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Article de méthode

ADN-ARN combiné Fluorescent

27.7K vues

⸱

DOI :

10.3791/51628

⸱

14 juin 2014

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Hybridation in situ fluorescente (FISH) permet la détection d'acides nucléiques de leur environnement natif dans les cellules. Nous décrivons ici un protocole pour le combiné, la détection simultanée de l'ARN et de l'ADN à l'aide de FISH, qui peut être utilisée pour étudier l'inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris.

Résumé

Hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet la détection d'acides nucléiques dans les cellules. ADN FISH est souvent utilisée en cytogénétique et diagnostic du cancer, et peut détecter des aberrations du génome, qui a souvent des implications cliniques importantes. ARN FISH peut être utilisée pour détecter des molécules d'ARN dans les cellules et a fourni des renseignements importants dans la régulation de l'expression génique. La combinaison de l'ADN et de l'ARN FISH dans la même cellule est techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l'ADN poisson pourrait être trop sévère pour fragiles, molécules d'ARN simple brin. Nous présentons ici un protocole facilement applicable qui permet au combiné, la détection simultanée de Xist ARN et l'ADN codé par les chromosomes X. Ce protocole de FISH ADN-ARN susceptible combiné peut être appliquée à d'autres systèmes où à la fois l'ARN et de l'ADN devant être détecté.

Introduction

Étudier les cellules et les tissus au moyen d'hybridation fluorescente in situ (FISH) a, depuis son introduction à la fin des années 1970 1, a permis aux chercheurs d'étudier les gènes, l'organisation de la chromatine et l'expression des gènes au niveau subcellulaire. ADN FISH est fréquemment utilisée en cytogénétique, caryotype 2, le diagnostic du cancer 3 et pré-implantatoire dépistage génétique 4, et joue un rôle important dans la recherche moléculaire 5-6, car il permet la détection d'acides nucléiques dans leur environnement naturel. Simple analyse d'expression de cellules par l'ARN FISH peut détecter des transcrits primaires indigènes et ARN non codantes étant transcrit à partir de chromosomes, et offre des avantages à d'autres techniques qui évaluent l'expression des gènes au niveau de la population, y compris par exemple RT-PCR quantitative, génome large analyse de l'expression ou Northern blot . En visualisant des transcrits d'ARN provenant directement de leurs sites d'origine, il a par exemple étéa remarqué que l'expression du gène est stochastique 7, et peut être parfois allèle spécifique 8. L'amélioration de la technique ont même permis la détection et la quantification des molécules d'ARNm dans les cellules simples 9-11.

Le principe de base de l'hybridation FISH consiste en des acides nucléiques dans la cellule à une sonde d'acide nucléique au moyen de Watson et Crick d'appariement de bases hautement spécifiques. La sonde peut être directement ou indirectement détectée, résultant en un signal qui peut être visualisée au microscope. Les premières tentatives étaient composés de sondes marquées radioactivement, qui avaient inconvénients en fonction des questions de sécurité, la résolution spatiale limitée et la capacité de détecter une seule cible à la fois 12-14. Le développement ultérieur d'étiquettes non radioactives, y compris les fluorochromes, les haptènes, et des enzymes, a permis l'utilisation répandue de FISH comme une technique de biologie moléculaire de routine. La sonde FISH peut être soit directement marqué avec fluorochromes par liaison chimique des molécules fluorescentes de l'acide nucléique et des séquences de 15 nucleotides de l'intégration de 16 à 19 marquées par fluorescence, ou la sonde peut être visualisé indirectement après intégration des haptènes (y compris la biotine et la digoxigénine) et la détection immunologique d'anticorps spécifiques d'haptènes par haptène conjugué à rapporteur fluorescent molécules 20-21. Cette dernière approche permet une amplification du signal à l'aide de plusieurs couches d'anticorps marqués par fluorescence qui sont utilisés pour améliorer le signal d'origine et permet la détection de l'espèce d'ARN qui sont exprimés à des niveaux faibles. En combinant des techniques de marquage direct et indirect et des haptènes différents, plusieurs cibles peuvent être visualisées simultanément dans la même cellule.

Une des étapes les plus importantes dans les protocoles de poisson est l'hybridation de la sonde à sa cible. Bien qu'en théorie, une sonde se lier spécifiquement seulement à sa cible, dans la pratique, cette spécificitén'est pas toujours atteint, en tant que sondes peuvent se lier à des régions homologues, des conditions d'hybridation et ne seront pas toujours idéale pour une certaine espèce de la région d'ADN ou d'ARN. Les lavages post-hybridation sont donc d'une importance particulière, car ils peuvent augmenter la rigueur de la procédure de FISH, et peuvent empêcher la liaison non spécifique des sondes FISH, qui se traduirait par un niveau élevé de bruit de fond. Comme les molécules d'ARN sont simple brin, ils peuvent facilement être hybridées à une sonde FISH. En revanche, la molécule d'ADN double brin doit tout d'abord une étape de dénaturation, après quoi, une sonde peut s'hybrider. Ceci est généralement obtenu par chauffage de l'échantillon, ce qui entraîne la dénaturation de l'ADN. Cependant, dans ces conditions difficiles, fragiles, molécules d'ARN simple brin peuvent être perdues. Par conséquent, l'ADN-ARN combiné FISH nécessite l'optimisation des conditions importantes, et il est plus difficile techniquement par rapport à la détection de seulement séparée de l'ARN ou de l'ADN.

Ici, nous présentationta protocole détaillé de combinés, simultanée FISH ADN-ARN qui nous a permis d'étudier l'inactivation du chromosome X (XCI) dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris femelle 22-24. XCI est un mécanisme épigénétique cruciale pour le développement embryonnaire femelle 25, et les résultats en hétérochromatinisation et donc faire taire l'un des deux chromosomes X chez les individus de sexe féminin 26-27. Essentiel de ce processus est la non codantes de l'ARN Xist 28-30, qui est réglementée par les 24 protéines RNF12 22-23 et Rex1. Expression de Xist devient régulée à la hausse sur l'avenir chromosome X inactif (Xi) au cours du développement embryonnaire ou sur la différenciation des cellules ES in vitro , et peuvent se répandre le long du chromosome X et d'attirer ainsi remodelage de la chromatine enzymes qui entraînent la fermeture de la transcription du chromosome X 31. Cet étalement de Xist ARN peut être visualisée par FISH ARN en tant que revêtement du chromosome Xcertains, qui est aussi appelé un nuage de Xist. Comme les cellules ES femmes peuvent perdre un de leurs chromosomes X en raison de l'instabilité génomique, nous et d'autres avons utilisé combiné ADN-ARN FISH pour étudier XCI, pour s'assurer que les cellules ne caryotype stables sont évalués dans l'analyse de cet important processus 22,32 -34. Comme avec toutes les techniques de la biologie moléculaire, plusieurs excellents différents protocoles ont été publiés 35-38. Ici, nous présentons notre méthode, à partir de l'induction de la différenciation des cellules ES de souris, la fixation des cellules, l'étiquetage du poisson sondes par Nick-traduction, pré-traitement des cellules fixées pour permettre la perméabilisation et l'utilisation de la sonde suite, l'hybridation de la sonde à l' cible, et enfin la détection de la sonde par des anticorps marqués par fluorescence. Le protocole présenté ici permet la détection de fidèles ARN Xist et le chromosome X dans un délai de deux jours, et les bases de cette technique peut probablement être adapté à otses systèmes et domaines de recherche.

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Protocole

1. Induction de la différenciation dans Femme cellules souches embryonnaires à induire des inactivation du chromosome X

REMARQUE: Femme de cellules souches embryonnaires de souris (disponible sur demande) sont cultivées dans des conditions de cellules ES standard sur des boîtes de culture gélifiés revêtues de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Nous supposons ici que le lecteur est familier avec les techniques de culture cellulaire standard 39-41. Pour induire la différenciation, les cellules ES cultivées dans des boîtes de T25 seront séparés des MEF, et seront étalées dans un milieu de différenciation.

  1. Retirez le milieu ES de la culture de cellules ES, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS.
  2. Ajouter 1,5 ml de trypsine-EDTA (préchauffée à 37 ° C), et incuber les cellules à 37 ° C pendant 7 min. Après 3,5 min, secouer le plat délicatement pour briser les colonies.
  3. Inactiver la trypsine-EDTA par addition de 3,5 ml de milieu de différenciation pour les cellules. cellules de pipette de haut en bas pour obtenir une solution d'une seule cellule, et recueillentdans un tube de 15 ml. Spin pendant 5 min à 200 x g, et recueillir les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation.
  4. Ajouter la suspension cellulaire à une boîte de culture non-gélatinisé, et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture cellulaire. NOTE: MEF seront capables d'adhérer à la boîte de culture non-gélatinisé, alors que les cellules ES resteront en suspension.
  5. Dans le même temps, ajouter des lamelles de verre stériles (24 x 24 mm) sur des plaques à 6 puits, ajouter 0,2% de gélatine, et incuber pendant un minimum de 5 min à température ambiante.
  6. Après 1 heure, recueillir le surnageant de culture de cellules ES pré-plaqué, qui sont principalement des cellules ES non-adhérents. Plate cellules ES à plaques à 6 puits contenant des lamelles. REMARQUE: Utilisez ⅙ e d'un plat confluent T25 pour 6 puits d'une plaque à 6 puits. Ceci permettra une différenciation confluente bien après 3 jours de différenciation. Changer le milieu sur une base quotidienne. Pour plus des cours de temps de différenciation, les cellules ES plaque pré-plaqués en milieu de différenciation dans les plats bactériennes, et Incubmangé sur un agitateur de cellule intégré dans l'incubateur de culture cellulaire. Cela permettra aux cellules pour former des corps embryoïdes qui peuvent être plaqués à lamelles 1-2 jours avant la fixation.

2. Fixation des cellules différenciées ES pour une analyse ultérieure FISH ADN-ARN

  1. Retirez milieu de différenciation des cultures de différenciation, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. NOTE: Ajouter PBS avec soin pour éviter les cellules emportés.
  2. Retirer culture cellulaire PBS et fixer les cellules en ajoutant 4% de paraformaldéhyde (PFA) / PBS, et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante. ATTENTION: PFA est toxique et peut entraîner un risque important pour la santé lorsqu'il est inhalé ou au contact de la peau ou des yeux. En outre, l'IFP est cancérigène.
  3. Retirer 4% PFA / PBS, et laver lamelles 3x avec 70% d'éthanol. NOTE: Corriger lavage est importante, car aucune trace de PFA va interférer avec les étapes ultérieures de POISSON. Les lamelles couvre-peuvent être stockés dans 70% d'éthanol à -20 ° C pendant plusieurs mois avant Fanalyse de l'ISH.

3. Étiquetage des sondes d'ADN pour les expériences de FISH

REMARQUE: Obtenir un fragment d'ADN du gène d'intérêt (longueur minimale> 2 ko pour l'ARN FISH, ou> 20 kb de l'ADN FISH), ou un BAC couvrant le gène d'intérêt. Pour la détection de l'ARN, une sonde plus petite peut être suffisante par rapport à la détection de l'ADN, la transcription depuis le plus probable se traduira par des transcriptions multiples, qui peuvent être détectés simultanément. Pour un signal fort sur le seul brin d'ADN copie, une sonde plus longue est nécessaire, pour être en mesure de détecter un nombre suffisant d'haptènes incorporés. De préférence, une région génomique non transcrite est choisie pour la conception de la sonde d'ADN. En outre, lors de l'utilisation d'une sonde plus petite pour détecter l'ARN, on a empêché que le locus génomique à partir de laquelle l'ARN est transcrit n'est détecté dans l'approche combinée FISH ADN-ARN, bien que cela ne peut pas être entièrement exclue. Pour détecter les souris Xist, une sonde d'ADNc de 5,5 kb a été utilisé. Pour detection du chromosome X, plusieurs sondes BAC peuvent être utilisés. De bons résultats ont été obtenus avec un mélange de BAC RP23-100E1 et 474E4 CT7-BAC, qui sont situés à proximité immédiate du locus Xist. Selon le gène ou d'un chromosome d'intérêt, plusieurs sondes différentes peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux. Pour travailler avec des matériaux qui seront utilisés pour l'ARN-FISH, utiliser des embouts stériles de filtre, RNAse H 2 O, et de travailler dans un environnement propre.

  1. Prendre 1 pg d'ADN et diluer dans H 2 O dans un volume total de 16 pl. Ajouter 4 pi de la digoxigénine ou solution de marquage à la biotine (voir réactifs), mélanger au vortex et incuber à 16 ° C pendant 90 min. NOTE: La biotine ou nucléotides marquées à la digoxigénine seront désormais intégrés par translation de coupure.
  2. Dans le même temps, préparer colonnes G50 pour éliminer les nucléotides non-intégrés. Prendre une seringue de 2 ml, enlever la matrice, et ajouter coton stérilisé dans la seringue. Ajouter les boulettes G50 en solution to remplir la seringue, placer la seringue dans un tube de 15 ml et centrifuger à 642 g pendant 1 min. NOTE: Environ 80% de la seringue doit maintenant être rempli avec G50. Répéter au moins G50 est présent.
  3. Après 90 min, ajouter 40 ul de H 2 O dans le mélange réactionnel de translation de coupure, et à la réaction de la colonne G50. Ajouter un tube vide dans la colonne, et centrifuger à 642 g pendant 2 min. Recueillir dans l'écoulement à travers un tube de réaction.
  4. Mesurer le volume de l'écoulement au travers d'une pipette, ajouter et H 2 O pour atteindre un volume total de 200 pi. Précipiter l'écoulement à travers en ajoutant 13,3 pi de l'ADN de sperme de saumon (10 mg / ml), 13,3 ARNt ul de levure (10 mg / ml), 26,7 pi de souris Cot-1 de l'ADN (1 mg / ml) et 28 ul de 2 M NaAc, pH 5.6. Mélanger au vortex, et ajouter 533 ul glacée 100% d'éthanol. Agiter le tube et centrifuger à 16 200 g pendant 30 min à 4 ° C.
  5. Enlever le surnageant et laver culot deux fois avec 70% d'éthanol. Centrifuger à 16 200 g pendant 5 min à4 ° C, et le culot sécher à l'air. Ajouter 50 ul de solution d'hybridation 50 +, et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour faciliter la dissolution. REMARQUE: sonde marquée peut être stocké pendant plusieurs années à -20 ° C. ATTENTION: 50 + solution d'hybridation contient du formamide, qui est toxique, peut irriter la peau, les yeux et le système respiratoire, et est également un tératogène.

4. Perméabilisation, pré-traitement et l'hybridation des cellules fixes pour Combined DNA-ARN FISH

  1. Réhydrater les cellules fixées sur des lamelles, en éliminant l'éthanol 70% et l'addition d'une culture de cellules du PBS pour les plaques à 6 puits. Incuber pendant 5 min. Répétez au total trois fois.
  2. Retirer culture cellulaire PBS, et ajouter 0,2% de pepsine pour les plaques à 6 puits, à perméabiliser les cellules. Incuber les plaques à 6 puits dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 4 min. Retirer la pepsine, et inactiver avec RNAse H 2 O.
  3. Cellules post-fixes par incubation avec 4% de PFA / PBS pendant 5 min à température ambiante. Après FIXATIsur, laver deux fois avec une culture de cellules du PBS pendant 5 min.
  4. Déshydrater les cellules par incubation avec de l'éthanol à 70% pendant 3 min, de l'éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d'éthanol pendant 3 min. Transfert des lamelles couvre de plaques de 6 puits, et l'air sec des lamelles pendant plusieurs minutes.
  5. les cellules de l'âge selon l'incubation des lamelles à 65 ° C pendant 1 heure sur une plaque chauffante.
  6. Pré-hybridation sonde FISH avec la souris Cot-1 DNA en additionnant pour chaque lamelle à analyser, 25 pi de solution 50 + d'hybridation, 0,5 pi souris Cot-1 DNA, 1 pl de sonde Xist marqué à la biotine et 1 pl de la digoxigénine sonde de BAC marqué détecter le chromosome X. Mélanger au vortex, et dénaturer à 99 ° C pendant 5 min. Incuber immédiatement à 37 ° C pendant 45 minutes, pour permettre à l'ADN Cot-1 de s'hybrider aux séquences répétées présentes dans les sondes.
  7. Après vieillissement, repéré 50 ul de tampon de dénaturation (consistant en 70% de tampon phosphate formamide/2x SSC/10 mM) sur une lame de verre, et les mettre sur le dessus avec des lamelles couvre-face des cellules towards le tampon de dénaturation. Incuber à 65 ° C pendant 2 min.
  8. Ajouter des lamelles à dos des plaques de 6 puits, et les cellules post-fix par incubation dans la glace froide éthanol à 70% pendant 5 min.
  9. Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l'éthanol 70% pendant 3 min, de l'éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d'éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l'air pendant plusieurs minutes.
  10. Repérer sonde pré-hybridée sur une lame de verre, et incuber la lamelle sur le dessus. Placer les lames dans une chambre humide rempli de 50 ml 50% formamide/2x SSC, et incuber une nuit à 37 ° C.

5. Lavage post-hybridation et médiation par les anticorps de détection de la sonde

  1. Remplir des plaques 6 puits avec 2 x SSC, et de pré-chauffer jusqu'à 42 ° C. Ajouter des lamelles après une nuit d'incubation, et incuber à 42 ° C pendant 5 min.
  2. Retirer 2x SSC, et incuber lamelles avec 50% SSC formamide/2x pendant 10 min à 42 ° C. Répétez un total de 3 fois (30 min de lavage au total).
  3. Retirer 50% formamide/2x SSC, et laver les lames avec du Tris-saline-Tween (TST) pour 2 x 5 min à température ambiante.
  4. Place 50 ul de Tris-saline-BSA (TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour bloquer pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié.
  5. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  6. Place 50 ul d'anticorps de mouton anti-dig (1:500 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles à l'envers pour la première étape d'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié.
  7. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  8. Coin 50 ul d'anticorps de lapin anti-mouton conjugué à FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles tête en bas pour la seconde étape d'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifiée .
  9. Transfer lamelles couvre-retour à des plaques 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  10. Place 50 ul d'anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l'étape d'incubation troisième pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié .
  11. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  12. Coin 50 pi d'anticorps de souris anti-biotine (1:200 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et des lamelles couvre-incuber à l'envers, pour la quatrième étape d'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifié.
  13. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  14. Place 50 ul d'anticorps d'âne anti-souris conjugués à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l'étape d'incubation cinquième pendant 30 min à température ambiante dans une chamb sombre TST-humidifiéer.
  15. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST.
  16. Place 50 ul d'anticorps de chèvre anti-cheval conjugué à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour la sixième étape de l'incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . REMARQUE: l'anticorps de chèvre anti-cheval de reconnaître l'anticorps d'âne anti-souris; quand à la disposition du chercheur, un anticorps de chèvre anti-âne fonctionnera aussi bien.
  17. Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. Laver supplémentaire de 5 min avec du Tris-saline (TS).
  18. Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l'éthanol 70% pendant 3 min, de l'éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d'éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l'air pendant plusieurs minutes.
  19. Repérer une goutte de milieu de montage avec DAPI (voir réactifs) sur une lame de verre, et ajouter la lamelle à l'envers sur le dessus. Sceller diapositives avec du vernis à ongles etévaluer les résultats du FISH par microscopie à fluorescence (Figure 1).

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Résultats

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus pour la combinaison de l'ADN-ARN FISH, nous avons pu visualiser inactivation du chromosome X dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de sexe féminin. Figure 1 montre un exemple représentatif d'une expérience FISH ADN-ARN, où nous avons détecté la fois Xist (qui est visible en tant que dite ARN Xist nuage sur le chromosome X inactif et une transcription basale ponctuelle sur le chromosome X actif), et une région du...

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Discussion

Combiné ADN-ARN FISH peut être techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l'ADN FISH peuvent être trop sévère pour les molécules d'ARN moins stables. Plusieurs approches ont été appliquées pour étudier à la fois l'ADN et l'ARN dans la même cellule, contournant le besoin d'incubation simultanée avec des sondes de détection à la fois l'ADN et l'ARN. Par exemple, dans une approche de superposition, premier poisson d'ARN est réalisée, et les cellules sont imagée, et les coor...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient tous les membres précédents et actuels du département de Reproduction et de Développement du MC Erasmus pour les discussions utiles et stimulantes qui ont eu lieu au cours des dernières années. Nous tenons également à remercier les trois évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Les travaux du laboratoire de Gribnau sont soutenus par un financement du Conseil néerlandais de la recherche (NWO-VICI) et une bourse de démarrage ERC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
fibroblastes embryonnairesde souris peuvent être dérivés d’embryons E13.5 ou de sources commerciales par exemple
milieu de culture cellulaireDMEM, 15 % de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, acides aminés non essentiels, 0,1 mM γ ;-mercaptoéthanol et 1 000 U/ml LIF. Filtrer, stériliser et stocker à 4 ° ; C pour un maximum de 2 semaines.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
sérum de veau fœtalInvitrogen10099141
pénicilline&ndash ; streptomycine (100x)Invitrogen15140-122
Acides aminés non essentielsInvitrogen11140-050
γ ;-mercaptoéthanolSigma-AldrichM7522
ES milieuIMDM-Glutamax, 15 % sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, acides aminés non essentiels, 37,8 μ ; l/L monothioglycérol et 50 μ ; g/ml acide ascorbique
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
Acide ascorbique (50 mg/ml)Sigma-AldrichA4403
monothioglycérolSigma-AldrichM6145
Boîtes de culture cellulaire T25Greiner Bio-one690160
Boîtes de culture cellulaire 6 puitsGreiner Bio-one662160
qualité de culture cellulaire PBSSigma-AldrichD8537
Trypsine-EDTA 0,25 % (v/v) trypsine/0,2 % (p/v) EDTA dans PBSGibco25200-056
TubesFalcon352196
24 x 24 mm lamelles de recouvrementMenzle780882
gélatineSigma-AldrichG1890-100Gpréparer une solution de gélatine/culture cellulaire à 0,2 % PBS et autoclave
PepsinSigma-AldrichP7000Diluer à 0,2 % dans 0,01 M HCl (pH 2,0)
absolu 100 % éthanolSigma-Aldrich32221-2.5Lutiliser de l’eau absolue 100 % éthanol et sans RNAse pour fabriquer des solutions à 70 % et 90
d’éthanol Eau sans RNAseBaxterTKF7114
pointes filtrantes stérilesRainin Bio CleanGP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
kit de marquage à la digoxigénine (traduction DIG-Nick)Roche11745816910
kit de marquage à la biotine (traduction Biotin Nick)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
Seringue de 2 mlBD Plastipak300013
coton
Eppendorf tubes Eppendorf
ARNt de levure 10 mg/mlInvitrogen15401-029
ADN de spermatozoïde de saumon 10 mg/mlInvitrogen15632-011
souris cot-1 ADN 1 mg/mlInvitrogen18440-016
Microcentrifugeuse de paillasse EppendorfEppendorfModèle 5417R
Centrifugeuse réfrigérée EppendorfEppendorfModèle 5810R
2 M NaAc, pH 5,6Sigma-AldrichS7670
50+ solution50 % formamide, 2x SSC, 50 mM tampon phosphate pH 7, 10 % sulfate de dextran pH 7
formamideAcros organics3272350000
sulfate de dextranFluka31403
10 mM tampon phosphate, pH 7ajouter 57,7 ml de 1 M de Na2HPO4 et 42,3 ml de 1 M de NaH2PO4 ; utiliser l’eau traitée DEPC et
dénaturation70 % formamide/2x SSC/10 mM tampon phosphate pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7,5 solution
Tris-saline-Tween solution de lavage (TST)100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μ ; l Tween-20, ajouter de l’eau libre d’ARNase jusqu’à ce que 1 L
10x solutiondissolve 85 g de NaCl dans 1 L d’ARNse libre H2O, et autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA)500 μ ; l 10x solution saline, 250 μ ; l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml d’ARNse libre H2O
BSA, purifié, 100xNew England BiolabsB9001S
anti-creuserRochediagnostics utilise 1:500 dilué dans TSBSA
Anticorps anti-mouton lapin conjugué avec FITCJackson labsutilisent 1:250 dilué dans un anticorps anti-lapin TSBSA
conjugué avec FITCJackson les laboratoires utilisent 1:250 dilué dans
anticorps anti-biotine de sourisLes diagnosticsutilisent 1:200 dilués dans
anticorps anti-souris d’âne TSBSA conjugués à de la rhodamineLes laboratoires Jacksonutilisent 1:250 dilué dans un anticorps anti-cheval de chèvre TSBSA
10 ml 10x solution saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml sans RNAse H2O
Vectashield support de montage avec vernis à
miscroscope
Les Millipore ES de différenciation cellulaire  % stérilisé30120086 d’hybridation tampon de en autoclave saline anticorps un TSBSA de Roche un conjugué à de la rhodamine Les laboratoires Jackson utilisent 1:250 dilué dans une solution de lavage saline (TS) TSBSA Tris-saline ongles DAPI Vectorlabs H-1200 fluorescent

Références

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

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