Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Chaque villosité intestinale est composée de deux compartiments tissulaires principaux : une couche superficielle épithéliale et un noyau mésenchymateux. L’intestin grêle de la souris se forme au 10e jour embryonnaire lorsqu’une feuille d’endoderme se ferme et se scelle pour former un tube d’épithélium entouré de cellules mésenchymateuses³. Ce tube plat d’épithélium subit une prolifération rapide, augmentant à la fois en longueur et en circonférence et subit des réarrangements spectaculaires impliquant des changements dynamiques de forme cellulaire¹. Dans le même temps, le mésenchyme environnant subit également de nombreux processus de développement, notamment la formation du plexus vasculaire, la différenciation des muscles lisses et le recrutement des neurones entériques⁴. Dans l’intestin grêle proximal au 14,5e jour embryonnaire, des condensations (grappes) de cellules sensibles à Hedgehog et PDGF commencent à se former à côté de l’épithélium^2,5. La formation d’amas mésenchymateux continue de s’étendre sur toute la longueur de l’intestin de sorte qu’ils couvrent l’intégralité de l’intestin grêle au jour embryonnaire 16,5². Au fur et à mesure que les amas mésenchymateux se forment, les cellules épithéliales les plus proches des amas commencent à se retirer du cycle cellulaire, tandis que les autres cellules épithéliales continuent de proliférer. Les cellules situées directement au-dessus de l’amas mésenchymateux qui se sont retirées du cycle cellulaire commencent à changer de forme lorsque les villosités émergentes se déforment dans la lumière. La croissance ultérieure des villosités est en partie due à la prolifération continue de l’épithélium entre les villosités émergentes. Les amas mésenchymateux restent étroitement adhérents à l’épithélium des villosités en croissance et continuent d’exprimer une variété de molécules de signalisation. La vague d’émergence des villosités se propage sur toute la longueur de l’intestin grêle suite à la formation d’amas mésenchymateux. Au fur et à mesure que l’intestin continue de croître et que la région des villosités intervillosités s’étend entre les villosités émergentes, de nouveaux amas mésenchymateux se forment à côté de l’épithélium des villosités intervillosités et d’autres cycles d’émergence et de croissance s’ensuivent.

Le développement synchronisé de l’épithélium et du mésenchyme est essentiel pour la morphogenèse des villosités. Les molécules de signalisation sont sécrétées d’une couche à l’autre où les récepteurs reçoivent et transduisent le message du signal afin de coordonner le développement entre l’épithélium et le mésenchyme. Les amas mésenchymateux agissent comme des centres de signalisation et expriment une variété de morphogènes^{développementaux 7-10}. La perturbation de la formation ou du motif des grappes entraîne la perte de l’émergence et du motif des villosités. L’inhibition de la signalisation PDGF entraîne moins de grappes et moins de villosités et les villosités qui se forment sont déformées après les grappes anormales¹¹. La perte de la signalisation Hedgehog entraîne une perte complète de la formation des grappes et l’échec de l’émergence des villosités^2,12. Ensemble, ces données démontrent que les amas coordonnent le développement de l’épithélium des villosités avec son noyau mésenchymateux.

En utilisant l’ensemble de ce système de culture d’organes, nous sommes en mesure de modifier la signalisation impliquée dans la diaphonie des amas épithéliaux-mésenchymateux pour déterminer le rôle de ces signaux dans la morphogenèse des villosités. Le sectionnement et la reconstruction optiques confocaux à deux photons permettent de visualiser la formation des amas et l’émergence des villosités en trois dimensions et de mieux comprendre les relations spatiales entre les amas mésenchymateux et leur épithélium sus-jacent. En étendant le système de culture à quatre dimensions, nous pouvons capturer des piles z de grappes et de villosités en développement au fil du temps et observer ces interactions. En fin de compte, la capacité de suivre le développement des villosités de cette manière et d’observer les changements qui se produisent avec une signalisation altérée révolutionnera la compréhension des interactions mésenchymateuses épithéliales dans la morphogenèse des villosités.

NOTE: Toutes les souris ont été traitées avec humanité en utilisant des protocoles approuvés par l'Université du Michigan Medical School Unité de médecine de laboratoire et les animaux selon les directives du Comité de l'Université sur l'utilisation et l'entretien des animaux.

1 Tout le Système de culture d'organes

1. Préparation des milieux et des plaques de culture
   1. Dans une culture de tissu capot, enlevez 5 ml de BGJb médias de la bouteille de et ajouter 5 ml de Pen / Strep. Préparer un stock de travail des médias dans un tube conique de 50 ml, en ajoutant 1 ml de 5 mg / ml d'acide ascorbique à 49 ml de BGJb médias (avec Pen / Strep).
   2. Préparer une plaque de culture à 6 puits en ajoutant 1 ml de chacune des sous transwell.
      NOTE: Si les 6 transwell ne sont pas utilisés, déplacer transwell supplémentaires dans une plaque à 6 puits stérile frais pour une utilisation ultérieure. Ajouter 3 ml de travailler BGJb médias à chacune des trois boîtes de Pétri de 10 cm stériles.
2. Préparation pour la dissection
   1. Faire tremper les outils de dissection dans 70% ethanol et être sûr de garder les outils propres tout en travaillant.
   2. Mettre en place la zone de dissection avec un grand seau à glace et placer la plaque de culture à 6 puits et 10 cm boîtes de Pétri avec BGJb médias sur la glace. Travailler sur la glace autant que possible, tout en disséquant et la préparation des intestins de la culture.
   3. Anesthésier les souris femelles adultes dans une chambre avec isofluorane (100 pi) avant l'euthanasie par dislocation cervicale pour la récolte de l'intestin du foetus.
   4. Après la récolte, les fœtus de leur mère, en scène chaque fœtus soigneusement selon le tableau ¹³ Theiler mise en scène. Ne vous fiez pas aux jours post-coït pour déterminer l'âge de chaque fœtus comme des variations allant jusqu'à 24 heures dans le stade de développement sont régulièrement observés dans une seule portée.
3. Dissection de l'intestin du foetus
   1. Euthanasier fœtus par décapitation avant le retrait de l'intestin.
   2. Disséquer chaque intestin en tampon phosphate salin (DPBS) de 1x Dulbecco puis plaCE dans une boîte de Pétri de 10 cm de travailler BGJb médias.
   3. Retirez délicatement la rate de l'estomac et le pancréas de l'estomac et du duodénum supérieur.
   4. Séparez délicatement l'épiploon prenant soin de laisser l'épiploon attachée autant que possible et en séparant seulement assez de connexions pour permettre à l'intestin pour être redressé.
      NOTE: Pour les intestins plus que E14.5 ou ceux qui sont mis en culture pendant plus de 24 heures, séparer délicatement l'intestin en 3 segments égaux pour permettre contenu luminal de couler à travers l'intestin et être expulsés des extrémités coupées. Toutefois, pour les cultures commencé avant E13.5, attendre après 24 heures de culture avant de se séparer les 3 segments de l'intestin pour permettre la séreuse de croître correctement sur toute la longueur de l'intestin.
   5. Utilisez une pipette de bouche pour transférer les morceaux intestinales sur les transwell de la plaque de culture (1.1.2).
   6. Repositionner délicatement les intestins au besoin afin qu'ils soient directement à travers la transwell.
      NOTE: Une fois que les intestins commencent à s'installer contenu luminal dans le tube, les plier dans l'intestin entraînera une sauvegarde et des dommages à l'intestin.
4. Culture et le traitement
   1. Retirez le support sous le transwell, ajouter 700 ul de milieu de traitement (médias travaillent avec des protéines recombinantes ajoutés ou des inhibiteurs pharmacologiques) dans le cadre du transwell.
   2. Ajouter 300 ul de milieu de traitement goutte à goutte sur le dessus de l'intestin et laisser tremper à travers le transwell. Repositionner les intestins comme nécessaire.
   3. Changer agents de traitement au moins une fois par jour ou plus souvent fonction de la demi-vie du réactif de traitement.
5. Préparation de protéine des billes d'agarose imprégné d'une source localisée de réactif de traitement
   1. Remettre en suspension les billes d'agarose dans leur conteneur de stockage et transférer 100 pl de billes d'agarose dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
   2. Remplir le volume restant du tube avec 1x stérile Phosphate solution saline tamponnée (PBS) et mélanger les perles pour les laver. Placez le tube de centrifugeuse dans un rack pendant quelques minutes pour permettre aux billes de se déposent au fond et puis pipette au large de la PBS à partir au-dessus des perles. Remplir le tube de centrifugeuse stérile de PBS 1x et répéter deux fois plus le processus de lavage.
   3. Préparation de la protéine d'intérêt à deux fois la concentration désirée pour le traitement.
   4. Mélanger 5 pi de billes d'agarose lavés avec 5 pi de la protéine actions 2x et agiter doucement les perles dans la protéine. Placer le tube sur la glace pendant 1 heure, en mélangeant délicatement toutes les 10-15 min.
   5. Rincer les perles brièvement stérile 1x PBS avant de placer les perles sur les intestins.
6. Placement des billes d'agarose
   1. Placez délicatement les billes d'agarose sur le dessus de l'intestin à l'aide d'une pipette de bouche avec des aiguilles capillaires tirés. Placez les perles avec une extrême prudence, car une manipulation brutale peut endommager l'intestin et prévenir le développement des villosités dans la zone lésée.
   2. Placez deux fois plus de billes que nécessaire pour l'analyse depuis les intestins vont subir les mouvements péristaltiques et environ la moitié des billes placées roulera hors de l'intestin au cours de la durée de la culture.
7. Fixation des intestins culture
   1. Retirez délicatement les médias de traitement de dessous de la transwell et permettre aux intestins sécher à l'air pendant 3 min.
   2. Ajouter 1 ml de fixatif sous la Transwell pendant 2 min, puis recouvrir la partie supérieure de l'intestin avec 2 ml de fixatif pour le reste de la période de fixation. Fixer avec 4% de paraformaldéhyde O / N à 4 ° C ou pendant 2 heures à température ambiante.

2. imagerie de l'intestin fixes

1. Imagerie Wholemount
   1. Placez les intestins entiers (avec fluorescence endogène) sur une diapositive avec 100 pi de 1x DPBS. Utilisez une pince à organiser doucement les intestins.
   2. Utilisez un tissu de laboratoire pour retirer soigneusement les DPBS et ajouter immédiatement 100 pi de 70% de glycérol à faire la mo tissure transparente et augmenter la profondeur possible de l'imagerie.
      REMARQUE: Si une plus grande pénétration de l'intestin est souhaité, au lieu de monter l'intestin dans 70% de glycérol, tremper l'intestin dans quelques gouttes d'orientation claire solution pour 10-30 min. Pipeter au large de la solution mise au point claire et monter l'intestin avec le Mont Effacer.
   3. Tremper chaque des quatre coins d'une lamelle en pâte à modeler et ramasser une petite quantité d'argile à utiliser comme entretoises entre la lame et lamelle pour maintenir la lamelle de l'aplatissement de l'intestin.
   4. Sceller la lamelle sur la lame avec valap fondu appliquée avec un coton-tige.
   5. L'image sur les intestins soit un microscope confocal debout ou inversé. S'il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails.
2. Vibratome sectionnement de l'intestin fixes (pour une vue en coupe transversale de structures intestinales)
   1. Intégrer dans les intestins 7% d'agarose dans de petits moules en plastique (10 x 10 x 15 mm) et permettre aux blocs d'agarose àrefroidir et se solidifier.
   2. Retirer des blocs d'agarose à partir de moules en plastique et des blocs d'agarose colle à l'étape de collecte de vibratome avec de la colle instantanée.
   3. Remplir le stade de la collecte de froid de glace 1x DPBS.
   4. Couper des sections à une épaisseur comprise entre 100-150 um. Pour les sections plus épaisses utilisent les solutions de compensation (décrits dans la section 2.1.2) pour visualiser plus profondément dans la section.
   5. Verser vibratome sections de l'étape de la collecte dans un puits d'une plaque à 6 puits pour le stockage à 4 ° C.
3. Immunofluorescence, de tissus vibratome sectionnés fixes
   1. Placez 5-12 sections vibratome par puits dans une plaque de 24 puits avec 1x DPBS.
   2. Retirer 1x DPBS et ajouter 500 ul de solution de perméabilisation par puits. Secouez délicatement les échantillons pendant 25 min à température ambiante.
   3. Après perméabilisation, laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X.
   4. Bloquer les échantillons pendant au moins 30 min dans 500 pi de solution de blocage.
   5. Après blocage, eXCHANGE la solution de blocage avec 500 ul d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage et conserver les échantillons à 4 ° CO / N.
      REMARQUE: Les dilutions d'anticorps primaires qui fonctionnent bien sur des coupes congelées et paraffine fonctionnent généralement bien sur vibratome sections aussi, cependant anticorps nécessitant l'extraction de l'antigène nucléaire en général ne fonctionnent pas bien avec ce protocole (par exemple, BrdU).
   6. Le jour suivant, laver les échantillons 3 fois pendant 15 min à chaque fois avec une solution de blocage.
   7. Après lavage, 500 ul d'appliquer l'anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage. Enveloppez la plaque de 24 puits dans du papier d'aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière et de la roche les échantillons pendant 45 minutes à 2 heures à température ambiante.
   8. Laver les échantillons 3 fois avec du PBS 1X pendant 15 minutes chacun et monter les sections de vibratome sur des lames comme décrit à la section 2.4.
4. Montage sections vibratome
   1. Préparer des lames pour vibratome de montage par couper de fines tranches de double-stick bande et en les plaçant sur les côtés longs des lamelles.
   2. Placez délicatement 5-10 sections vibratome entre le ruban adhésif double-bâton sur les lames dans une goutte de 100 pi de PBS 1x.
   3. Déplier toutes les sections et les étaler en une seule couche sur la diapositive.
   4. Retirez tout excès d'agarose ou des morceaux inégaux qui empêcherait une lamelle de siéger plat.
   5. Soigneusement utiliser un tissu de laboratoire pour absorber l'excès de PBS 1x autour des sections de vibratome.
   6. Ajouter une goutte de milieu de montage aqueux sur des sections de vibratome et lamelle.
   7. Sceller les lamelles sur les lames avec fondu valap appliquée avec un coton-tige.
   8. Image, les sections de vibratome sur soit un microscope confocal droit ou inversé. S'il vous plaît se référer à la discussion pour plus de détails sur la sélection d'un système d'imagerie.

3. imagerie en direct de l'intestin entiers

Intestins récolté de fetuses après E12.5, avec l'épiploon connecté laissée intacte, développer avec succès villosités en culture en utilisant le système ci-dessus. Par conséquent, ce système ex vivo permet la capture d'images en direct z-section de l'intestin de développement qui peut être reconstituée pour une vue en trois dimensions de la morphogenèse au cours du temps.

1. Mise en place d'imagerie en temps réel
   1. Utilisez de la colle instantanée à respecter une membrane de polycarbonate individu à un tamis à mailles fines. Cela fournit un échafaudage de support pour maintenir l'intestin en place sous l'objectif de trempage du microscope confocal verticale. S'il vous plaît se référer à la section de discussion pour plus de détails sur la sélection de microscopes d'imagerie en direct.
   2. Placer le tamis dans le puits central d'une plaque de culture.
   3. Placer l'intestin disséqué sur la membrane de polycarbonate et on ajoute une goutte de colle instantanée à chaque extrémité. Utilisez seulement assez de colle pour fixer l'intestin, mais pas l'enduire!
   4. Ajouter culture libre de médias de phénol rouge ci-dessous le polycarbonatemembrane dans le puits central de la plaque de culture.
   5. Ajouter de l'eau à la bordure extérieure de la plaque de culture à fournir de l'humidité.
   6. Depuis l'intestin foetal subit ondes péristaltiques analogues de contraction dans la culture, ajouter 100 ul d'une solution 1: 5 de xylazine dans du PBS 1x à 3 ml de milieu à contrôler les mouvements de l'intestin, tandis que l'imagerie. Cette posologie sera de contrôler les mouvements intestinaux pour environ 8-10 heures sans compromettre le développement des villosités.
   7. Pour une vue transversale de l'intestin, intégrer les intestins vivants dans une solution d'agarose à 3-4% et couper des sections épaisses (150-500 de um) sur un vibratome. Correspondre à la rigidité de l'agarose avec la rigidité de l'intestin étant déterminée empiriquement et couper le stade de développement. En général, une solution d'agarose à 3% fonctionne bien pour les intestins de moins de E14.5 et une solution à 4% fonctionne bien pour les intestins E15-E16.
   8. Coller les sections de vibratome à une membrane de polycarbonate, apposée sur un tamis à mailles (comme dans la section 3.1.1) etculture comme décrit dans la Section 3.1.2-3.1.6.
   9. Effectuer l'imagerie en temps réel en utilisant un microscope confocal à fluorescence à deux photons (laser d'excitation entre 690-1,040 nm) sur un support vertical avec une table réglable.
   10. Laser à deux photons réglé à 900 nm permet une pénétration profonde avec la meilleure résolution pour les signaux de GFP. Il réduit les dommages aux tissus en imagerie. En outre, le réglage de la puissance du laser pour l'émission le plus bas possible pour réduire les dommages des tissus. En général pour obtenir une bonne excitation de la GFP, en utilisant 12% de la puissance du laser à deux photons.

Culture des explants entiers de l'intestin fœtal permet l'analyse de la localisation, la distribution, et la durée des molécules de signalisation qui coordonnent le développement intestinal, comme ce système permet la manipulation de la signalisation avec des réactifs pharmacologiques ou des protéines recombinantes. Le système de culture Transwell (Figure 1A, reproduit à partir de Walton et al., 2012) 2 fournit une interface air-liquide, ce qui permet de placer la drogue ou de protéines trempé billes d'agarose sur le tissu, ce qui établit des sources de signalisation locale (figure 1B ). Intestins récoltées à partir d'embryons à E10 à a 18,5 survivre en culture sur transwell et subissent des vagues péristaltique comme de mouvement. Intestins ont commencé dans la culture de E13.5 survivre environ 10 jours ou plus ou moins à P3, le stade de développement de la souris lorsque la formation crypte est d'abord observé. Bien que les intestins à un stade précoce survivent dans la culture, les intestins récoltées avantE12.5 n'émergent pas villosités fiable, probablement parce que la séreuse n'a pas augmenté pour couvrir complètement l'intestin par ce temps. grappes mésenchymateuses se forment et villosités commencent à émerger et d'allonger dans les intestins ont commencé dans la culture à E12.5, E13.5 E14.5 ou, si le développement est légèrement retardée par rapport aux témoins non cultivés, étape appariés (Figure 1, reproduites à partir de Walton et al., 2012) 2. Quel que soit le stade de l'intestin au début de la culture (E12.5 E14.5-), les intestins apparaissent toujours avoir un délai approximatif de 24 heures. Intestins E14 en culture pendant deux jours montrent que la croissance des villosités sont plus proches de ceux de l'intestin E15 que les villosités de l'intestin E16 cultivées in utero (figure 1C-F) 2.

Le motif régulier de groupes mésenchymateuses est révélée par la reconstruction en trois dimensions de sections optiques d'un ensemble récepteur PDGFRa GFP / + intestin à E15.5 (Figure 2 </ Strong>, reproduit à partir de Walton et al., 2012) 2. Cette image se compose de z-piles de 54 champs de vue qui ont été cousues ensemble par le logiciel Leica LAS-AF. Chaque spot intérieur de l'intestin est un cluster mésenchymateuses visualisé par GFP étiqueté nucléaire exprimée à partir du locus PDGFRa 14. La haute résolution de l'image permet au spectateur de zoom avant pour certaines zones à examiner les détails, mais fournit en profondeur les relations spatiales qui ne peuvent pas être tirées à partir des champs de vue uniques ou inférieure grossissement de puissance. Film 1 est une série parcourant le z cousu -stack images 3D qui sont reconstruites sur la figure 2. les sections optiques individuels permettent en outre la visualisation d'informations tels que les cellules individuelles à l'intérieur des groupes.

Sections optiques de immunofluorescence wholemount de la vascularisation intestinale avec PECAM anticorps (BD Pharmingen 557355; dilué 1: 1000) ont été capturées à l'aide excitation à deux photons et reconCONSTRUIT avec Imaris logiciel (figure 3). Cette vue en trois dimensions des vaisseaux sanguins intestinaux révèle un réseau complexe de vaisseaux qui ne peuvent pas être pleinement apprécié par de minces préparations de section. Films 2, une projection tridimensionnelle en rotation de l'image reconstruite sur la figure 3, permet une nouvelle appréciation de la façon dont la amélioration de l'information fournie par la reconstruction tridimensionnelle peut améliorer la compréhension des motifs de structure.

Vibratome sectionnement permet de visualiser en trois dimensions de l'intestin à partir d'une vue transversale. Dans la figure 4, la relation entre les pôles de développement (marqué par PDGFRa GFP / +) 14 avec l'épithélium et mésenchyme entourant (marqués d'une membrane de tomate (Rosa26 mT / mg) 15 est observée.

Sinon, cette relation peut être consulté par immunofluore anticorpsscence coloration (figure 5) des pôles mésenchymateuses (vert, marqué avec un anticorps anti-PDGFRa (SantaCruz C-20, dilué à 1: 200)) avec l'épithélium (rouge, marqué avec un anticorps anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610181, 1: 1000 dilution).

L'ensemble de ce système de culture d'organe peut aussi être étendue pour permettre l'imagerie à deux photons de développement fœtal intestins. Dans cette configuration, l'intestin foetal est collé sur une membrane de polycarbonate supporté par un tamis à mailles dans une plaque de culture à plus grande (figure 6). La taille plus grande du puits de la plaque de culture permet de lentilles de microscope confocal à communiquer avec l'intérieur de l'intestin ainsi.

Figure 1. Développement de l'intestin fœtal entières dans un système de culture Transwell. (A) des intestins fœtaux placés sur une mem transwellbrane dans une plaque de culture à 6 puits avec BGJb médias. Top deux intestins sont E12.5, fond deux intestins sont E13.0. (B) albumine imbibé billes d'agarose de sérum bovin (bleu clair) placés sur un duodénum dans le système de culture transwell. La tache bleue foncée est coloration X-gal pour Ptc LacZ / + dans les pôles de mésenchymateuses marquage ligne journaliste de la souris Hérisson 16. (CF) Les coupes de E14.0 fraîchement récoltés (C), E15.0 (D) et E16. 0 (E), le tissu du duodénum colorées avec la E-cadhérine (vert) et DAPI (bleu). A E14.0, l'épithélium est encore unremodeled pseudostratifié, tout en E15.0 et E16.0, villosités naissantes sont visibles. (F) un segment intestinal identique à celle observée dans (C), mais en culture pendant deux jours (E14 + 2 jours) démontre que les villosités se développent dans la culture, bien que légèrement retardée. Panneaux (FC) sont reproduits à partir de Walton et al., 2012 2 sup>. Barres d'échelle sont de 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Reconstruction tridimensionnelle des champs cousus de z-piles à partir d'un wholemount de E15.5 PDGFRa EGFP / + intestin. L'image est une reconstruction partielle (1 um cinq sections du centre de 65 profilés en Z) à partir de 54 champs cousus de vue capturées à l'aide de la platine motorisée du microscope confocal LeicaSP5X sur une inversé DMI 6000 stand avec excitation à deux photons laser à 900 nm. Logiciel Leica LAS-AF cousu les Z-piles pour former l'ensemble de l'image. Scalebar est de 1 mm.

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Figure 3 reconstruction tridimensionnelle de sections optiques montrant wholemount anti-PECAM immunofluorescence de la vascularisation intestinale dans un duodénum E14. Sections optiques ont été capturés sur un microscope confocal LeicaSP5X sur un DMI verticale 6000 stand avec excitation à deux photons à 900 nm et trois dimensions reconstruit à l'aide du logiciel Imaris 7.6.1. Scalebar est de 200 um.

Figure 4 images confocale de vibratome coupe E15.5 PDGFRa EGFP / +; Rosa26 MTMG jéjunum montrant l'étroite association des PDGFRa EGFP / + cellules des grappes mésenchymateuses (vert) avec leur épithélium sus-jacent et le mésenchyme environnant (rouge, tomate membrane de Rosa26 MTMG). < / Strong> barres d'échelle sont de 50 um dans les panneaux supérieurs et 25 um dans les panneaux inférieurs.

Figure 5: Des reconstructions tridimensionnelles des images confocales de E15.5 vibratome coupe intestins qui étaient immunofluorescence anticorps teinté. Scalebar est de 50 um.

La figure 6 pour l'adaptation du système de culture Transwell à deux photons imagerie en temps réel. (A) Maillage écran est placé dans une boîte de culture (B). Membrane en polycarbonate est collé à l'écran de maille (C). Intestins sont collés sur la membrane de polycarbonate et mis en culture avec de milieu DMEM exempt de phénol.

Film film rotatif 2 montrant la reconstruction en trois dimensions de sections optiques du système vasculaire PECAM teinté dans le duodénum E14 dans la figure 2.

Les auteurs n’ont aucun conflit financier à divulguer.