Summary
Resultatens tillförlitlighet i metabolomik experiment beror på effektiviteten och reproducerbarheten för provberedning. Beskrivs är en noggrann och djupgående metod som möjliggör utvinning av metaboliter från biologiska vätskor med möjlighet att senare analysera upp till tusentals föreningar, eller bara de substansklasser av intresse.
Abstract
Metabolomics är ett framväxande område som möjliggör profilering av prover från levande organismer för att få insikt i biologiska processer. En viktig aspekt av metabolomik är provberedning som innebär inkonsekventa metoder genererar otillförlitliga resultat. Denna teknik omfattar proteinutfällning, vätske-vätske-extraktion, och fastfas-extraktion som ett sätt att fraktionera metaboliter i fyra distinkta klasser. Förbättrad anrikning av låga överflöd molekyler med en resulterande ökning av känsligheten erhålls, och i slutändan resulterar i mer säker identifiering av molekyler. Denna teknik har tillämpats på plasma, bronkoalveolär sköljvätska och i cerebrospinalvätskan prover med volymerna så låga som 50 | il. Prover kan användas för flera tillämpningar i efterföljande led; till exempel, kan pelleten uppstått genom proteinutfällning lagras för senare analys. Supernatanten från detta steg undergår vätske-vätskeextraktion med användning avvatten och starka organiska lösningsmedel för att separera de hydrofila och hydrofoba föreningar. När fraktionerade, kan det hydrofila skiktet behandlas för senare analys eller kasseras om den inte behövs. Den hydrofoba fraktionen behandlas vidare med en serie av lösningsmedel under tre fastfasextraktion steg för att separera den i fettsyror, neutrala lipider och fosfolipider. Detta tillåter teknikern flexibiliteten att välja vilken klass av föreningar som är föredragen för analysen. Det hjälper också i mer tillförlitlig identifiering metabolit eftersom viss kunskap om kemisk klass existerar.
Introduction
Biologiska reaktioner genererar metaboliter som slutprodukter av cellulära processer. Metabolomics är en samling av alla de föreningar som finns i en organism som ett resultat av dessa processer. Det ger en bild av fysiologi av celler och speglar en organisms respons på yttre eller inre stimuli 1, 2. Sådana stimuli kan vara miljö, toxikologiska, farmakologiska, kost, hormonell, eller relaterade till sjukdomen. Många metabolomic applikationer har och håller på att studeras av forskare och inkludera biomarkörer 3, näring studier 4, livsmedelsvetenskap 5, och drogtestning 6. Oavsett tillämpning, variationer i data, föroreningar, och förekomsten av falska positiva måste minska eller helst tas bort. I biomarkörer eller när det gäller att fastställa skillnader mellan en kontroll och en sjukdomsgrupp, eller undersöker effekter av läkemedel på patienter, en biologisk fluid väljs utifrån de frågor som ställs och vilka typer av metaboliter utreds 7. Till exempel, om att studera de omedelbara effekterna av en inhalerad drog på lungorna hos astmatiker, sedan utforska metaboliter i lungsköljvätska (BALF) prover före och efter administrering skulle vara förmånliga. För att säkerställa att observerade skillnader beror på faktisk biologisk variation snarare än felaktig provberedning teknik, är standardiserade och enhetliga laboratorieprotokoll avgörande 8. Prov information måste noggrant dokumenteras för att säkerställa att variabler såsom biologisk vätska, djurstam, provtagningstiden, med förbehåll ålder, kön, för att nämna några, är alla beaktas och vägas in i studien 9. Dessutom, för att minska risken för kontaminering eller falska positiva, rekommenderas det att lösningsämnen och instrumentämnen analyseras 10.
För detta protokoll, avser termen "Metabolites "kommer att användas för att hänvisa till den verkliga föreningar som identifierats. Med hjälp av leverantörsprogram, är en initial topp fynd algoritm som används för att upptäcka masspektrala toppar. Dessa toppar är inriktade baserat på massa-till-laddning (m / z) ratio och retentionstid. En andra algoritm används sedan för att kombinera flera funktioner i en enda förening. Detta inbegriper sådana funktioner som natrium, kalium, eller ammonium-addukter i positiv jonisering läge och klorid i negativ jon-läge. Ytterligare alternativ i programvaran inkluderar funktioner såsom dimerer och andra addukter. Med användning av glukos som ett exempel, med toppar vid 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH4) och 203,05261 m / z (M + Na), skulle det finnas tre toppar som motsvarar samma föreningen med användning av den första algoritmen. Men när den andra algoritm, som är baserad på molekylformel, appliceras dessa tre addukter blivit grupperade tillsammans resulterar i en förening.
Metaboliter kan orsaka störningar inom samples på grund av komplexiteten av föreningar som finns. Närvaron av tusentals metaboliter i en prov orsaker signalerar förtryck särskilt av de lägre överflöd metaboliter. Prov sanering för att avlägsna interfererande proteiner och efterföljande separation i flera fraktioner minskar komplexiteten av provet och därigenom förbättra toppseparation, öka upplösningen och minska metabolit sameluering. Därför krävs provrengörings och förbättrad separation av föreningar. Det har visat sig att protein nederbörd ensam, även med hjälp av olika polaritet lösningsmedel, inte kan lösa problemet 11, 12. Emellertid, genom att kombinera en stark organisk lösningsmedel, såsom MTBE med ett efterföljande fraktioneringssteg, är metaboliten täckning ökas. Yang et al. 12 rapporterade en ökning av metaboliter från 1.851 eller 2.073 med metanol eller enbart metanol-etanol nederbörd respektive till 3806 metaboliter med hjälp av kombinerade MTBE vätskeextraktionföljt av fastfas-extraktion (SPE) steg. Reducerad metabolit överlappning, förbättrad toppseparation och ökad metabolit överflöd observerades med denna metod.
Kontamination från icke-metaboliter, såsom polymerer, kan vara resultatet av provsamling, lösningsmedel eller instrumentbuller, och kan resultera i signalundertryckning av potentiellt signifikanta metaboliter. Det rekommenderas att teknikern (s) och de som samlar in proverna före prov förberedelse konsekvent använda samma märke, typ och storlek på provuppsamlingsflaskor, pipettspetsar och andra rör som används vid insamling och beredning av proverna. Detta gör att data analytiker att ha fullt förtroende för att de observerade förändringarna är verkliga och inte på bakgrunds skillnader från andra källor. Behandling effektivitet, kan variationer mellan sjukdom och kontrollgrupper eller andra metaboliska analyser sedan undersökas med ökad tillförsikt.
Den method diskuteras här fokuserar på kombinerad provberedningsmetoder 13-15, som kan tillämpas på plasma, BALF eller cerebrospinalvätska (CSF) prov för icke öron metabolomic profilering för vätskekromatografi-masspektrometri (LCMS) baserad analys. Både vätskekromatografi (LC) och ultra-vätskekromatografi (UPLC) separationstekniker kan vara kopplad till MS till följd av denna procedur. Många forskare som utför metabolomic studier använder antingen en proteinutfällning teknik och / eller en vätske-vätske-extraktion teknik 16, 17. I våra studier, resulterade detta i färre metaboliter som detekteras. Den metod som beskrivs här 12 gör det möjligt att spåra och identifiera ett större antal metaboliter, som omfattar ett bredare spektrum av metabolomen. Denna ökning beror på den högre renhet av proverna och reducerade matriseffekter orsakade av tidigare separation av metaboliten klasser.
En första protein fällningssteg utförs med kall metanol (MeOH) för att ta bort protein från provet. Vätske-vätske-extraktion (LLE) med användning av metyl-tert-butyleter (MTBE) och vatten används för att separera hydrofila och hydrofoba föreningar. Då fastfas-extraktion (SPE) utförs på det hydrofoba skiktet för att separera de hydrofoba föreningar i tre klasser - fettsyror, neutrala lipider och fosfolipider. De hydrofoba fraktioner rekonstituerades i 100% metanol, medan den hydrofila fraktionen rekonstitueras i 5% acetonitril i vatten. Steget fastfasextraktion (SPE) ger en extra nivå av tillförsikt i resultaten genom att minska antalet av coeluting föreningar, som annars skulle vara närvarande hade ett separationssteg inte utförts.
Protocol
1. Inledande överväganden, Beredning av instrument och standarder
- Använd alltid glas för lagring (glas kultur rör, glas autosampler flaskor) eller överföring (glaspipetter) lipider och organiska lösningsmedel.
- Minimera exponering av alla fettprover och standarder till luft. Seal polytetrafluoretylen (PFTE) mössor tätt för att undvika luftexponering och avdunstning. Omedelbart resuspendera torkade lipider i nästa lösningsmedel eller hålla dem i en stadig ström av kväve.
- Använd 100 pl prov. I de fall där mer (eller mindre) prov är tillgänglig, justerar volymerna i enlighet därmed. Men under lipid fraktione på NH2 SPE-kolonn, uppgav volymer måste förbli som anges.
- Slå på centrifug och satt till 0 ° C före start av provberedning.
- Denna teknik använder många flyktiga lösningsmedel så håll alla lösningsmedel tak under beredningen av proverna.
- Bered två typer av standarder per rekommendation.
- Förbered en negativ kontroll bestående av manipulerat-i standarderna på en konstant koncentration. Detta är spetsade i alla prover samt ett samlingsprov som används som ett parti QC (spetsat samlat prov används för att övervaka provberedning reproducerbarhet på separata dagar) och instrument QC (spetsad samlingsprover tidigare beredda, under alikvoteras, och används för att övervaka instrumentets villkor / svängningar under analys och på olika dagar).
- Bered positiva kontroller på 1x, 2x och 4x standard spikar. De positiva kontrollerna läggs till alla prover samt ett samlingsprov plasma och används som kvalitetskontroll föreningar för båda provberedningssteg och instrumentella analyssteg för att analysera och identifiera de veck förändrings skillnader under dataanalys för att säkerställa att alla aspekter av förberedelse och instrumentella analyser utfördes på rätt sätt.
- Förvara standarder på -20 ° C och förvara proverna vid -80 ° C. Vissa interna stativstandarder som är utsatta för nedbrytning efter lång tids förvaring ska förvaras vid -80 ° C.
- Denna procedur kräver användning av farliga, lättantändliga eller flyktiga lösningsmedel såsom MTBE. Utför alla steg i ett dragskåp.
2. Interna standarder
- Välj interna standarder (istD) baserade på enskilda projekt och deras specifika experimentell design. För biofluids såsom plasma, BALF, eller urin, isotopmärkta ISTDs som är snarlika de som finns biologiskt i dessa prover skulle vara perfekt. Dessa skulle innefatta, men är ej begränsade till aminosyror, hormoner eller lipider. För växt metabolomic prover, kunde märkta standarder såsom flavonoider, eller karotenoider användas. Detsamma gäller andra metabolomic studier innebär att utredaren bör välja en inre standard, som är representativt för den typ provet som analyseras.
- Se till att den valda ISTD täcker ett brett spektrum av kromatogrammet; till exempel om than förvärvstiden är 20 min, standard som eluerar var 5 min kan användas.
- Skapa fila stamlösningar vid 2 mg / ml med användning av en mängd olika isotopiskt märkta standarder och / eller andra polära föreningar, som är exogent till provet som analyseras. Från varje stamlösning, skapa en lösning i 1:1 metanol: vatten med alla standarder till en slutlig koncentration av 25 | ig / ml kreatinin-D 3, 100 ug / ml lysin-D-4, och 200 ug / ml valin-D 8 .
- Skapa hydrofoba förrådslösningar med hjälp av olika isotopiskt märkta standarder och / eller andra icke-polära föreningar, som är exogent till provet som skall analyseras; stock koncentrationer av 17:00 fettsyra (4 mg / ml), 19:1 fettsyra (4 mg / ml), 17:00 ceramid (2 mg / ml), 17:00 PE (1,75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml) och testosteron-D-2 (1 mg / ml). Från varje lager, skapa en lösning i 1:1 kloroform: metanol med alla standarder till en slutlig koncentration av 50ig / ml 17:00 ceramid, 100 | ig / ml 15:00 PC, 100 | ig / ml testosteron-D-2, 200 ^ g / ml 17:00 fettsyra, 200 | ig / ml 19:01 fettsyra, och 200 ^ g / ml 17:00 PE i standardmixen.
- Testa graden av jonisering av varje standard i förväg med hjälp av minst fem olika koncentrationer för varje standard för att bestämma detektionsgränsen och linjäritet av instrumentet för dessa föreningar. Koncentrationen av stamlösningen för varje enskild standard kommer att variera beroende på experimentell design, och koncentrationen av varje standard i Kombinerade spetsade standarden kan sträcka sig från 20 | j, g / ml till 2 mg / ml, beroende på hur väl de joniserar.
- Skapa en spik blandning av positiva kontroller och lägga till dem i proverna vid 1x, 2x eller 4x koncentrationsnivåer för att kvantitativt övervaka styrkan i provberedning och riktigheten av de instrumentella uppgifter. Slutlig koncentration av positiva kontroller kanvara: 2 mg / ml D-glukos, 100 | ig / ml alanin-D-3, 200 | ig / ml metylmalonsyra-D-3, 20 | ig / ml triglycerid-D-5, och / eller andra hydrofoba och hydrofila standarder. Justera standardkoncentrationer baserade på känsligheten hos MS-och HPLC-instrument som används för analys.
3. Protein Precipitation
- Tina prover till RT och spik 10 pl av ISTD till varje prov såsom beskrivs nedan.
- Spike 10 pl av både hydrofila och hydrofoba standardlösningar (som skapas från mälden i steg 2,3 och 2,4) till varje prov. Justera standardkoncentrationer som är nödvändiga enligt känsligheten hos nämnda MS och HPLC-instrumentering som används för analys
- Spike 10 pl antingen 1x, 2x eller 4x positiv kontrollösning (skapas från lager i steg 2.6) till varje prov. Justera standardkoncentrationer efter behov baserat på känsligheten i MS och HPLC instrumentering som används för analys
- Vortexa varje prov i 10 sek innan proteinet utfällningssteget
- Tillsätt 400 | il iskall metanol (lagrade vid -20 ° C) till varje prov.
- Vortex för 10 sek per rör.
- Centrifugera vid 0 ° C under 15 min vid 18000 x g..
- Överför alla supernatanten till ett nytt glas kultur rör, och sedan torka under N2.
- Om analys av proteinpelletfraktionen, gå vidare till steg från 3,8 till 3,11. Om inte analysera protein pellets, hoppa till Avsnitt 4.
OBS: Protein pellets kan innehålla substanser med hög hydrofobicitet som skulle vara användbart när du utför läkemedelsstudier 18, livsmedelsanalyser involverar hydrofoba flavonoider 19 eller metabolomic studier relaterade till sjukdomar där mycket hydrofoba föreningar ackumuleras, såsom neuronala ceroid-lipofuscinoses 20 och lysosomal lipid lagring sjukdomar 21. - Tillsätt 1 ml MTBE till than vit (eller off-white)-protein pellet, vortexa i 30 sekunder per rör, centrifugera sedan vid 0 ° C under 15 min vid 18000 x g.. Häll av MTBE-skiktet till ett nytt glas odlingsrör.
Detta är ett kritiskt steg som fel här kommer drastiskt påverka resultat (se figur 5 i representativa resultat).- Konsekvent aspirera samma mängd av MTBE för alla prover, eftersom storleken av pelleten kommer att variera mellan prover. Därför, om bara 900 pl kan dekanteras för provet med minst antal överstående, sedan dekantera 900 l för samtliga prover.
- Upprepa steg 3.9, och kombinera det organiska skiktet till samma glas kultur rör beredd i steg 3.7.
- Torra prover genom N2-flöde och återsuspendera i 200 pl av 01:01 kloroform: metanol. Vortex kort.
- Överföring till ett centrifugrör. Centrifugera vid 0 ° C under 15 min vid 18000 x g och sedan överföra supernatanten till autosampler skruvlock vialer med glaspipetter.
4. Vätske-vätskeextraktion
- Med hjälp av ett glas pipett, tillsätt 3 ml MTBE till den torkade metanolrest (från avsnitt 3, steg 6), virvel 30 sek, tillsätt 750 l vatten, då virvel 10 sek per rör.
- Spin ~ 200 x g under 10 min i en centrifug vid rumstemperatur.
- Aspirera 2,5 ml MTBE-skiktet (utan att få vatten) och överföring till en ren glas odlingsrör.
OBS: Detta är ett kritiskt steg som skillnader här kommer att påverka resultatet. 2,5 ml MTBE bör noggrant dekanterades från det övre skiktet, eftersom det tillåter en fast volym som skall dekanteras utan att pipettera det vattenhaltiga skiktet nedanför. Om volymen av provet vid början av experimentet var mindre än de angivna 100 pl för denna metod, skala volymen av MTBE att proportionellt reflektera denna startprovvolymen. - Tillsätt 3 ml MTBE till det kvarvarande vattnet delen av provet, och virvel 10 sek per rör.
- Spin ~ 200xg under 10 min i centrifugen vid RT.
- Aspirera 3 ml MTBE (utan att få vatten) och kombinera med MTBE rör.
- Koncentrera den kvarvarande vattenskiktet genom torkning under N2.
- Återsuspendera återstoden i 100 | il vatten.
- Tillsätt 400 l av iskalla MeOH till glaskulturen röret, skaka snabbt, och sedan överföra till mikrocentrifugrör.
- Lämna vid -80 ° C under 20-30 min. Centrifugering vid 0 ° C under 15 min vid 18000 x g..
OBS: Vi rekommenderar att placera hela provstället i en -80 ° C frys eftersom detta gör att eventuella kvarvarande protein för att fälla ut i metanol. Om en -80 ° C frys inte är tillgänglig, andra alternativ är: lagring vid -20 ° C, placera proverna på torris, eller hålla dem i en ishink. Det är viktigt att alltid lagra proverna i en kall miljö och vid samma temperatur för att medge utfällning. - Sug 450 l av supernatanten och överföring tillen rena mikrocentrifugrör. Torka i ett vakuum centrifugalkoncentrator vid högst 45 ° C. (Tar ca 1-2 timmar).
- Resuspendera torkas supernatanten i 200 pl av 5% acetonitril / vatten. Vortex kort. Frys vid -80 ° C.
5. Fastfasextraktion
- Torka MTBE fraktion under kväve vid 35 ° C med ett bra flöde av kvävgas (tar ca 10 till 15 min).
- När den är helt torr, stoppa flödet av kväve och snabbt återsuspendera i 1 ml kloroform (CHCI3) under användning av en glaspipett. Vortex kort.
Anm: Lösningsmedel såsom CHCI3 har låg viskositet. Under pipettering, orsakar låg ytspänning lösningsmedelsförlusten från pipetten. Det rekommenderas att pipettspetsen vara prewet minst två gånger för att möjliggöra ekvilibrering mellan lösningsmedlet som pipetteras och utrymmet i pipetten. En gastät spruta kan också användas om det finns. - Skapa ett SPE vakuumgrenrör och NH2
- Varma prover till RT och alltid hålla svävande i en jämn ström av N2. Värmer till RT tillåter lipid resuspension och kvävet kommer att förhindra oxidation och polymerisation av lipider.
- Tvätta och skick SPE patron 2x med 400 pl hexan. Göra sig av med och ersätta med nytt glas provröret.
- Lägg prov till SPE-kolonn, samla flöda genom i glasrör.
- Med glaspipett tillsätt 1 ml 02:01 CHCI3: IPA, samla strömma igenom i samma glasrör (detta är den neutral fraktion).
- Torka den neutrala fraktionen under N2 för att minimera oxidation (tar ca 10 till 15 min).
- Med glaspipett tillsätt 1 ml av 5% ättiksyra i dietyleter, samla strömma genom i nya glasrör (detta är den fettsyra fraktion).
- Torka den fettsyrafraktionen under N2 för att minimera oxidation (tar ca 10 till 15 min).
- Använd plastspetsar för att lägga 800 &# 181, l av metanol till SPE-patron, och samla genomströmning i 15 ml plast koniska rör (detta är Fosfolipidfraktionen).
- Överför fosfolipidfraktion till 1,5 ml centrifugrör. Torka proven med en vakuum centrifugalkoncentrator vid 45 ° C (tar omkring 1-1,5 h).
- Resuspendera varje prov från de tre fraktionerna i 200 ul av 100% metanol, virvel, och överföring till autosampler vialer skruvkork för lagring.
6. Prov Förvaring
- Förvara alla prover vid -80 ° C tills produkten ska instrumentanalys.
Anm: Extraherade prover, rekonstituerades i organiskt lösningsmedel kan lagras vid -20 ° C. Men om det inte rekommenderas som potentiella metaboliter av intresse kommer att brytas ned vid denna temperatur. Vätskeförvaring kväve rekommenderas också inte som utredare har rapporterat föroreningsfrågor, specialflaskor lagring behövs, och det är brist på homogenitet i kammaren Causjunger stora temperatursvängningar. - Om provvolymer är små (<100 | il), använd skär i flaskorna för att förhindra lösningsmedelsavdunstning i gasutrymmet under lagring.
- Undvik frysning-tining av proverna. Tina proverna endast en gång, precis innan instrumentanalys. Upprepade freeze-tinar resultera i prov nedbrytning.
7. Vätskekromatografi Förhållanden
- Använd en C-18 2,1 mm x 50 mm (1,8 ^ m) analytisk kolonn med en C-18 2,1 mm x 12,5 mm (5 ^ m) skyddskolonn för att analysera den hydrofoba fraktionen.
- Ställ in den automatiska provtagningstemperaturen till 4 ° C, kolonntemperaturen till 60 ° C, injektionsvolymen till 2 ^ il och flödeshastigheten till 0,25 ml / min.
- Använd 0,1% myrsyra i vatten för mobil fas A, och 0,1% myrsyra i isopropanol: acetonitril: vatten (60:36:4) för mobil fas B.
- Kör följande gradienteluering profilen: Starta ent 30% B, och ökning till 70% B från 0 till 1 min och därefter öka till 100% B från 1 till 15 min och håll nere i 5 min, följt av 5 min 10% B tvättning och 5 min efter loppet.
- Använd en HILIC 2,1 mm x 50 mm (2,6 ^ m) analytisk kolonn med en vaktkolonn för att analysera den hydrofila fraktionen.
- Ställ in den automatiska provtagningstemperaturen till 4 ° C, kolonntemperaturen till 20 ° C, injektionsvolymen till 2 ^ il och flödeshastigheten till 0,5 ml / min.
- Använd 50% acetonitril i 10 mM ammoniumacetat, pH 5,8 för mobil fas A, och 90% acetonitril i 10 mM ammoniumacetat pH 5,8 för mobil fas B.
- Kör följande gradienteluering Profil: Start vid 100% B från 0 till 2 min, för att sedan minska till 50% B från 2 till 15 min, följt av 5 min 0% B tvättning och 10 min efter loppet.
Representative Results
Hela provberedning teknik utfördes såsom beskrivits ovan och de viktigaste och / eller relevanta aspekter presenteras nedan. Hydrofila och hydrofoba interna standarder spetsades i poolade plasmaprover för att utföra direkta jämförelser av de interna normer och endogena metaboliter abundances med olika extraktionsmetoder. Uppgifter Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) analyserades med användning av kvalitativ och kvantitativ programvara och resulterade i utmärkt återvinning och separation av båda de endogena föreningarna och interna standarder Figur. 1 visar effektiviteten av MTBE-SPE-metod i extrahera både lipid-standarder (A) och endogena föreningar (B).
Totalt sett var bättre utvinning och bevakning av de metaboliter som erhållits jämfört med andra metoder såsom metanol extraktion, eller "MTBE endast utdrag när antalet of egenskaper jämfördes med hjälp av kvalitativa och kvantitativa mjukvara efter LC-MS-analys. Till exempel, med enbart metanol extraktion, variationen för kreatinin-D 3 var 15,2%. Men med MTBE LLE, detta sänktes till 1,04% CV. Med hjälp av MTBE, var reproducerbarheten av lipider och vattenbaserade föreningar <8% och <5%, jämfört med en enklare metanolutvinning vilket resulterade i en större variation på 29% respektive 15% för lipider och vattenföreningar. De interna standarder som används för att övervaka lipid återvinningar - testosteron-D 2, C17 ceramid, 15:00 PC, och 17:00 PE ökade med 26%, 200%, 100%, 400% respektive jämfört med enbart hjälp av metanol. Liknande ökningar upptäcktes för fettsyror interna normer och fosfotidylkolin och phosphotidylethanolamine endogena metaboliter. Andra endogena metaboliter såsom sfingosiner, ceramider, diglycerider, triacylglyceroler, kolesterol och sfingomyelin var antingen inte upptäcksmed hjälp av metanol eller upptäcktes på försumbara nivåer. Men dessa endogena lipider var lätt att upptäcka med hjälp av MTBE utvinning.
I vår analys som jämför standardprotokoll, erhölls följande resultat erhölls: Metanol utfällning enbart gav en 1851 metaboliter gav metanol-etanolutfällning 2073 metaboliter, MTBE med vätske-vätske-extraktion gav 3125, och MTBE med vätske-vätske-och fastfas-extraktion utvanns 3806 metaboliter. Därför denna metod leder till ett större antal metaboliter som extraherade, troligen på grund av minskad jon förtryck och renare prover före LC-MS.
Figur 2 visar effektiviteten i att separera de hydrofoba metaboliter i sina respektive kemiska klasser för mer självsäker metabolit identifiering. Det är minimal överlappning av de föreningar som identifierats i de tre lipidfraktioner efter SPE. Till stöd, Figur 3 visaråtervinning av interna standarder som visar att ISTD s eluerades i fraktionen som rör deras kemiska klassen.
Kvalitet kontrollprover används för att utvärdera kvaliteten på provberedning, för att fastställa eventuella batch effekter när flera dagar av analys krävs för ett stort urval set, och att övervaka instrument reproducerbarhet. Kromatogram undersöks för att se till att spetsade-in standarder är större än 90% återvinns med massa fel på mindre än ± 3 ppm och retentionstidsfönster på mindre än ± 5%. Om dessa kriterier inte uppfylls, är resultaten kasseras och proverna analyseras om. I ett fall av satseffekter som innebär en förskjutning i retention observeras för en sats, kan dataanalys programvara korrigera för detta. En tidigare preparerat parti av sammanslagna plasmaprover genomgick provberedning. Fraktionerna sedan sub-alikvoter i autosampler flaskor och förvaras vid -80 ° C för användning i övervakningsinstrument villkortioner under varje provanalys. Tabell 1 visar resultaten från dessa spik i standarder. Fettsyran negativ jonisering läge fraktionen (data visas i tabell) användes inte för analys eftersom% CV av spik-in normer för QC urvalet var större än 10%. Den datamängd för denna del därför kasseras och instrumentet inspekteras och underhållas. Tabell 2 visar resultaten från endogena metaboliter i proverna efter tre dagar av provpreparering och tresidiga instrument injektioner. De endogena metaboliter i provberednings QC prover är alla reproducerbara, betecknar styrka provberedning samt instrumentinjektions reproducerbarhet.
När provberedningssteg inte följs ordentligt, dock är opålitliga och inkonsekventa resultat erhålls. Figur 4 visar resultaten när proteinet fällningssteget i metodenföljs inte som beskrivs. Tre operatörer, A, B och C utförs samma prov framställningsprocedur på sammanslagna plasmaprover. Operatör A, snarare än att pipettera den erforderliga mängden supernatant per experimentprotokollet, istället pipetter> 1 ml för både tvättar med några av pelleten. Detta resulterade inte bara i ett högre antal falskt positiva för den fraktion, men ökade variabiliteten av uppgifterna.
Det kromatografiska reproducerbarhet data kan ses i figur 7. Poolad plasma prover framställdes i tre exemplar på separata dagar med användning av protein utfällning, vätske-vätske-extraktion, och fastfas-extraktion såsom beskrivs i detta protokoll. Varje fraktion analyserades med hjälp av den kromatografiska separationen beskrivs i avsnitt 7 i protokollet. Prover injicerades sedan i tre exemplar på LC-MS för att utvärdera instrumentet och provberedning reproducerbarhet. Denna konsekvent överlappning visar både strength av reproducerbarheten för provberedning, om den framställs på tre olika dagar, såväl som styrkan i den kromatografiska metoden att producera reproducerbara resultat. En ökning av kemiskt brus observeras för den negativa joniseringen läge för fettsyrafraktionen. Detta kan inträffa på grund av föroreningar i de LC-MS-lösningsmedel och kan resultera i inkonsekventa kvantitativa metabolomic resultat. Därför endast metaboliter som elueras före 9 minuter analyserades.
När du kör långa arbetslistor, kan en förlust av instrumentets känslighet och förändring i buffertkoncentrationer uppstå över tiden resulterar i minskad signalstyrka och retention tidsförskjutning. Om uppehållstiden överlappning variation är mindre än 5% och signalintensitetsvariation är mindre än 10%, är data fortfarande inom standardlaboratoriegränser. Analys programvara kan användas för att anpassa och normalisera data för att korrigera för instrumentet och uppehållstid drift. Om emellertid variationen är LARge, då orsaken måste bestämmas. När detta åtgärdas, proverna kan analyseras på nytt.
Figur 1. Överflödet av lipid ISTDs (A) och endogena metaboliter (B) efter extraktion och omvänd fas-kromatografi (RPC) 12. Extraktion genomfördes och resulterande proverna separerades med hjälp av RPC och analyserades med användning av LC-MS i positiv och negativ jonisering läge. Denna siffra har ändrats från Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).
Figur 2. En jämförelse av MTBE-SPE fraktionerna 12. Metaboliterna som identifierats i varje fråtgärder jämfördes för att identifiera mängden överlappning under SPE delen av prep. Siffrorna i Venndiagram speglar antal metaboliter som detekteras i varje fraktion. Här liten överlappning observeras bland de tre fraktionerna, som representerar framgångsrik förening utvinning och metabolit klass separation under SPE steget. Denna siffra har ändrats från Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).
Figur 3. Återhämtningen av ISTDs i fraktioner med hjälp av MTBE-SPE-metoden 12. Extraktion genomfördes och resulterande proverna separerades med hjälp av RPC och analyseras med användning av LCMS i positivt och negativt läge såsom beskrivits i texten. Denna siffra har ändrats från Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013). </ P>
Figur 4. Resultat från pelletfraktionen utarbetats av tre operatörer. Tre provberedning operatörer A, B och C utförs samma proteinberedning steg på sammanslagna plasmaprover. Siffrorna i Venndiagram speglar antal metaboliter som detekteras av varje operatör. Operatörer B och C pipet önskad volym per provberedningsprotokoll medan operatören A pipet hela supernatanten och en del av pellets, vilket resulterade i över 500 fler metaboliter, majoriteten vara falska positiva för den specifika fraktionen.
Figur 5. Bildning av proteinpellet under protein utfällningssteget <. / Strong> (A) 100 ^ il humant plasma före provpreparering, (B) i plasma efter tillsättning av iskall metanol, (C)-protein pellet bildad på botten av röret efter centrifugering vid 0 ° C under 15 min vid 18000 x g.
Figur 6. Separation av de hydrofila och hydrofoba lager under vätske-vätskeextraktion (LLE) steg. Det organiska lösningsmedlet metyl-tert-butyleter (MTBE) och vatten användes för att separera de hydrofila och hydrofoba metaboliter. MTBE-skiktet har lösts upp icke-polära föreningar och vattenskiktet har lösts upp polära föreningar (A) plasma supernatanten efter avlägsnande av protein,. (B) i plasma efter torkning under kväve; (C) i plasma efter tillsättning av MTBE;
Figur 7. Kromatogram av fraktioner från en vald datamängd Provberedning. Utfördes på tre separata poolad plasma QC-prover och varje prov injicerades i tre exemplar på LC-MS-instrumentet. Representerade är totalt jonkromatogram av plasmaprover som förvärvats med hjälp av LC-MS-parametrar som anges i avsnitt 7 i metod-protokollet. Den kromatografiska representation av andra biologiska vätskor varierar beroende på skillnader i metabolit sammansättning.k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fraktion | Jonisering Läge | Inre standard | n | Genomsnittlig Peak Area | Peak Area% CV |
| Vattenhaltig | Positiv | Kreatinin-D 3 | 31 | 2217311 | 3,8% |
| Neutrala lipider | Positiv | Triglycerid-D 5 | 31 | 4837032 | 9,9% |
| C17 Ceramide | 31 | 12736707 | 7,9% | ||
| Fosfolipid | Positiv | 15:00 PC | 32 | 1248929 | 9,3% |
| 17:00 PE | 32 | 517234 | 7,9% |
Kontroll Kvalitet Tabell 1. Resultat från spetsade interna standarder. Sammanslagna plasmaprover från en emfysem musmodell dataset analyserades för att övervaka instrumentförhållanden på en daglig basis för denna multi-veckors studie. Kvantitativ analys mjukvara användes för att bestämma toppområdena interna standarder, (n = antal instrument QC injektioner).
| Fraktion | Jonisering Läge | Endogena metaboliter | Genomsnittlig Peak Area | Peak Area% CV |
| Vattenhaltig | Positiv | Kreatinin | 2554574 | 2,3% |
| Valin | 3712151 | 3,3% | ||
| Glukos | 2669190 | 6,9% | ||
| Neutrala lipider | Positiv | 3-Dehydrosphinganine | 226644 | 3,9% |
| 11301 | 8,2% | |||
| DG (P-14: 0/18: 1) | 364119 | 1,9% | ||
| Fosfolipid | Positiv | PC (24:0 / 0:0) | 27599 | 0,9% |
| PC16: 0/22: 6) | 2873326 | 4,5% | ||
| PI (16:00 / 18:01) | 112998 | 4,4% | ||
| Fettsyra | Positiv | 10-oxo-5 ,8-decadienoic syra | 1363284 | 2,3% |
| 16-oxo-heptadekansyra | 83700 | |||
| 2-metyl-valeriansyra | 285782 | 5,7% | ||
| Fettsyra | Negativ | 10-hydroxi-8-oktadecensyra | 10042 | 4,9% |
| (R)-laballenic syra | 173929 | 6,5% | ||
| 2-keto-valeriansyra | 35488 | 6,0% |
Kontroll Kvalitet Tabell 2. Resultat från endogena metaboliter. Poolade plasmaprover från en mänsklig sjukdom dataset analyserades för att övervaka provberedning reproducerbarhet på separata dagar. Prov framställdes i tre exemplar över tre dagar (n = 9 prep QC injektioner).
Discussion
Ett mål för kliniska metabolomic studier är att identifiera förändringar i metabolomen samband med sjukdom eller behandlingar. Därför provberedningsmetoder måste vara robust, konsekvent, och överföras från tekniker till tekniker och från laboratorium till laboratorium 22. Den resulterande data behöver vara representativa för urvalet, och identifierade förändringar måste återspegla det urval som i stället prov fel förberedelse. Därför noggrann pipettering, rätt temperatur, effektiv dekantering av blandbara skikt, torkning under kväve, och användning av samma märken och storlekar av glas och tips behövs.
Under proteinfällningssteget, är det viktigt att samma mängd lösning dekanteras från varje pellet. Detta reducerar variation i volym och som sådan minskar variationen i exempeldata. Detta protein utfällningssteg är nödvändigt för metabolomic studier och kan inte hoppas över, eftersom det tar bort proteinet frånproverna före liten molekyl profiling analys på masspektrometern. Den eliminerar patogener och stora makromolekyler, och släpper bundna metaboliter från proteiner 7. Brist på protein ackumulering i proverna expanderar HPLC-kolonnen livstid och ökar noggrannheten och kvaliteten på resultat. Figur 5 är en avbildning av det protein pellet bildad vid utförande av denna teknik på plasmaprover. Detta gör det möjligt att upptäcka de små molekyler, förbättrar jon överflöd, och minskar matriseffekter från proteiner i provet. Dessutom, eftersom det förutsätts att alla proteiner avlägsnas i detta steg skulle de aminosyror som detekteras under LC-MS-analys har sitt ursprung från metabola förändringar snarare än från proteinnedbrytning.
Det Extraktionssteget vätska-vätska är kritisk eftersom det skiljer de hydrofila och hydrofoba metaboliter i två icke blandskikt Figur 6. Visar LLE förfarandet och ett repsentation av LLE-skiktet. En felaktig separation av de två skikten resulterar i metaboliter, antingen försvinner eller som elueras i båda fraktioner. Noggrann tillämpning av detta steg minskar antalet hydrofila föreningar som förekommer i den hydrofoba fraktionen. Resultaten för dessa föreningar blir otillförlitliga eftersom det inte går att fastställa vilken del innehåller representativa resultat. När du gjort korrekt, är metabolit överlappning minskas.
För att förhindra oxidativ nedbrytning, särskilt i lipider utan även i små molekyler som kan innehålla tiolgrupper till exempel, exponering för syre måste hållas till ett minimum. Därför är detta förfarande utförs alltid under kväve för att minska / förhindra oxidation av lipid-eller tiol-innehållande föreningar. Dessutom är en snabb överföring av provet och / eller lösningen (inom den första minuten) för att minska syreexponeringen, då proverna placerades snabbt under en stadig ström av kväve för att torka ned. När de väl torkat är de omedelbart återsuspenderades i 100% metanol under de ovan diskuterade skäl.
Laboratorier kan dra nytta av denna omfattande metod på ett antal olika sätt; Forskare som vill isolera en klass av föreningar kan välja den del av den metod som bäst passar deras behov. De som söker att bara utföra en protein fällning för att få en pool av metaboliter kan göra det. Om hydrofila metaboliter önskas, såsom många läkemedel, aminosyror och sockerarter, eller om endast hydrofoba metaboliter önskas, såsom triglycerider, epoxider, fettlösliga vitaminer och fosfolipider till exempel, då forskare kan utföra vätske-vätskeextraktion steg efter proteinutfällning och kasta oönskade fraktionen. Utredarna som kräver ytterligare sub-klassificering av de hydrofoba föreningar (neutrala lipider, fettsyror och fosfolipider) kan gå vidare till fraktioneringssteg.
Överväganden Lagring är viktiga i maintaining livskraft prover för senare analys. Om proverna förvaras på fel sätt, kan försämring eller nedbrytning inträffa. Helst ska proverna förvaras i skruvlock bärnsten flaskor borta från ljus för att förhindra nedbrytning av ljuskänsliga arter. Prover bör också förvaras fryst vid -80 ° C för att förhindra metabolit nedbrytning 23-25. Även om det inte diskuteras i detalj här, är proverna alltid förvaras vid 4 ° C i autosampler facket under LC-MS-analys. Detta säkerställer att alla prover som hölls vid en konstant temperatur och att förändringar i omgivningstemperatur inte påverkar viskositet, löslighet, eller stabiliteten hos proverna. Det rekommenderas att de manuella aspekterna av denna procedur, som LLE och SPE, praktiseras för att vinna förtroende och komfort med stegen.
Några begränsningar finns för denna teknik. Diskret separation av de hydrofoba och hydrofila metaboliter kan inte garanteras som vissa föreningar kommer fartygets stabilitetsently partitionera i båda fraktionerna på grund av deras kemiska sammansättning och laddningstillstånd. Dessutom, såsom visas i fig 4, felaktig teknik under proteinpellet extraktionssteget kan resultera i dålig metabolit reproducerbarhet i båda proverna och kvalitetskontroller. Detta påverkar statistiken, särskilt i små datamängder, eftersom den statistiska kraften inte är tillgänglig. Därför är det avgörande att detta steg utförs exakt samma varje gång för varje prov. En annan begränsning är tid. Även om det finns stoppställen i hela detta protokoll där prover kan frysas och prep fortsatte följande dag, bör en hel dag avsättas för att utföra den här proceduren. För det tredje, inte varje förening inom ett biologiskt prov kan undersökas med avseende på jon-suppression. Eftersom det inte är möjligt att identifiera hur matrisen påverkar varje enskild metabolit, är den nuvarande möjlighet att utvärdera de interna standarder som teoretiskt efterliknar vissa klasser av endogenous metaboliter. Slutligen kan absoluta identifieringar inte utföras enbart med denna metod. Tandem MS i samarbete med databassökningar och standarder krävs för absolut metabolit identifiering.
En viktig del av metabolomicsen är identifiering av föreningar. Även om det inte diskuteras i detalj här, var kvalitetskontrollprover analyserades med användning av LC-MS. Flera provberedningsämnen och instrumentämnen framställdes för att användas som bakgrund subtraktion för att minska andelen falska positiva från föroreningar, vilket resulterar i mer tillförlitlig metabolit träffar. Efter detta steg, har antalet "molekylära funktioner" grupperas baserat på m / z, retentionstid och isotopkvot, och addukter för att producera en lista med aktuella ämnen. Även om listan över föreningar har begränsats kraftigt, var resultaten mer tillförlitliga eftersom de inte bygger på flera addukter från samma förening. Den fullständiga metod är omfattande och tillåter isolation av hydrofoba metaboliter såsom neutrala lipider, fosfolipider, fettsyror, triglycerider, och steroider, samtidigt isolera hydrofila klasser i vattenfraktionen, varav eikosanoider, har socker, flavonoider och aminosyror identifierats 12, 26.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Den presenterade handledning genomfördes och utvecklades inom masspektrometri Core Facility vid National Jewish Health. Den njh MS Anläggningen stöds delvis av CCSTI UL1 TR000154. Finansiering från NIH bidrag P20 HL-113445 och R01 HL-095.432 stödde också detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | |
| Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | |
| Water | Honeywell Burdick Jackson | 365-4 | |
| OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35 °C | |
| 12-position vacuum manifold | Phenomenex | ||
| Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | |
| Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
| Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
| Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
| Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | |
| Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | |
| Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
| Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
| Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
| Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |
References
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).
- Clarke, C. J., Haselden, J. N. Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity. Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).
- Wang, X., Zhang, A., Sun, H. Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma. Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).
- Collino, S., Martin, F. -P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics. Nutrients. 1, 101-110 (2009).
- Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. Metabolomic analysis in food science: a review. Trends in Food Scienc., & Technology. 20, 557-566 (2009).
- Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).
- Wishart, D., et al. Metabolome Analysis: An Introduction. , John Wile., & Sons, Inc. 253-288 (2006).
- Vuckovic, D. Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography–mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).
- Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition. NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).
- Dong, M. W. Modern HPLC for Practicing Scientists. , John Wile., & Sons, Inc. (2006).
- Want, E. J., et al. Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).
- Yang, Y., et al. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).
- Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).
- Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction. Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).
- Kerns, E. H., Di, L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., Jiménez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).
- Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease. NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).
- Schulze, H., Sandhoff, K.
- Kuhn, E., et al. Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma. Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).
- Rist, M. J., et al. Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics. Metabolites. 3, 243-258 (2013).
- Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin‘t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine. Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).
- Wood, J. T., et al. Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters. Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).
- Bahr, T. M., et al. Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).
