Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

La dopamine, un des neurotransmetteurs du cerveau essentielles ^1,2, est surtout rejeté par dopaminergiques du mésencéphale (DA) des neurones. La majorité des neurones dopaminergiques de séjourner dans la partie ventrale du mésencéphale ^6.2. Schématiquement, les neurones dopaminergiques du mésencéphale peuvent être divisés en trois anatomiquement et fonctionnellement distinctes des systèmes de projection: mesostriatal, mésolimbique et les voies mésocorticales ^2,5. La voie nigro est impliqué dans le comportement moteur, les voies mésolimbiques jouent un rôle important dans le renforcement, la motivation et l'apprentissage, alors que les voies dopaminergiques projetant vers le cortex préfrontal sont impliquées dans la cognition ^2.

Neurones dopaminergiques sont impliqués dans plusieurs troubles neurologiques humains tels que la schizophrénie, déficit de l'attention, trouble de l'hyperactivité, et la maladie (le PD) de Parkinson ^2,4. PD est caractérisée par une dégénérescence progressive et sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire de liaisonpars compacta (SNC) dans le striatum. La perte de nigro-striée DA neurones entraîne un grave appauvrissement de la dopamine dans le striatum qui est responsable des symptômes moteurs de la maladie (bradykinésie, tremblement de repos, et la rigidité) ^7. La cause initiale de la MP idiopathique n'a pas été établie et les traitements actuels ne sont symptomatiques, visant à restaurer le niveau de dopamine dans le striatum. Le médicament le plus prescrit est la L-Dopa (lévodopa), le précurseur naturel de la dopamine. Bien que l'administration de lévodopa compense la perte de dopamine pendant un certain temps, des complications motrices surviennent après un traitement de longue durée (dyskinésie et états ON / OFF) ^8,9.

La recherche sur les neurones dopaminergiques et PD est en constante progression et les efforts intenses sont déployés pour développer des traitements basés sur la transplantation de cellules, la thérapie génique, ou agents neuroprotecteurs ^10,11. Cependant, reste un problème majeur non élucidé: quelle est la cause de l'extrême vulnerabilité des neurones DA? Une partie de la réponse peut être trouvée dans l'activité des neurones dopaminergiques. Une réduction de l'activité électrique et de l'excitabilité des neurones dopaminergiques semblent augmenter leur propension à dégénérer ^12. Néanmoins, la complexité du PD pathogénie nécessite d'autres études pour identifier les mécanismes impliqués dans la dégénérescence des neurones DA ^13-15.

Les cultures primaires sont particulièrement pertinentes pour l'étude des propriétés des neurones DA ^16-19 et de contester ces neurones à différentes contraintes pour l'évaluation des agents neuroprotecteurs ^20-24. des modèles de culture de Rat sont le plus souvent utilisés, comme la dissection du mésencéphale embryonnaire de rat est plus facile, par rapport à la souris, et des quantités plus élevées de neurones peuvent être obtenus chez le rat. Toutefois, la production de modèles de souris transgéniques de la maladie ²⁵ a considérablement augmenté l'intérêt de la communauté neuroscientifique pour des cultures primaires de la souris ^26-29. Bien que les cultures prepared des animaux nouveau-nés peuvent être utilisés, il est préférable de les préparer à partir d'embryons au stade post-mitotique (E13.5 pour les neurones de mésencéphale), lorsque les neurones ont conservé leur capacité de se différencier. Le protocole ci-dessous présente les neurones de mésencéphale en culture primaire isolés à partir d'embryons de souris (de E13.5), qui sont les plus difficiles à préparer. En particulier, nous fournissons un protocole utilisant un milieu de culture sans sérum pour une meilleure reproductibilité. Les deux étapes les plus critiques dans la préparation de la culture (dissection et dissociation mécanique) seront soigneusement détaillés dans la vidéo associée.

Les souris utilisées dans ce travail ont été pris en charge et traités en conformité avec les lignes directrices du Conseil de l'Union européenne (86/609 / UE) pour l'utilisation des animaux de laboratoire.

1 Préparation des solutions obligatoires

1. Solutions mères
   1. 10x poly-L-ornithine (OLP) Solution: peser 10 mg de bromhydrate OLP (poids moléculaire = 30,000-70,000) et dissoudre dans 70 ml d'eau stérile. Filtrer la solution à l'aide de 0,2 um filtre de la seringue, aliquote, et conserver à -20 ° C.
   2. 30% Solution de glucose: peser sur 30 g de D (+) - glucose et le dissoudre dans de l'eau stérile jusqu'à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   3. Milieu de Eagle modifié de 5x Dulbecco (DMEM) / mélange nutritif F-12 Ham: peser 6 g de poudre DMEM / Ham F-12 et les dissoudre dans de l'eau stérile pour un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   4. 7,5% de bicarbonate de sodium (NaHCO ₃₎ Solutile: peser 7,5 g de NaHCO ₃ et dissoudre dans de l'eau stérile jusqu'à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   5. 1 M HEPES Solution: Peser 23,8 g d'HEPES et dissoudre dans de l'eau stérile jusqu'à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C.
   6. 70% (v / v) d'éthanol: Diluer 70 ml d'éthanol absolu avec 30 ml d'eau stérile.
2. Phosphate Buffered Saline de glucose et les antibiotiques (PBS-GAB): ajouter 10 ml de solution à 30% de glucose et 5 ml de solution de pénicilline-streptomycine à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Conserver à 4 ° C.
3. Sérum bovin fœtal inactivé (IFB): Décongeler sérum bovin pendant une nuit à 4 ° C et inactiver à 56 ° C pendant 30 min. Aliquote dans 50 ml et conserver à -20 ° C.
4. Milieu de culture: Dans l'eau stérile, mélanger successivement 40 ml de 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml de 1 M HEPES, 2 ml de 200 mM de L-glutamine, 2 ml de pénicilline-streptomycine, 4 ml de glucose à 30% unee 3 ml de 7,5% de NaHCO ₃ à un volume final de 180 ml. Filtrer et utiliser le même jour.
5. Hormone Mix
   1. Préparer 180 ml de milieu de culture. Dissoudre 200 mg d'apo-transferrine dans ce milieu.
   2. Peser 50 mg d'insuline et dissoudre dans 2 ml de HCl 0,1 M. Ajouter lentement 8 ml d'eau stérile tout en mélangeant délicatement. Diluer cette solution dans le milieu de culture.
   3. Peser 19,3 mg de dichlorhydrate de putrescine et de se dissoudre dans 10 ml d'eau stérile. Ajouter 10 ml de la solution de la composition de l'hormone.
   4. Préparer une solution de sélénite de sodium à 3 mM dans de l'eau stérile et une solution de 2 mM de progestérone dans l'éthanol absolu. Ajouter 20 ul de chaque solution de la composition de l'hormone.
   5. Filtrer le mélange d'hormones, en aliquote de 10 ml et conserver à -20 ° C.

2 Préparation de plaques et instruments Culture

1. FBS revêtement des plaques Culture: Le jour avant la dissection, préparer 180 ml de milieu de culture. Ajouter 10 ml d'IFBS à 90 ml de milieu de culture. Ajouter 300 ul / puits de milieu de culture / 10% IFBS dans des plaques à 24 puits pré-enduites de poly-D-lysine. Incuber une nuit à 37 ° C. Conserver les médias restants (avec et sans les appels d'offres) à 4 ° C.
2. Stériliser les instruments et les pipettes Pasteur. Rassemblez les équipements énumérés dans le tableau des matériaux ainsi que d'une hotte de classe II à flux laminaire et un incubateur à _CO2.

3. dissection de souris Mésencéphale

1. Sacrifier une souris enceinte de E13.5 (selon les directives institutionnelles). Nettoyez l'abdomen de la souris avec 70% d'éthanol et d'ouvrir la paroi abdominale. Recueillir les cornes utérines, ouvrez-les avec des ciseaux délicats, disséquer chaque embryon de cornes utérines, et enlever les membranes amniotiques. Placer les embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant stérile PBS-GAB et lavez-les par transfert dans 3 salles de bains successifs identiques en utilisant une pince. Pour dissection, placer les embryons par 3 dans une boîte de Pétri stérile de 60 mm.
2. Move le plat final Petri sous la loupe binoculaire. Ne pas décapiter les embryons. Avec des ciseaux Vannas, exciser le cerveau.
   1. Retirez délicatement et jeter les régions contremaîtres et du cerveau postérieur. Pour le côté rostral, couper près de la région du thalamus, de la coupe de côté caudal à la région de l'isthme, retirez le colliculus supérieur.
   2. Une fois le mésencéphale ventral est isolé, retirer délicatement les méninges à l'aide de pinces ultra-fines. Recueillir les segments disséqués, sans les méninges, dans un tube de 13 ml stérile remplie de PBS-GAB.
3. Nettoyez le tube contenant le mesencephala à fond avec 70% d'éthanol et l'amener sous le capot.

4. cellule de dissociation

1. Laver mesencephala 3x avec PBS stérile-GAB. Autoriser les fragments du cerveau à régler entre chaque lavage et d'éviter de perturber le tissu. Après le dernier lavage, éliminer soigneusement autant que possible la solution et incuber segments du cerveau dans 3 ml de trypsine / EDTA pendant 15 min à 37 ° C dans unIncubateur à CO _2.
2. Feu-polissez les pipettes Pasteur afin de maximiser la survie des neurones que la fin d'une pipette de verre non poli est forte et peuvent endommager les cellules au cours des étapes de dissociation. Légèrement réduire le diamètre de l'extrémité (jusqu'à 0,5 mm) de la pipette Pasteur tandis que le feu-polissage.
3. Retirez délicatement autant solution / EDTA trypsine que possible et ajouter 10 ml de milieu de culture / 10% les appels d'offres. Laver les segments du cerveau 3x avec milieu de culture / 10% les appels d'offres.
4. Utilisation de la pipette Pasteur polie au feu, commencer dissociation de mesencephala dans 6 ml de milieu de culture / 10% les appels d'offres. Triturez 10x (éviter les bulles d'air), permettent aux morceaux de s'installer, puis recueillir la moyenne dans un nouveau tube stérile de 13 ml.
5. Ajouter 6 ml de milieu de culture, répéter l'étape précédente une fois et récupérer le milieu contenant les cellules dissociées dans le même tube de 13 ml.
6. Centrifuger les cellules à 160 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du milieu de culture supplémenté avec10% mélange d'hormones.

5. cellulaire Placage

1. Compter les cellules en suspension dans une cellule de Malassez et ajuster le volume du milieu à une concentration de 600 000 cellules / ml. Environ 1,7 millions de cellules peuvent être obtenues à partir de l'un mésencéphale de souris.
2. Retirer FBS contenant un milieu de revêtement de plaques à 24 puits et ajouter dans chaque puits 1 ml de suspension cellulaire (600 000 cellules / puits, 2-4% de cellules TH +).
3. Incuber la plaque à 37 ° C et 5% _CO2 / 95% air. Pas de changement de milieu est nécessaire. Les neurones dopaminergiques sont matures après environ 5 à 7 jours in vitro (expression cohérente du transporteur de la dopamine). Maintenir les cellules en culture jusqu'à 15 jours sans remplacement du milieu.

Protocole 6 de immunofluorescence

1. Nettoyage des lamelles couvre-
   1. La veille de la dissection, ajoutez 10 ml d'HCl 1 M dans une boîte de Pétri. Lay à la surface des liquides 12-15 lamelles de verre et attendre 15 min.
   2. Coulez le couvercleglisser dans le liquide et attendre 15 min.
   3. Retirer HCl et laver 3x avec de l'eau.
   4. Laver les lamelles rapidement avec de l'éthanol pur une fois, puis ajouter de l'éthanol pur à l'antenne et attendre 30 min.
   5. Sous le capot, enlever des lamelles nettoyés dans de l'éthanol et ajouter 1 lamelle par puits d'une plaque de culture cellulaire de 12 puits en utilisant des pinces stériles.
   6. Laver deux fois avec de lamelles de l'eau stérile (1 ml / puits). Ensuite, lavez-les une fois avec du PBS stérile.
2. Revêtement des Lamelles
   1. Retirer PBS et ajouter 500 pl / puits de 2x OLP (dilué dans du PBS). Incuber pendant 4 h à 37 ° C dans l'incubateur à CO _2.
   2. Retirer la solution de l'OLP et laver 3 fois avec du PBS stérile.
   3. Retirer du PBS et ajouter 500 pl / puits de 20% les appels d'offres / 1 g / ml laminine. Incuber pendant une nuit à 37 ° C dans l'incubateur à CO _2.
3. Étalement des cellules pour immunofluorescence
   1. Éliminer le milieu de revêtement de plaques à 12 puits.
   2. Ajouter 900,000 cellules / puits dans un volume de 2 ml et croître les cellules à 37 ° C dans l'incubateur. Les cellules peuvent être maintenues en culture jusqu'à 15 jours sans remplacement du milieu.
4. Immunocoloration
   1. Retirer moyen de plaques à 12 puits et laver avec 500 pl / puits de DMEM préchauffé à 37 ° C.
   2. Ajouter 500 pl / puits de DMEM préchauffé à 37 ° C, puis ajouter délicatement 160 pl / puits de 8% de paraformaldéhyde (PFA, 2% concentration finale) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
   3. Retirer PFA et laver 3 fois avec PBS / 0,1 M de glycine pendant 10 min.
   4. Retirer PBS, ajouter 300 pl / puits de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de sérum de chèvre et incuber pendant 30 min à température ambiante.
   5. Éliminer le milieu, ajouter 300 ul / puits de l'anticorps primaire dilué dans du PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de sérum de chèvre et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Les anticorps primaires qui peuvent être utilisés pour la détection des neurones dopaminergiques et la caractérisation de la culture sont indiqués dans le tableau des matériaux. Garder1 bien sans anticorps primaire à évaluer pour le fond des différents anticorps secondaires.
   6. Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS / 0,2% de gélatine pendant 10 minutes.
   7. Éliminer le milieu, ajouter 300 pl / puits d'anticorps secondaire dilué dans du PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de sérum de chèvre et incuber pendant 1 heure à température ambiante, dans l'obscurité. Anticorps secondaires utilisés sont indiqués dans le tableau des matériaux.
   8. Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS / 0,2% de gélatine pendant 10 minutes.
   9. Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS.
   10. Monter les lamelles sur le côté verre diapositives de cellule dans une goutte de Vectashield. Gardez les lames à température ambiante pendant la nuit pour laisser le milieu de montage à sec, puis les stocker à 4 ° C.
   11. Acquérir des images à l'aide d'un microscope confocal ou un microscope à contraste de phase équipé pour l'épifluorescence. Des images représentatives ont été acquises avec un microscope confocal Leica SP2 UV.

Un organigramme illustré les étapes de culture de mésencéphale est représenté sur la figure 1. Brièvement, après la collecte d'embryons E13.5 de souris Swiss enceinte, mésencéphale ventral est disséqué à partir de l'ensemble de l'embryon. Les fragments isolés du cerveau sont successivement soumis à une digestion enzymatique et dissociation mécanique. Les cellules dissociées sont sédimentées par centrifugation, remises en suspension dans du milieu de culture et étalées dans des plaques à 12 ou 24 puits pré-enduits. Les cellules sont maintenues jusqu'à 15 jours sans remplacement du milieu.

Un organigramme détaillé du mésencéphale dissection ventrale, correspondant à l'étape 3.2, est présenté à la figure 2. Lignes rouges pointillées indiquent les trois principales lignes de coupe sur une représentation schématique du cerveau E13.5 de la souris (adapté de Prestoz et al. 30) et les étapes de découpe sont illustrés.

des images à contraste de phase de la culture après 1, 4, et 7 jours de vitro (DIV) sont présentés dans la figure 3. neurones développer rapidement des extensions et la germination (figure 3A). Branchement et les ramifications sont plus étendues à DIV4 et DIV7 (figures 3B-3C).

Les neurones dopaminergiques sont détectés par immunocytochimie en utilisant un anticorps anti-TH (figure 4A). Le nombre de cellules TH + est exprimée par 2,5 cm 2 lamelle (figure 4B). Nous n'exprimons pas le nombre de cellules TH + ainsi que par la densité des cellules est beaucoup plus élevé sur les frontières de la matière plastique revêtu ainsi que sur la lamelle de verre revêtu, qui est au centre sur le bien. Neurones dopaminergiques (TH + cellules) représentent 4.2% de la population totale de cellules sur la lamelle couvre-objet. TH-positifs (TH +) des cellules apparaissent dès DIV1 et leur nombre augmente rapidement pour atteindre un maximum à DIV6.

La proportion relative des cellules est évaluée par marquage par immunofluorescence de cellules DA esprith un anticorps anti-DAT (figure 5A) ou un anticorps anti-TH (figure 5B) et la coloration simultanée de cellules neuronales avec les anticorps anti-MAP2. Immunomarquage représentatif de plusieurs populations de neurones présents dans la culture est également représenté sur la figure 5. Neurones GABAergiques sont colorées en utilisant un anticorps anti-GAD67 (Figure 5C) et représentent environ 50% des cellules. Neurones sérotoninergiques sont détectées avec un anticorps anti-sérotonine (Figure 5D) et représente moins de 1% des cellules dans la culture. La culture de cellules du mésencéphale contient également des neurones glutamatergiques (40% de la culture), les neurones cholinergiques, et de cellules gliales rares (autour de 2 à 3%). Proportion de de cellules gliales est déterminée en utilisant la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) coloration (figure 5E). Identification sans ambiguïté des neurones dopaminergiques du mésencéphale de peut également être réalisé en utilisant des marqueurs spécifiques tels que Pitx3 ou Foxa2 31,32.

Grossissement supérieur immunomarquage de plusieurs populations de neurones présents dans la culture est représenté sur la Figure 6. Neurones dopaminergiques sont détectés en utilisant un anticorps anti-DAT (Figure 6A). DAT coloration reflète DA état neurone de maturation. DAT expression commence à DIV3-4. Neurones GABAergiques et des neurones sérotoninergiques sont colorées en utilisant un anticorps anti-GAD67 (figure 6B) ou un anticorps anti-sérotonine (Figure 6C), respectivement.

Figure 1: Illustré organigramme de la culture de mésencéphale. Principales étapes de culture sont indiquées. (A) Sacrifiez une souris Swiss enceinte, recueillir des embryons E13.5 dans des boîtes de Pétri et lavez-les par des bains de PBS successives. (BC) Sous dissection microscope, dissect ventrale du mésencéphale de l'ensemble des embryons et de les placer dans un tube. (D) Ajouter trypsine-EDTA pour les fragments du cerveau disséqué et digérer à 37 ° C pendant 15 min. (E) Retirez la trypsine, ajouter sérum milieu contenant de culture et d'effectuer dissociation mécanique des cellules (10 mouvements de trituration, répété deux fois). (F) Pellet la cellule, les remettre en suspension dans un milieu sans sérum additionné d'hormones et la plaque-les dans prérevêtues 12 ou 24 puits plaques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure tableau 2 de l'écoulement détaillée de la dissection de mésencéphale. Étapes principales de dissection sont indiquées. (A) d'embryons de souris à E13.5 après reenlèvement des cornes utérines. (B) Sans décapiter l'embryon, exciser le cerveau. (C) Représentation schématique du cerveau embryonnaire de souris à E13.5. Pointillés rouges indiquent où le cerveau devrait être ramené à isoler mésencéphale ventral (R, coupe rostrale; C, coupe caudale; D, dorsale coupe). Le vésicules céphaliques télencéphale, diencéphale, mésencéphale et rhombencéphale sont délimitées en bleu, violet, rose, et gris, respectivement. Aq, aqueduc; Hypoth, l'hypothalamus; LGE, éminence ganglionnaire latérale; LV, ventricule latéral; MFB, médian du cerveau antérieur faisceau; MGE, éminence ganglionnaire médiane; sc, colliculus supérieur; Thal, le thalamus; VM, mésencéphale ventral; 4V, quatrième ventricule (adapté de 30). (D) des lignes de coupe sont indiqués par lignes pointillées rouges sur un cerveau de la souris E13.5. Cerveau (E) Souris après élimination des régions contremaîtres et du cerveau postérieur (après coupe R). cerveau (F) de souris après élimination du superior colliculus (c'est à dire après des coupures R et D). (G) Vue ventrale d'un mésencéphale isolé (c'est à dire après coupe R, C, D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 images à contraste de phase de la culture à différents stades de développement. (A) DIV1, (B) DIV4, et des images (C) DIV7 de la même culture sont présentés. Les images ont été acquises sur des cellules vivantes avec un microscope inversé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 La tyrosine hydroxylase coloration des neurones dopaminergiques. (A) A DIV8, les neurones dopaminergiques ont été détectés en utilisant un anticorps anti-TH. Apocalypse a été réalisée en utilisant un 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) kit. L'image a été prise avec un microscope inversé. (B) Nombre de neurones TH + dans les cultures de mésencéphale en fonction de l'âge de la culture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 proportion représentative des neurones et des astrocytes dans la culture. DIV4 A, dans les neurones dopaminergiques (magenta) ont été détectés en utilisant l'anti-DAT (A) ou anti-TH anticorps (B) et les neurones GABAergiques, les neurones sérotoninergiques et les astrocytes (en magenta) ont été détectés en utilisant des anti-GAD67 (C), anti-sérotonine (D), et des anticorps anti-GFAP (E), respectivement. Cellules neuronales (en cyan) ont été colorées avec un anticorps anti-MAP2 (AE). Les images ont été acquises avec un microscope inversé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 6 représentant la coloration de plusieurs populations de cellules de la culture de mésencéphale. (A) neurone dopaminergique détecté par DAT coloration à DIV9 (en rouge). (B) de neurones GABAergiques visualisées par le GAD-67 coloration à DIV9 (en vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.