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Article de méthode

Vasculaire Transfert de gènes à partir de stent métallique surfaces à l'aide vecteurs adénoviraux Tethered par hydrolysables de la Croix-linkers

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DOI :

10.3791/51653

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12 août 2014

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1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

Ces études rendent compte de la fixation réversible des vecteurs de gènes adénoviraux sur des surfaces métalliques sans revêtement de stents et de disques à mailles modèles. La libération prolongée de particules virales capables de transduction subordonnée à l’hydrolyse des agents de réticulation utilisés pour l’immobilisation des vecteurs entraîne une expression durable du transgène spécifique au site dans les cellules vasculaires et dans les artères munies d’une endoprothèse.

Résumé

Resténose intra-stent présente une complication majeure des procédures de revascularisation base d'endoprothèse largement utilisés pour rétablir le flux sanguin dans les segments rétrécies de manière critique des artères coronaires et périphériques. Stents endovasculaires capables de libérer accordable de gènes ayant une activité anti-resténose peut présenter une stratégie alternative à l'heure actuelle utilisés stents à élution médicamenteuse. Afin de réaliser l'application clinique, les stents de gènes élution doivent présenter une cinétique prévisibles de gène libération de vecteur de stent immobilisé et la transduction spécifique de site de la vascularisation, tout en évitant une réponse inflammatoire excessive typiquement associé aux revêtements polymères utilisés pour le piégeage physique du vecteur. Cet article décrit une méthodologie détaillée pour tethering sans manteau de vecteurs de gènes adénoviraux de stents basé sur une liaison réversible des particules adénoviraux à polyallylamines bisphosphonate (PABT) -Modified surface en acier inoxydable par des agents de réticulation hydrolysables (HC). Une famille deHC bifonctionnel (amine et thiol-réactif) avec un t 1/2 moyenne de l'hydrolyse de l'ester dans la chaîne comprise entre 5 et 50 jours ont été utilisés pour lier le vecteur avec le stent. La procédure d'immobilisation vecteur est typiquement réalisée à l'intérieur de 9 h et se compose de plusieurs étapes: 1) l'incubation des échantillons de métal dans une solution aqueuse de PABT (4 h); 2) la déprotection des groupes thiol installés dans PABT avec le tris (2-carboxyéthyl) phosphine (20 min); 3) augmentation de la capacité réactif thiol de la surface métallique en faisant réagir les échantillons avec de la polyéthylèneimine pyridyldithio dérivés avec des groupes (PDT) (2 heures); 4) la conversion des groupes thiols de PDT avec du dithiothréitol (10 min); 5) la modification des adénovirus avec HC (1 h); 6) la purification de particules d'adénovirus modifiés par chromatographie d'exclusion stérique colonne (15 min) et 7) l'immobilisation des particules adénovirales thiol réactif sur la surface de l'acier thiolé (1 h). Cette technique a une large applicabilité potentielle au-delà des stents,en facilitant l'ingénierie de surface des dispositifs bioprothèses pour améliorer leur biocompatibilité grâce à la prestation de gène substrat médiée par les cellules d'interfaçage matériel étranger implanté.

Introduction

L'efficacité de la thérapie génique en tant que modalité thérapeutique est entravée par la capacité de ciblage de mauvais vecteurs de thérapie génique 1,2. L'absence de résultats de ciblage appropriés dans les niveaux sous-thérapeutiques de l'expression du transgène à l'emplacement cible et conduit à une large diffusion des vecteurs aux organes non ciblés 3, y compris ceux qui sont responsables pour le montage des réponses immunitaires à la fois contre le vecteur et produit thérapeutique codé 4, 5. Un potentiel signifie pour compenser la promiscuité de transduction et de promouvoir le ciblage est d'introduire des vecteurs de gènes à l'endroit désiré dans une forme qui empêche leur diffusion gratuite par le sang et la lymphe. Typiquement, de tels efforts sont tributaires de systèmes d'administration locale injectables comprenant soit des vecteurs viraux ou non viraux mêlé de fibrine, collagène ou un hydrogel d'acide hyaluronique matrices 10.6 qui sont capables de soutenir de manière transitoire des vecteurs de gène au niveau du site d'injection en piégeant physiquement èmeem dans un réseau polymère.

Un autre modèle généralement accepté pour la thérapie génique localisée immobilisation utilise des vecteurs de gènes à la surface des prothèses implantées 11,12. Implants médicaux permanents (endovasculaires, bronchiques, urologiques et gastro-intestinaux stents, stimulateurs cardiaques, articulations artificielles, des filets chirurgicaux et gynécologiques, etc.) Sont utilisés chaque année des dizaines de millions de patients 13. Bien que généralement efficaces, ces dispositifs sont sujettes à des complications qui sont insuffisamment contrôlés par les pratiques médicales actuelles 14-17. Prothèses implantables présentent une occasion unique de servir de plates-formes de substitution pour le traitement localisé de la thérapie génique. Du point de vue pharmacocinétique, la dérivatisation de la surface d'implants médicaux avec des doses relativement faibles d'entrée de vecteurs de gènes conduit à la réalisation de deux des concentrations locales élevées de vecteurs de gènes de l'interface implant / tissu et le ralentissement de la cinétique de their élimination de ce lieu. En conséquence de séjour prolongée et améliorée par l'absorption de la population cellulaire ciblée, l'immobilisation vecteur minimise la propagation du vecteur de gène. Ainsi, l'inoculation par inadvertance des tissus non cibles est réduite.

attache de surface des vecteurs de gènes sur les biomatériaux implantables (appelées également que la livraison de gène substrat médiation ou la livraison de gènes en phase solide) a été mis en œuvre dans la culture de cellules animales et des expériences utilisant à la fois spécifique (antigène-anticorps 18-20, avidine-biotine 21,22) et non spécifique 23-26 (charge, de van der Waals) interactions. La fixation covalente de vecteurs à la surface du dispositif implanté a été précédemment considéré comme non fonctionnel car excessivement fortes liaisons avec la surface empêchent vecteur internalisation par les cellules cibles. Récemment, il a été démontré que cette limitation peut être surmontée par l'utilisation d'hydrolysable spontanément agent de réticulation utilisé comme tetsienne entre la surface métallique mise à jour de l'endoprothèse et les protéines de capside du vecteur adénoviral 27,28. En outre, la vitesse de libération de vecteur et évolution dans le temps de l'expression du transgène in vitro et in vivo peuvent être modulées à l'aide d'agents de reticulation hydrolysables présentant des cinétiques d'hydrolyse 28.

Le présent document présente un protocole détaillé pour la fixation covalente réversible des vecteurs adénoviraux à la surface de métal actif et présente un dispositif expérimental utile pour l'étude qui ont suivi les événements de transduction in vitro dans le muscle lisse de culture et les cellules endotheliales et in vivo dans le modèle de la carotide de rat de stent d'angioplastie .

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Protocole

1 Préparation de l'adénovirus marqué au Cy3 pour les expériences de libération

  1. Suspendre 2 x 10 12 particules de Ad vide (environ 2 x 10 11 unités infectieuses) dans 650 ul de tampon carbonate / bicarbonate (CBB; pH 9,3).
  2. On dissout le contenu d'une fiole (0,2 mg) d'un colorant fluorescent réactif amine (Cy3 (NHS) 2) dans 1 ml CBB à une concentration finale de 0,2 mg / ml.
  3. Ajouter 100 ul de la solution de colorant à la suspension de virus, vortex pendant 5 secondes et incuber pendant 1 heure à 28 ° C sous agitation (100 à 200 rpm).
  4. Equilibrer une colonne de 20 ml de Sépharose 6B avec du PBS. Ajouter 750 ul de suspension marqué au Cy3 Ad goutte à goutte au centre du lit de gel.
  5. Après la suspension virale imprègne la résine, ajouter 5 ml de PBS. Jeter l'éluat.
  6. Ajouter 0,5 ml de PBS et recueillir l'éluat dans un récipient en verre étiqueté. Répétez cette étape 10x recueillir un total de dix fractions de 0,5 ml.
  7. E teste fractions collectées par spectrophotométrie (260 nm et 280) pour la teneur en ADN viral.
  8. Rassembler les fractions contenant plus de 10% du total (somme de F1 à F10) de la densité optique (DO) à 260 nm. Note: Généralement, les fractions F3, F4, F5, F6 et sont réunies et mélangées.
  9. Re-dosage, les fractions rassemblées mixtes par spectrophotométrie (260 nm et 280) et le dosage par fluorimétrie (550 ex / em 570 nm) pour la teneur en ADN viral et marquées Cy3 protéine de capside, respectivement. Remarque: Une courbe d'étalonnage Cy3 (NHS) 2 couvrant la gamme 10 -9 -10 -13 mol / L est préparé et dosé par fluorimétrie sur la même plaque que les fractions regroupées.
  10. Calculer le rendement de virus marqué et de la densité de marquage. Supposons que les particules de 1,19 x 10 12 virus / ml correspond à 1 unité DO pour un 1 cm de trajet 29. Utilisez la formule suivante: Rendement = [(DO 260nm /1.19)*10 12 * quantité V / entrée Ad] * 100, où, DO 260 nm est la de optiquensity de la formulation mise en commun à 260 nm et V est le volume de la formulation mise en commun (ml) pour calculer un rendement de récupération de l'annonce (en%). Utilisez la formule: densité = Etiquetage C * 6.02 * 10 23 / ​​(DO 260nm /1.19)*10 12, où C est la concentration Cy3 de la formulation groupé (mole / ml) et OD 260 nm est la densité optique de la formulation mis en commun à 260 nm pour calculer la densité moyenne de l'étiquetage Cy3. NOTE: Une reprise typique des virus marqué est> 70% de la dose d'entrée. La densité de marquage est 600-800 molécules fluorophores par une seule particule virale.
  11. Ad vide en portions plus petites (généralement 5 x 10 11 particules) appropriés pour les expériences de libération individuels aliquote Cy3 marqué. REMARQUE: protocole actuel prévoit l'utilisation d'Ad marqué au Cy3 uniquement dans l'expérience de libération. Toutes les études de transduction sont effectuées avec des vecteurs non marquées.

2 Activation des échantillons métalliques

  1. Laver les s inoxydableACIER mesh disques ou des stents en acier inoxydable de façon consécutive dans de l'isopropanol (2 x 5 min) et du chloroforme (5 x 2 min) à 55 ° C sous agitation (100 rpm). Eliminer le solvant.
  2. Chauffer les échantillons pendant 30 min à 200 ° C.
  3. Dissoudre polyallylamine bisphosphonate avec des groupes thiol latents installés (PABT 27,28,30) dans l'eau (1-2% w / v) à 72 ° C sous agitation (100 rpm). Ajuster le pH à 4,5-5 avec KHCO3.
  4. Incuber les échantillons de métal dans la solution de PABT pour 2-4 heures à 72 ° C sous agitation (100 à 200 rpm). NOTE: La procédure peut être interrompue à ce point. Les échantillons sont stables pendant 3 jours à 4 ° C.
  5. Rincer les échantillons trois fois avec de l'eau distillée deux fois (DDW).
  6. Exposer les échantillons de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP, 15 mg / ml dans 0,1 M de tampon acétique) pendant 15 min à 28 ° C sous agitation (100 à 200 rpm).
  7. Rincer 5x dans dégazé DDW.
  8. Exposer les échantillons à 2% de polyéthylèneimine avec des groupes pyridyldithio installés (PEI PDT 27,28,30) dans DDW dégazée sous atmosphère d'argon pendant 2 h à 28 ° C sous agitation (100 à 200 rpm). NOTE: La procédure peut être interrompue à ce point. Les échantillons sont stables pendant 2 semaines à 4 ° C.
  9. Rincer les échantillons trois fois avec GFI.
  10. Exposer les échantillons à 10 mg / ml dithiothréitol / DDW pour convertir les groupes pyridyldithio de thiols.
  11. Rincer 5x nouveau dans dégazé DDW.

3. adénovirus activation et métal immobilisation de surface

  1. Suspendre 5 x 10 11 particules de l'annonce soit eGFP ou Ad Luc (environ 5 x 10 10 unités infectieuses) à 487,5 à 495 ul de tampon carbonate / bicarbonate (CBB; pH 9,3). Remarque: Pour les études de libération, utiliser 5 x 10 11 de Cy3 marqué particules vides de l'annonce (régler le volume de 487,5 à 495 ul avec du CBB).
  2. Dissoudre HC avec divers taux d'hydrolyse 28 [(rapidement (t 1/2 = 5 d), intermédiaire (t 1 /2 = 12 d) et lentement (t 1/2 = 50 d) HC, c'est à dire RHC, IHC ou SHC; Figure 1] ou non hydrolysable de réticulation (NHC), sulfo-LC-SPDP dans CBB à 20 mM.
  3. Immédiatement ajouter 5-12,5 ul de solution de réticulation à la suspension de virus pour un volume total de 500 pi (200-500 pM de concentration finale de l'agent de réticulation), vortex et incuber pendant 1 heure à 28 ° C sous agitation (100 à 200 tours par minute).
  4. Equilibrer une colonne de 20 ml de Sepharose 6B avec dégazé mM EDTA / PBS 5 (ce relevé). Ajouter goutte à goutte 500 ul de suspension de l'annonce de réticulation modifié au centre du lit de résine.
  5. Ajouter 5 ml de dégazé ce relevé. Jeter l'éluat.
  6. Ajouter 0,5 ml de ce relevé dégazé et recueillir l'éluat dans un récipient en verre étiqueté. Répétez cette étape 10 fois la collecte d'un total de dix fractions de 0,5 ml.
  7. Déterminer la DO des fractions collectées en utilisant la spectrophotométrie à 260 et 280 nm et à convertir OD titres de virus (1,19 x 10 12 / ml correpond à 1 OD) 29.
  8. Rassembler les fractions contenant> 10% de virus éluée (Note: en général, les fractions F3-F6). Répéter le dosage du titre spectrophotométrique pour la suspension commun.
  9. Transfert suspension virale dans le flacon avec les échantillons métalliques activés (comme par 2.11). Incuber dans une atmosphère d'argon pendant 1 heure à 28 ° C sous agitation (100 à 200 rpm). Remarque: Les échantillons de métal Ad-captif obtenus dans cette étape sont encore utilisés dans les rejets et de transduction des expériences ultérieures décrites dans les sections de protocole 5-7.

4 Quantification de surface associée à l'annonce Vecteur par PCR

  1. Préparer mailles formulés avec surface immobilisée annonce eGFP attaché par NHC, SHC, IHC et RHC (n = 3 pour chaque type) tel que décrit dans les sections 2 et 3.
  2. Utilisez un kit QIAamp DNA Micro pour isoler l'ADN viral. Placez les mailles individuellement dans des tubes en plastique de 1,5 ml contenant 200 ul d'un mélange composé de 180 pi de ATL buffer et 20 ul de proteinase K (à la fois dans le kit). Ajouter la quantité connue de particules Ad eGFP (comme normes pour la courbe d'étalonnage) dans les tubes séparés contenant le même mélange. Incuber à 56 ° C pendant la nuit sans agitation.
  3. Ajouter 200 ul de tampon AL (du kit), mélanger au vortex, ajouter 200 ul d'éthanol à 100%, et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  4. Transférer le mélange de chaque tube sur une colonne individuelle de MinElite (du kit) et centrifugation à 8000 rpm pendant 1 min. Rincer les tubes contenant de 180 mailles-pi de tampon d'ALT fraîche, ajouter sur les colonnes respectives et essorage à 8000 tours par minute pendant 1 minute. Jeter les éluats.
  5. Ajouter 500 ul de tampon AW1 (du kit) dans les colonnes et essorage à 8000 tours par minute pendant 1 minute. Jeter les éluats.
  6. Ajouter 500 ul de tampon AW2 (du kit) dans les colonnes et essorage à 8000 tours par minute pendant 1 minute.
  7. Jeter les éluats.
  8. Spin à 14000 rpm pendant 3 minutes supplémentaires until les colonnes sont complètement secs. Jeter les éluats.
  9. Ajouter 50 ul d'eau MilliQ de qualité dans les colonnes. Tourner à 14 000 tours par minute pendant 5 min. Récupérer 50 ul de l'éluat de la colonne dans chaque tube individuel de collecte (du kit).
  10. Préparer la solution PCR Master Mix en combinant multiplie de ce qui suit (12,5 pi de puissance Sybr Green PCR Master Mix, 0,63 ul de 10 uM eGFP amorce sens [5 'ACG ACG TAA GCC ACA AGT TC -3'], 0,63 ul de 10 iM eGFP anti-amorce sens [5 'AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3'], 6,3 pi de l'eau MilliQ-grade). Multipliez ces volumes par le nombre de réactions prévues, y compris les contrôles "pas d'ADN".
  11. Charge 5 ul de l'ADN Ad eGFP (de l'étape 4.8) et 20 ul de PCR Master Mix dans des puits en triple d'une plaque de réaction à 96 puits MicroAmp Optical. Sceller la plaque avec MicroAmp Optical Adhesive Film. Faites tourner la plaque à 1000 rpm pendant 1 min pour éliminer les bulles d'air.
  12. Placer la plaque dans le réceptacle d'un moteur de PCR en temps réel 7500. Dans le menu principal du système SDS 7500 Software (v1.4 ou ultérieure) sélectionnez "Créer nouvelle expérience". Cliquez sur "suivant". Dans l'écran «Assistant Nouvelle expérience" choisir Sybr vert à partir d'un menu déroulant, puis cliquez sur "ajouter". Cliquez sur "suivant" pour obtenir une présentation de la plaque. Mettez en surbrillance tous les puits à analyser, sélectionnez Sybr vert. Mettez en surbrillance consécutivement aucun puits de contrôle de l'ADN, annonce eGFP normes et inconnues ADN, et les marquer à l'aide désignations respectives dans le menu déroulant.
  13. Passez à l'onglet de l'instrument. Sélectionnez "ajouter la phase de dissociation», modifier le volume du puits de défaut 50 pi à 25 pi. Cliquez sur Démarrer.
  14. Analyser les résultats de PCR utilisant après avoir vérifié le résumé QC aberrantes et autres irrégularités.

5: Cinétique de libération de hydrolysables de la Croix-lieur attaché particules vectorielle du modèle en acier de maille

  1. Laver les échantillons de maille dérivés avec Ad Cy3 marqué par RHC, IHC, SHC et NHC (comme par 3,9) à 1% de BSA / PBS (1 h x 3) avec agitation (100-200 rpm).
  2. En utilisant des pinces fines stériles, placer les mailles dans des puits individuels d'une plaque à 96 puits pré-remplie avec 200 pi de tampon d'élution (0,1% de BSA / 0,1% de Tween-20 / PBS).
  3. Prenez des images fluorescentes d'une partie centrale de chaque maille. Enregistrer les réglages du microscope et la caméra CCD utilisée pour l'acquisition de l'image.
  4. Doser la plaque fluorimétriquement (550 ex / 570 em) en mode bien-scan en réduisant au maximum. Utilisez les puits avec des maillages non-dérivés comme un contrôle de fond.
  5. Incuber la plaque à 37 ° C sous agitation (50 rpm).
  6. A des moments prédéterminés (gamme de 1 à 30 jours) aspirer le tampon d'élution, sans déranger les mailles et ajouter 200 ul de tampon d'élution frais. Répétez les étapes 4.3-4.5 après le remplacement de la mémoire tampon.

6. transduction de culture d'Cells par des vecteurs Ad Mesh immobilisés

  1. Laver ad eGFP - ou Ad Luc -derivatized mailles trois fois avec du PBS stérile pendant 5 min sous agitation (100 rpm).
  2. En utilisant des pinces stériles fines retirer les disques de maillage, un par un et de les placer individuellement dans les puits d'une plaque à 96 puits avec le type d'intérêt dans la phase logarithmique de croissance de la cellule.
  3. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C, sous 5% de CO 2.
  4. Utiliser le dosage respectif non terminal point de terminaison (microscopie à fluorescence, de fluorimétrie eGFP ou imagerie par bioluminescence pour la luciférase) pour déterminer l'étendue et la répartition spatiale de l'expression des gènes dans les puits.
  5. Eventuellement, le milieu de substitution pour PBS pour augmenter la sensibilité du dosage par fluorimétrie (485/535 nm) si la faible expression de eGFP est attendue. Remarque: Si un fluorimètre est équipé d'une capacité bien-scan, de lire la plaque dans un mode bien-scan pour évaluer la distribution spatiale des cellules dans les puits exprimant EGFP. Bourse PBS pour le milieu après avoir terminé fluorimétrie.
  6. Image les cellules transduites dans les puits à mailles annonce eGFP -eluting (à la fois sous-jacents et périphériques du mesh) en utilisant le jeu de filtre FITC. Prenez des photos représentatives à 40-200X grossissement. Enregistrer les paramètres exacts du microscope fluorescent et la caméra CCD utilisée pour l'acquisition des images.
  7. Ajouter 5 pl de luciférine magasin dans du PBS (10 mg / ml) dans les puits directement avec Ad Luc -eluting s'engrène à une concentration finale de 500 ug / ml et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 10 minutes avant l'imagerie par bioluminescence . Aspirer le milieu et les remplacer par des médias libres luciférine-après imagerie.
  8. Essais finaux Répéter à des moments prédéterminés (jusqu'à 2 semaines) pour étudier la cinétique d'expression du gène rapporteur suite du transfert de gène substrat médiation.

7 Validation des préservée capacité de transduction à Points temporisés

  1. Préparer l'annonce de eGFPmailles rivatized utilisant RHC, IHC, SHC et NHC pour le vecteur tethering (comme par 02.01 à 02.11 et de 03.01 à 03.09) et placer individuellement les mailles dans les puits d'une plaque de 96 puits avec 60-80% de cellules endothéliales aortiques bovines confluentes (BAEC ).
  2. Analyser la transduction de culture BAEC avec filet immobilisé annonce eGFP à 1 et 2 jours de placement post-maille en utilisant la microscopie par fluorescence et fluorimétrie (comme par 6.4 à 6.5).
  3. 48 heures après le début de la transduction laver deux fois les puits contenant de maille-avec PBS.
  4. Ajouter 200 ul de 0,25% de trypsine / EDTA à chaque puits et incuber pendant 15 min à 37 ° C sous agitation (100 rpm). Laver 3 fois avec PBS.
  5. Utiliser la microscopie à fluorescence et la fluorométrie pour déterminer l'élimination complète de toutes les cellules EGFP-positives associées à des mailles.
  6. Semences fraîchement des passages BAEC dans les puits à mailles partiellement dégagées à une densité d'ensemencement initiale de 60-80% (de 2 à 2,7 x 10 4 cellules / puits).
  7. Incuber la plaque à 37 ° C et 5% de CO 2 pour les périodes de temps prédéterminées (1-10 jours) avant l'évaluation de «nouveaux» des événements de transduction par microscopie à fluorescence et fluorimétrie.

8 Ad-stent à élution de déploiement dans la carotide Modèle Rat de stent angioplastie

  1. Toutes les procédures sur les animaux décrits dans le présent protocole sont conformes aux règlements fédéraux sur l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le IACUC de l'Hôpital pour enfants de Philadelphie. Pour adhérer à des conditions chirurgicales aseptiques tous les instruments sont stérilisés autoclave. Pour assurer la stérilité continue un stérilisateur à billes est utilisé entre l'utilisation des instruments jusqu'à cinq animaux consécutifs.
  2. Préparez annonce Luc -eluting stents selon 02.01 à 02.11 et de 03.01 à 03.09. Stocker les stents en dérivé de virus dans du PBS stérile à 4 ° C pendant une durée n'excédant pas 24 h avant utilisation.
  3. Anesthésier des rats mâles Sprague-Dawley (400-450 g) avec injection IP de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg). DeTermine la profondeur de l'anesthésie par la réaction au pincement de la patte et du tonus musculaire. Appliquer une pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse de la cornée et la sclérotique. Remarque: L'anesthésie par inhalation avec 4% et 2% d'isoflurane (1 L / min) pour induire et maintenir une anesthésie, respectivement, est possible, mais empêche le libre accès à la région du cou de l'animal et n'est donc pas recommandé pour un utilisateur inexpérimenté.
  4. Réévaluer profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil. Raser et le cou de façon aseptique de préparation et de la région de la poitrine. Administrer des antibiotiques (céfazoline, 20 mg / kg; IM), analgésique (méloxicam; 0,5 mg / kg; SC) et une solution saline (10 ml / kg; SC). Sonder la veine de la queue avec un cathéter 24 G et administrer l'héparine (200 UI / kg; IV). Remarque: Une dose de 10 mg / kg (IM) enrofloxacine (Baytril) peut être utilisé à la place de la céfazoline. Eviter l'utilisation des antibiotiques qui n'ont pas une activité significative contre les bactéries Gram-positives. 10-15 mg / kg carprofène (Rimadyl) peut être utilisé à la place de méloxicam comme un analgésique préventif. Les analgésiques narcotiques (eex., la morphine, la buprénorphine) doit être évitée en raison de leurs propriétés de respiration abaisseur.
  5. Effectuer une incision médiane à travers la peau et du cou fascia. Utiliser des techniques de dissection d'isoler la gauche artère carotide externe. Nouez l'artère carotide externe sur le site accessible la plus distale. Appliquer une ligature temporaire coulissante à l'origine de l'artère carotide interne.
  6. Faire une incision de 2 mm artériotomie gauche dans l'artère carotide externe.
  7. Insérer un cathéter Fogarty 2-français dans l'artère carotide commune à travers l'incision dans l'artère carotide externe. Gonflez la pointe du cathéter avec une solution saline et passer 3 de la crosse aortique à la bifurcation carotidienne pour dénuder l'endothélium.
  8. Faites glisser un morceau de tube (1,04 mm de diamètre extérieur, 0,99 mm de diamètre) sur le cathéter Fogarty et dans l'artère carotide commune. Retirer le cathéter Fogarty.
  9. Mont et sertir une annonce Luc -derivatized stent sur ​​le ballonnet de 1,5mm diamètre cathéter d'angioplastie. Insérez le stent à travers le tube de Téflon et l'avancer dans la mi-section de l'artère carotide commune. Évitez de frotter le stent contre la paroi du tube ou d'un navire.
  10. Déployer le stent à 12 atm pendant 30 secondes et retirer le cathéter d'angioplastie.
  11. Nouez l'extrémité proximale de l'artère carotide externe au site artériotomie et libérer la ligature temporaire sur l'artère carotide interne.
  12. Réparer la plaie opératoire en couches avec l'exécution 4.0 Vicryl suture et agrafes de la peau.
  13. Récupérer l'animal sur un coussin chauffant jusqu'à ambulatoire et revenir à sa cage isolée. Même si aucun signe de douleur ou d'inconfort sont généralement exposées par les animaux post-opératoires au-delà les 12 premières heures après la procédure, étudier l'extension de la thérapie de meloxicam (0,5 mg / kg, SC par jour) pendant 72 heures.

9 bioluminescence imagerie de l'expression génique artérielle

  1. A des moments prédéterminés (1 jour - 3gamme semaines) après le déploiement du stent à élution de gène dans l'artère carotide commune, anesthésier le rat sous anesthésie par inhalation d'isoflurane (2-4% d'isoflurane dans de l'oxygène).
  2. Retirez les agrafes chirurgicales, préparer de façon aseptique le site et rouvrir la plaie opératoire. Utilisation accès dissection émoussé, re-prise de l'artère carotide commune gauche et le séparer du nerf vague et le tissu conjonctif adjacent.
  3. Préparer un mélange de 50 mg / ml dans du PBS Luciferin et 25% de Pluronic F-127 dans du PBS (1: 4 v / v) et le stocker sur la glace. Remarque: cette formulation se présente comme une solution visqueuse à 4 ° C et se transforme en gel au contact avec le tissu à 37 ° C immédiatement.
  4. Appliquer 200 ul d'une Luciferin / mélange Pluronic frais directement au segment exposé de l'artère carotide commune et de vérifier la solidité du gel.
  5. Placez l'animal dans la position couchée sur le dos dans la chambre de l'imagerie de l'appareil SIIV-Spectrum et maintenir une anesthésie isoflurane avec un masque.
  6. Dans le acquisitisur la fenêtre du panneau de commande (image vivante, version 4.2 ou ultérieure) choisir la position "B" (6,6 cm caméra à distance de l'objet) et binning facteur «moyen» dans les menus déroulants intitulé «champ de vision» et «catégories», respectivement. Tapez «2,5 cm» dans la case objet en hauteur. Choisissez "min", une unité de temps dans la case "temps d'exposition", et choisissez une valeur numérique de "2".
  7. Trois minutes après l'application de la / gel Pluronic Luciferin, lancer l'acquisition d'image en cliquant sur le bouton "Acquérir" sur l'écran. Note: l'image le temps d'acquisition peut varier de 1 à 6 min en fonction de l'intensité du signal attendu.
  8. Après l'acquisition de l'image, laver le gel hors avec une solution saline et tamponnez l'espace périartériel avec de la gaze et coton applicateurs stériles.
  9. Fermer la plaie avec Vicryl suture et agrafes de la peau.
  10. Récupérer l'animal et retourner dans sa cage. Répétez l'imagerie à plus tard tdes points ime d'étudier l'évolution temporelle de l'expression des artériel provoqué par les vecteurs Ad-stent immobilisé.
  11. Sinon, effectuer l'imagerie suite d'une administration systémique de la luciférine. Anesthésier et prep l'animal par 9.1-9.2. Sonder la veine de la queue avec un cathéter 24 G et le cathéter sécurisé avec du ruban adhésif chirurgical.
  12. Préparer une solution de luciférine dans du PBS (50 mg / ml) et injecter 1 ml de la solution à travers le cathéter sur un intervalle de 10 secondes. Une minute après l'injection de commencer l'acquisition d'images selon 9.7 à 9.8. Remarque: Un taux d'injection rapide (<10 s) peut provoquer l'activité de saisie et un arrêt respiratoire. L'animal doit être euthanasié si les crises ou arrêt respiratoire se produisent lors de l'imagerie.
  13. Suivez l'étape 9.10.

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Résultats

Expériences vecteur de sortie

Attache des vecteurs adénoviraux à la surface des implants, y compris les dispositifs d'intervention tels que des stents endovasculaires, se rapproche du vecteur au site de la maladie, ce qui évite en partie l'absence de vecteurs de ciblage physique. Cependant, pour pouvoir obtenir des effets thérapeutiques via la transduction du tissu cible, le vecteur doit être libéré à partir de la surface (figure 2). L'utilisatio...

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Discussion

Le protocole présenté décrit un mode opératoire pour la délivrance de gènes à médiation de substrat obtenue par l'attachement réversible de vecteurs adénoviraux pour des surfaces sans manteau en acier inoxydable. Bien que développé dans le but spécifique de traitement de la resténose vasculaire gène à base d'endoprothèse, cette technique a des applications beaucoup plus larges dans les domaines des biomatériaux, des implants biomédicaux et la thérapie génique.

Bien que les étud...

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Déclarations de divulgation

L’élaboration du protocole et les études présentées dans cet article ont été financées en partie par des subventions de développement scientifique de l’American Heart Association (I.F. 0735110N et M.C. 10SDG4020003), une subvention HL 72108 (R.J.L.) de l’U.S. National Heart, Lung, and Blood Institute (Heart, Lung, and Blood Institute) T32 007915(S.P.F.). Les cathéters d’angioplastie ont été gracieusement offerts par NuMED (Hopkinton, NY). Les auteurs tiennent à remercier Mme Susan Kerns pour son aide au secrétariat.

Remerciements

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à divulguer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Disques maillés en acier inoxydable 316Electon Microscopy SciencesE200-SS
Endoprothèses génériques en acier inoxydable de qualité 304Commandepersonnalisée
Laserage AdeGFPUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV0504
AdLucUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV1028
AdEMPTYUniversité de Pennsylvanie Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
Plaques UV 96 puitsCostar3635
Fluorométrie Plaques 96 puitsCostar3915
Culture cellulaire Plaques à 96 puitsFalcon353072
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Dithiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
Dispositifs moléculaires  ;Spectrofluorimètre SpectraMax 190
Dispositifs moléculairesSpectraMax Gemini EM
VWR1575R
Four à flux d’air horizontalShel Lab1350 FM
Centrifugeuse Centra-CL2  ;International Equipment Company426
Mélangeur vortex numériqueFisher Thermo Scientific02-215-370
Microscope à fluorescence Eclipse TE300Nikon TE300
DC 500 Caméra CCDLeicaDC-500
7500 Système de PCR en temps réelApplied Biosystemsnon disponible
Station de bioluminescence IVIS SpectrumPerkins-Elmernon disponible
Sel dipotassique EDTASigma-AldrichED2P
Albumine sérique bovine fraction V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Pince DumontOutils de science fine11255-20
Lignée cellulaire A10  ;ATCCCRL-1476
Cellules endothéliales aortiques bovinesLonzaBW-6002
Luciférine, sel de potassiumBiotechnologie de l’orLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS sans calcium ni magnésiumGibco14190-136
Sérum fœtal bovinGemini Bio-Products100-106
Solution de pénicilline/streptomycineGibco11540-122
DMEM, haute teneur en glucoseCorning cellgro10-013-CV
0,25 % Trypsine/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA micro kitQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
Plaque de réaction optique MicroAmp à 96 puitsApplied BiosystemsN8010560
Film adhésif optique MicroAmpApplied Biosystems4360954
la céphazoline.Apotexnon disponible
Loxicom (Meloxicam)Norbrooknon disponible
Héparine sodiqueAPP Produits pharmaceutiquesnon disponibles
Ketavet (Kétamine)VEDCOnon disponible
Anased (Xylazine)  ;Lloïdnon disponible
Plante forane (Isoflurane)  ;Baxternon disponible
Pince à iris Moria incurvéeOutils de science fine11370-31
Pince Graefe extra-fine incurvéede science fine11152-10
Pince Dumont #5Outils de science fine 11252-20
Ciseaux à ressort VannasOutils de science fine15018-10
Ciseaux de science fine - ToughCutFine Science Tools14058-09
Ciseaux chirurgicauxFine Science Tools14101-14
Suture en vicryl (5-0)EthiconJ385
Fil de suture (4/0 soie)  ;Fine Science Tools18020-40
Clips de suture MichelOutils de science fine12040-02
Dilatateur de plaie (spéculum oculaire de Lancaster)KLS Martin34-149-07
Stérilisateur à billes chaudesFine Science Tools18000-45
Applicateur de clip de suture MichelFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV cathéterBeckton-Dickinson381412
2F Fogarty cathéterEdwards Lifesciences120602F
Tube en téflonVention041100BST
Cathéter PTANuMedsur commande
Compresses de gazeKendall Healthcare9024
Applicateurs en cotonSolon ManufacturingWOD1003
Seringue SalineBaxter281321
10 ml (Luer-Lok)Seringue Beckton-Dickinson309604
1 ml (Luer-Lok)309628Beckton-Dickinson
avec lame #40Oster  ;78005-314
Ruban chirurgical Transpore3MMM 15271
Puralube vetur pommadePharmadermnon disponible
Spectrophotomètre Incubateur à agitateur orbital ; Outils personnaliséeTondeuse

Références

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

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