pi de billes ajoutées par tube.
  7. Multiplier le nombre de perles dans 50 ul par le facteur de dilution et par le mérozoïte: rapport billes pour que le facteur de dilution. Ce nombre correspond à la concentration de mérozoïtes par ml. Effectuer eese étapes pour chaque dilution.
  8. La moyenne des concentrations de mérozoïtes mesurées dans les trois dilutions. NOTE: Les écarts-types au-delà de 10% pour les concentrations déterminées pour 1 100, 1 sur 50, et 1 à 25 dilutions indiquent des inexactitudes techniques dans la préparation des échantillons de comptage.
  9. Remettre en suspension les mérozoïtes à 8 x 10 6 / ml dans mérozoïtes THP-1 moyen pour assurer un rapport final de quatre mérozoïtes THP-1 par cellule. NOTE: Autre mérozoïtes de THP-1 ratios peuvent être utilisés, et les concentrations doivent être modifiés en conséquence.

7. Phagocytose Assay

  1. Ajouter 200 pi de chaleur FCS inactifs par puits de plaques 96 puits à fond en U, et laisser à température ambiante O / N pour bloquer plaques. Après incubation, enlever FCS et laver les puits deux fois avec 200 ul de PBS stérile. Retirer du PBS et les plaques de stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Calculer le nombre de cellules THP-1 nécessaires pour tester les échantillons de plasma et des contrôles, permettant de trois puits par échantillon à 1 x 10 5 cellules THP-1 par puits.
  3. Déterminer THP-1 la concentration de la culture en chargeant 10 ul de culture sur une lame d'hémocytomètre. Compter le nombre de cellules présentes dans 4 séries de 16 cases de coins de la hémocytomètre sous un microscope, puis la moyenne des chiffres. Multiplier le nombre moyen de 10 000 pour calculer le nombre de cellules par ml.
  4. Isoler le nombre requis de cellules THP-1 à 500 xg pendant 5 min, et remettre en suspension à 6,7 x 10 5 cellules / ml dans du milieu THP-1.
  5. Ajouter 150 ul de cellules THP-1 en THP-1 moyen par puits à une plaque de 96 puits à fond en U FCS bloqué, résultant en 10 5 cellules / puits. Préparer 3 puits par échantillon qui seront testés. Retour plaque dans l'incubateur jusqu'à ce que prêt à ajouter mérozoïtes.
  6. Ajouter 150 pi de préparation des mérozoïtes à 8 x 10 6 / ml par puits à un FCS bloqué plaque de 96 puits à fond en U séparée. Préparer un puits par échantillon testé
  7. Ajouter 10 ul d'échantillons de plasma dilué préparés par puits, à til plaque qui contient les mérozoïtes, et bien mélanger pour assurer une solution homogène.
  8. Retirer la plaque THP-1 de l'incubateur, et ajouter 50 ul de la solution mérozoïtes / plasma par puits contenant cellules THP-1, avec trois puits par échantillon de plasma.
  9. Bien mélanger et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2, incubateur humidifié pendant 40 min. Couvrir de papier d'aluminium pour protéger de la lumière.
  10. Après 40 min, les échantillons de centrifugation pendant 5 min à 500 x g à 4 ° C une centrifugeuse préalablement refroidie à arrêter la phagocytose.
  11. Retirer le surnageant et laver les cellules deux fois dans du PBS glacé 0,5% de BSA 2 mM d'EDTA (tampon FACS). NOTE: EDTA va faciliter le maintien d'une suspension de cellules isolées pour analyse par cytométrie en flux.
  12. Fixer les cellules dans 90 ul de 2% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 0,5% BSA 2 mM d'EDTA (FACS de fixateur). Laisser sur la glace jusqu'à ce que l'acquisition, à l'abri de la lumière.

8. Cytométrie en flux

  1. Acquérir des échantillons en utilisant un cytomètre de flux wi équipéeth un laser 488 nm et un débit élevé fixation du lecteur de plaque. NOTE: Ceci permettra jusqu'à 400 échantillons de plasma à tester d'une préparation de mérozoïtes. Les cellules peuvent également être transférés dans des tubes pour le manuel chargement de l'échantillon.
  2. Porte viables cellules THP-1 par l'avant et la diffusion latérale.
  3. Réglez le porte positif BET basée sur les «cellules THP-1 avec mérozoïtes et aucun plasma 'contrôle.
  4. Acquérir un minimum de 10 000 événements par échantillon.

9. Analyse des données

  1. Analyser les données en utilisant la cytométrie de flux logiciel d'analyse, et mis portes strictes pour les événements positifs EtBr.
  2. Calculer la phagocytose de pourcentage pour chaque échantillon: le% de EtBr + cellules de l'échantillon moins de cellules positives% avec du plasma non-immunitaire.
  3. Les résultats moyens à travers triple. NOTE: Les écarts-types pour un triple dans plus de 10% indiquent inexactitudes expérimentales. Certains fond événements BET positifs peuvent être observés à la suite de merozoite adhérence à la surface des cellules THP-1, mais il doit être uniforme dans tous les échantillons contenant des mérozoïtes. Réglage de la grille sur la base des «cellules THP-1 avec mérozoïtes et pas de plasma« contrôle, puis en soustrayant n'importe quel fond des «cellules THP-1 avec des non-immunitaire plasma« contrôle se traduira par la phagocytose% qui reflète la fluorescence due à intériorisé / phagocytés seulement mérozoïtes.

Résultats

Le stade de la maturation des parasites avant le traitement E64 est essentiel pour générer mérozoïtes membraneux. Figure 1Ai montre l'étape appropriée de la maturation des schizontes pour ajouter E64. Les parasites doivent être grandes et de remplir pratiquement le globule rouge. Un aspect tacheté de Giemsa indique mérogonie a commencé, et E64 devrait être ajouté pour donner mérozoïtes membraneux (Figure 1Aii). Si E64 est ajouté précédemment à trophozoite parasites au stade, la membrane mérozoïtes clos ne sont pas générés, même après 12 heures de E64. Au lieu de prendre des parasites sur la morphologie anormale tels que l'élargissement de la vacuole digestive (Figure 1BI et 1Bii), et les mérozoïtes sont pas formées. Si E64 est ajouté plus tard à schizontes, les mérozoïtes de membrane clos ne sont pas générés comme schizonte rupture est désinhibée (Figure 1Ci et 1Cii). Un niveau élevé de parasite synchronie est nécessaire, d'autressage une gamme de trois résultats décrits verra après le traitement E64.

Retrait de hemozoin est une autre étape critique pour les mérozoïtes de purification. Si les mérozoïtes sont pas purifiés à partir hemozoin alors grappes de mérozoïtes-hemozoin forment qui ne peut être délogé par pipetage. Ces agrégats s'exécutent sur ​​le cytomètre comme des événements uniques, mais avec différents avant-diffusion et dispersion latérale caractéristiques que les mérozoïtes isolés, ce qui inexacte mérozoïtes comptage par cytométrie de flux (figure 2A). Comme cellules THP-1 peuvent aussi phagocyter hemozoin, ces grappes mérozoïtes-hémozoïne peuvent également être phagocytées (figure 2B). Ces agrégats sont fluorescentes très BET, car ils contiennent de multiples mérozoïtes. La phagocytose d'agrégats se traduit par une THP-1 le profil de fluorescence de EtBr équivalente à celle observée pour la phagocytose des mérozoïtes individuels multiples. Par conséquent, si hemozoin n'est pas retiré, la fluorescence du BET de cellules THP-1 sera un overestimate du potentiel d'opsonisation pour le plasma à tester. Hémozoïne est également signalé à modifier considérablement la fonction des phagocytes. Mérozoïtes GFP-positives sont contre-colorées avec BET pour augmenter la visualisation des mérozoïtes phagocytés par cellules THP-1. En utilisant les conditions décrites dans le présent protocole, toutes les mérozoïtes GFP-positives sont contre-BET qui a une intensité de fluorescence lumineuse (figure 3A). évaluation de la phagocytose par BET fluorescence permet une résolution supérieure de mérozoïtes phagocytose de fluorescence de la GFP (figure 3B).

Le nombre de mérozoïtes ajoutées à l'essai module la quantité de phagocytose observé. Pour cette raison, le comptage précis par cytométrie de flux est critique. L'augmentation des rapports de mérozoïtes: THP-1 entraîne une augmentation de l'adhérence des mérozoïtes de cellules THP-1 en l'absence de plasma (Figure 4A). L'augmentation de mérozoïtes: THP-1 ratios se traduit également par une augmentation du pHRéponses de agocytosis lorsque mérozoïtes sont opsonisés (Figure 4B). A 04h01 mérozoïtes: THP-1 ratio est recommandé pour les réponses robustes phagocytaires. L'utilisation de ce rapport, et la dilution de plasma indiqué, ce test est capable de résoudre les niveaux d'anticorps opsonisants faible, intermédiaire et élevé. Entre 0 et 78 pour cent des réponses de phagocytose ont été observés en utilisant des échantillons de plasma PNG et les autres conditions décrites. Ces réponses sont présentés récemment à associer naturellement acquis une immunité clinique de paludisme 10. Figure 5 montre des exemples des quatre quartiles de réponses de phagocytose de personnes PNG.

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Figure 1. Moment de plus E64 est essentiel pour générer mérozoïtes membraneux. (A) maturatio appropriée. étape n de parasites i) avant le traitement E64, et ii) la membrane mérozoïtes clos produits après 6 h de traitement (B) E64 membrane mérozoïtes fermés ne sont pas générés si E64 est ajouté à des parasites immatures; i) trophozoïtes de stade tardif, et ii) après 12 heures de E64 (C) schizontes rupture n'est pas inhibée si E64 est ajouté à la fin de schizontes segmenté.; i) schizontes stade tardif, et ii) après 6 heures de E64. La barre d'échelle représente 10 um.

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Hémozoïne enlèvement Figure 2. Est essentiel pour générer une suspension des mérozoïtes seule cellule. Agrégats Merozoite-hémozoïne formulaire suivant filtration des membranes mérozoïtes clos, à moins que hemozoin est séparée magnétiquement mérozoïtes. (A) vers l'avant dispersion et côté-dispersion des parcelles de mérozoïtes avec hemozoin retiréet hemozoin retenu. (b) Les agrégats de hémozoïne-mérozoïtes peuvent être phagocytés par les cellules THP-1. Colorées Diff-Quick diapositives cyto-spin de THP-1 cellules incubées avec PNG plasma opsonisés préparations mérozoïtes avec ou sans hemozoin. La barre d'échelle représente 10 um.

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Figure 3. Bromure d'éthidium coloration permet une résolution supérieure de mérozoïtes phagocytose. D10-GFP mérozoïtes purifiés sont contre-BET à améliorer l'intensité de fluorescence. (A) La cytométrie en flux histrogram de mérozoïtes purifiés avec déclenchement sur ​​mérozoïtes GFP-positives, et une dot blot montrant BET fluorescence sein de cette population positif GFP fermée. (B) avant diffusion par rapport à la GFP et diffusion vers l'avant par rapport BET de cellules THP-1 suivant la phagocytose de la GFP et EtBr double mérozoïtes fluorescentes. Portes ont été; d rawn sur la base des cellules THP-1 avec mérozoïtes et pas de contrôle de plasma.

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Figure 4 des mérozoïtes. THP-1 rapport influe sur le degré de phagocytose observée. (A) Cinq mérozoïtes: THP-1 ratios sont représentés; 50:1, 20:1, 10:01, 04:01, 01:01. Cellules commande indique seulement la fluorescence de fond due à des cellules THP-1. THP-1 EtBr fluorescence pour chaque rapport est indiqué pour les mérozoïtes opsonisées avec un pool de PNG plasma ou de plasma australien non immune (B) Mean fluorescence d'intensité de cellules THP-1 pour mérozoïte différent:. THP-1 ratios, et opsonisation avec un pool de PNG plasma ou plasma australien non immune (moyenne + SEM). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. Une large gamme d'anticorps opsonisants peut être mesurée. Mérozoïtes ont été opsonisées avec le plasma de personnes PNG et incubées avec cellules THP-1. Quatre réponses de phagocytose représentatifs sont présentés. Portes ont été établis sur la base des cellules THP-1 avec mérozoïtes et pas de contrôle de plasma, et chiffres indiquent le% phagocytose après soustraction des cellules THP-1 avec contrôle du plasma non-immunitaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Pour mesurer mérozoïtes phagocytose, la maîtrise de deux techniques est nécessaire: la purification de mérozoïtes et THP-1 essai de phagocytose. Les étapes les plus importantes pour la combinaison de ces deux techniques sont les suivantes: 1) les parasites hautement synchronisés; 2) Ajout E64 au bon moment pour donner membrane mérozoïtes clos; 3) Retrait hemozoin pour éviter agrégats; 4) mérozoïtes précis comptage par cytométrie de flux; 5) la dilution de plasma utilisé; et 6) le maintien de faible densité cellulaire et le nombre de passage de cellules THP-1. Un examen attentif de ces aspects clés sera d'assurer des réponses de phagocytose robustes sont observées.

Bien que décrite ici est la préparation de mérozoïtes pour l'évaluation de la phagocytose, la technique peut être utilisée pour une large gamme d'applications. Quelle que soit la méthode d'aval, les préparations de mérozoïtes optimales dépendent de synchronisation correctement outre E64 afin de générer des mérozoïtes. Le procédé décrit ci-E64 a été montré pour yIELD mérozoïtes envahissantes pour une utilisation en microscopie à haute résolution des événements d'invasion et des essais de sensibilité aux médicaments 15-20. Bien que mérozoïte viabilité n'est pas essentiel pour la phagocytose, l'intégrité de la couche de surface du mérozoïte est nécessaire. Par conséquent, la méthode décrite ici E64 permet mérozoïtes de haute qualité à produire pour évaluer les réponses des anticorps à la couche de surface. Comme indiqué dans la figure 1, si E64 est ajouté trop tôt ou trop tard membrane mérozoïtes clos ne sont pas formés. Pour cette raison, les cultures de parasites très synchrones sont nécessaires. Ici, l'utilisation de traitements de sorbitol et l'héparine pour synchroniser hermétiquement D10-GFP cultures parasitaires d'une fenêtre de 2 heures est décrite. L'héparine peut favoriser gamétocytogénèse dans d'autres laboratoire isole, et devrait donc être utilisé avec précaution. Méthodes de synchronisation de substitution tels que l'alanine peuvent également être utilisés, à condition que les parasites étroitement synchronisés sont produites 29. Si E64 est ajouté aux parasites asynchrones, un accessoire inférieureortion des mérozoïtes membraneux sera produit et restant parasités RBC soit rompre normalement ou développer une morphologie anormale. La présence de parasites qui n'ont pas développé dans la membrane fermée mérozoïtes va entraîner le colmatage du filtre et de réduire de façon significative le rendement du mérozoïte obtenu.

Pendant la filtration des mérozoïtes membraneux, hemozoin est libéré des vacuoles digestives et est présent sous forme de cristaux libres en solution. Hemozoin est très pro-inflammatoire et a été rapporté pour moduler des monocytes et des macrophages phagocytose des réponses 30, 31. En plus de la modulation de la phagocytose, comme le montre la figure 2, hemozoin peut former des agrégats avec des mérozoïtes dans la solution. Comme cellules THP-1 peuvent phagocyter ces agrégats, cela peut être un facteur de confusion important pour la résolution des anticorps médiée par phagocytose. Par conséquent, la suppression de hemozoin est nécessaire dans ce test AVoid complexité supplémentaire de hemozoin sur phagocyte biologie. En outre, le défaut de retirer hemozoin peut également être néfaste pour l'utilisation de cette technique pour générer des mérozoïtes libres pour d'autres applications, en particulier là où les mérozoïtes quantification est nécessaire.

Comme présenté sur la figure 4, le nombre de mérozoïtes ajouté à l'essai peuvent influencer le degré de la phagocytose par les cellules THP-1. Bien que la cytométrie en flux permet de recensement de la concentration des mérozoïtes, pipetage soigneux et reproduire les chiffres de mérozoïtes sont nécessaires pour améliorer la précision. Cela est particulièrement important si plusieurs lignes de parasites doivent être testés côte à côte. Il a précédemment été démontré que le plasma à partir d'enfants semi-immuns de PNG peut être dilué de façon significative avant que diminuent les réponses 23. Décrit ici est la dilution optimale de plasma (1/120, 000 dilution finale de plasma) pour une cohorte de 5 - enfants de 12 ans PNG qui a produit la large gamme de phagocyt. réponses de TSO décrites dans la Figure 5 Cette gamme autorisés pour la stratification des réponses en quatre groupes (0-19%, 20-39%, 40-59% et 60-79% phagocytose), et la modélisation de régression ont révélé que les réponses opsonisants ont été associés à protection contre la maladie clinique et de haute densité parasitémie 10 Pour cohorte différentes études, il peut être nécessaire d'ajuster la dilution de plasma afin d'assurer le phagocytose par les cellules THP-1 non saturé ou en dessous du niveau de détection.

Débit permet cytométrie phagocytose rapide et quantifiable avec une précision améliorée sur la microscopie. Ce protocole est un débit élevé, plaque base et l'acquisition de plaques à 96 puits pour étudier l'immunité humorale acquise naturellement automatisé. La méthode nécessite des mérozoïtes coloration avec du bromure d'éthidium, les taches d'ADN cependant alternatifs tels que SybrGreen, DAPI et l'iodure de propidium, des taches ou des taches de la membrane de la protéine pourraient être utilisés. Ce test serait prête à PRIMARmonocytes ou neutrophiles y, et pourraient être adaptés si phagocyte ou FcR biologie était d'intérêt. Les cellules primaires ou cellules THP-1 différenciées in vitro avec de la PMA peuvent être utilisés pour étudier la phagocytose dans le paludisme et d'autres agents pathogènes 12, 32-34. Cependant, l'utilisation de cellules primaires peut être difficile car ces cellules sont adhérentes et affichent également non-anticorps médiée par phagocytose 35. En outre, la variabilité de la pureté, la viabilité et la fonctionnalité sont certaines limitations principales à l'utilisation des cellules phagocytaires primaires. Les récepteurs Fc impliqués dans la phagocytose mérozoïte restent non caractérisé, et donc en utilisant des anticorps bloquants de récepteurs Fc spécifiques pourrait élucider la contribution de chacun des récepteurs Fc à la phagocytose mérozoïte. Comme THP-1 phagocytose est FcR charge, ce qui permet une interprétation simple de la phagocytose observée. Ce dosage se prête également à traiter la spécificité antigénique des anticorps opsonisants qui pourraient être obtenus par utilizing parasites knock-out pour les antigènes de surface mérozoïtes, ou en utilisant des anticorps humains purifiés par affinité sur les protéines de surface des mérozoïtes. En outre, dans des études approfondies de la réponse des cytokines suivantes mérozoïtes phagocytose font défaut, et pourraient être obtenus par ce test.

Ces deux techniques constituent des progrès considérables à l'étude des anticorps antimerozoite fonctionnels. La purification des mérozoïtes de haute qualité est avantageux d'utiliser les mérozoïtes cryoconservés, ou des microsphères fluorescentes recouvertes d'antigènes de mérozoïtes. Bien que ce test a été utilisé comme un outil d'évaluation de l'immunité naturellement acquise, il peut s'avérer un outil important pour faire face à l'acquisition de l'immunité en réponse à la vaccination. Alors qu'il a été montré récemment que la phagocytose ou mérozoïtes opsonisées est associée à une protection contre un paludisme clinique, il n'est pas possible de tirer des conclusions directes in vitro à partir de cellules THP-1 de la phagocytose in vivo phagocytosesis mérozoïtes de la phagocytose dans ce dosage se produit dans des conditions statiques et en l'absence de globules rouges en compétition. Les adaptations possibles de ce test peuvent ainsi fournir un outil polyvalent pour une meilleure compréhension du paludisme et mérozoïtes phagocytose.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les enfants et les donneurs de plasma des adultes, et le personnel de la Papouasie-Nouvelle-Guinée Institut de recherche médicale. Les auteurs tiennent à remercier Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller et Diana S Hansen pour leur contribution au développement de cette technique, et je remercie la Croix-Rouge australienne pour le sang et de sérum packs. Ce travail a été rendu possible grâce au soutien victorienne gouvernement de l'État d'exploitation de l'infrastructure et du gouvernement australien NHMRC IRIISS. Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches médicales de la santé nationale et accorde # 1031212 et # 637406, et les Instituts nationaux de la Santé subvention # AI089686.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lignée cellulaire THP-1American Type Culture CollectionTIB-202
RPMI-1640Gibco31800-089
Sérum de veau fœtal (FCS)Invitrogen10099-141
2-mercapthoethanol  ;Sigma-AldrichM6250-100MLUtilisation dans une
/streptocoque (100x)SigmaP0781
HEPESSAFC90909CQualité de culture cellulaire
HypoxanthineCalbiochem4010
Sérum humain  ;Don de la Croix-RougeDisponible dans le commerce (c’est-à-dire Invitrogen)
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)Merck1.06329.0500
GentamycinePfizer61022027Injection Quality
Heparine Sodium BP (5000 UI/ml)PfizerOrigine porcine
Blasticidine S-hydrochlorideSigma-Aldrich15205
D-SorbitolSigma-Aldrich50-70-4
E64 Inhibiteur de protéaseSigma-AldrichE3132-10MG
KH2PO4Sigma-Aldrich98281-100GUtilisation pour tampon phosphate
Na2HPO4.2H20Merck10383.4GÀ utiliser pour le tampon phosphate
Azur eosin methylene blue solution de GiemsaMerck1.09204.0500dilution 1:10 dans 6.7 mN Tampon phosphate (faire frais chaque tache)
EDTA sel disodiqueMerck10093.5V0.1 M, pH 7.2
Filtres à seringue Acrodisc 1.2-&mu ; m/32-mmPall Life Sciences4656
Séparateur QuadroMACS (pour petite colonne)MACS Miltenyi BioTec130-091-051Interchangeable avec MidiMACS  ;
VarioSéparateur MACS (pour grandes colonnes)MACS Miltenyi BioTec130-090-282
MACS MultiStandMACS Miltenyi BioTec130-042-303
LS Colonne (petite colonne magnétique)MACS Miltenyi BioTec130-042-401
Grande colonne magnétiqueMACS Miltenyi BioTec130-041-305
Bromure d’éthidiumBio-Rad1510433Comptage cytotoxiqueBilles
de comptage absolues brillantesInvitogenC36950
BD FACSCacytomètre en flux avec lecteur de plaques HTSBD BIOSCIENCES
EDTA sel disodiqueMerck10093.5V0.1 M, pH 7.2
Logiciel d’analyse cytométrique FlowJo TreeStar
solution de stylo à hotte australienne

Références

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