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Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

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DOI :

10.3791/52099

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20 novembre 2014

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1Division of Neurobiology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 2Division of Developmental Biology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 3Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh, 4Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

Dans cet article

Résumé

L’avancement du western blot à l’aide de la fluorescence a permis de détecter des changements subtils dans l’expression des protéines, permettant des analyses quantitatives. Nous décrivons ici une méthodologie robuste pour la détection d’une gamme de protéines à travers une variété d’espèces et de types de tissus. Une stratégie pour surmonter les problèmes techniques courants est également fournie.

Résumé

La fin des années 1970 ont vu la première utilisation déclarée publiquement du western blot, une technique pour évaluer la présence et l'abondance relative des protéines spécifiques dans des échantillons biologiques complexes. Depuis lors, la méthodologie western blot est devenue un élément commun de la biologie moléculaire répertoire expérimental. Une recherche rapide de PubMed en utilisant le terme "western blot" suggère que plus de 220 000 manuscrits publiés ont fait usage de cette technique d'ici l'an 2014. Surtout, les dix dernières années ont vu des avancées d'imagerie techniques couplées avec le développement marqueurs fluorescents de sensibles qui ont permis d'améliorer la sensibilité et a donné encore plus de plages de détection linéaire. Le résultat est une fluorescence maintenant vraiment quantifiable fondé Western Blot (QFWB) qui permet aux biologistes d'effectuer une analyse comparative de l'expression avec une plus grande sensibilité et de précision que jamais auparavant. Beaucoup de "optimisé" western blotméthodes existent et sont utilisées dans différents laboratoires. Ceux-ci se révèlent souvent difficiles à mettre en œuvre en raison de l'exigence de modifications procédurales subtiles mais sans papiers. Ce protocole fournit une description complète de la méthode d'QFWB établi et robuste, avec des stratégies de résolution des problèmes.

Introduction

Western Blot (WB) est une technique d'analyse développé à l'origine dans les années 1970 pour déterminer la présence ou l'absence d'une protéine d'intérêt dans un échantillon biologique complexe, comme un homogénat de tissu 1. Communément dénommé immunoblot des protéines, en raison de la clé interaction anticorps-antigène, la méthode consiste en cinq étapes distinctes: 1) la séparation électrophorétique des protéines par leur point isoélectrique; 2) le transfert à une nitrocellulose ou polyfluorure de vinylidène (PVDF); 3) le marquage en utilisant un anticorps primaire spécifique à la protéine d'intérêt; 4) incubation avec un anticorps secondaire dirigé contre l'anticorps primaire; et 5) la visualisation.

méthodologie de visualisation a évolué avec le temps pour améliorer la sécurité et de la sensibilité. Certains des premiers Western Blots ont été réalisées en utilisant la radio balises marquées qui ensuite évolué vers les chemilluminescent plus largement utilisé (ECL) des méthodes colorimétriques et puis. Radioactivity a été marqué directement sur ​​les sondes pour des antigènes spécifiques alors que les méthodes colorimétriques et ECL utilisent une technique de marquage indirect avec un rapporteur enzymatique tel que la peroxydase de phosphatase alcaline ou de la streptavidine de raifort (HRP) 2. L'intensité de l'étiquetage du produit luminescent ou chromogène est mesurée en utilisant la densitométrie par lequel la force du signal, fort ou faible, plus ou moins indique la présence de la protéine d'intérêt dans l'échantillon. ECL est la méthode plus sensible et donc favorisée mais toutes les deux trois méthodes ont été initialement mis au point sur ​​le film à rayons X avec des techniques d'imagerie numérique plus sophistiqué ensuite établies 3. L'avancement de l'imagerie numérique de WB a non seulement permis à un chercheur de déterminer la présence ou l'absence de leur protéine d'intérêt, mais a également permis une déduction au niveau de l'expression d'une protéine choisie lorsqu'on les compare aux autres échantillons et peut donc être considéré comme «semi-quantitative & #8221 ;. Récemment, une technique de transfert de Western véritablement quantitative et plus sensibles ont été mis au point de sorte que le niveau de fluorescence mesurée est directement liée à la quantité et à l'expression d'une protéine unique dans un échantillon: quantitatif fluorescent western blot (QFWB).

Lorsque l'on compare avec l'étiquetage QFWB ECL, l'utilisation d'un anticorps secondaire fluorescent génère un profil de détection linéaire 4. Ceci est en contraste avec les techniques ECL où la linéarité du signal se produit généralement avec des charges faibles en protéines est inférieure à 5 ug et la saturation de signal directement liés à l'expression des protéines, à savoir, avec des gènes domestiques exprimés de manière ubiquitaire 5,6. Cette disparité est très probablement dû à un plus grand nombre de sites de liaison disponibles pour un substrat ECL avidine à se lier à un secondaire biotinylé, ce qui entraîne un risque plus élevé de potentiel de saturation du signal. Ceci est l'une des principales raisons de la base ECL immuno étant désignées comme étant ONLy "semi-quantitative» 7. Le point de signal de saturation est d'une importance critique pour la mesure des différences subtiles dans les niveaux d'expression et peut conduire à des mesures inexactes. Au cours des dernières années, l'avènement des techniques protéomiques répandues détaillant de plus en plus la sensibilité et l'identification des différences d'expression subtiles a entraîné une dépendance croissante sur vraiment quantitative Western blot pour des expériences de validation 8,9. L'application de la méthodologie sensible, dynamique et véritablement quantitative est donc crucial.

Beaucoup de "optimisés" méthodes de transfert de Western ont été utilisés par des laboratoires indépendants, qui se révèlent souvent difficiles à mettre en place ou de reproduire en raison d'ajustements méthodologiques subtils qui peuvent ne pas être dans les protocoles officiels et documentés. Ceci est un protocole établi et robuste pour QFWB et fournit des stratégies utiles pour la résolution des problèmes communs tha plust peut survenir au cours de la mise en œuvre.

Ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec des homogénats de cerveau de souris, mais a depuis été utilisé efficacement dans un large éventail d'échantillons de tissus et les espèces 4,9,10. Variations de protocole de potentiel nécessaires pour résoudre les problèmes spécifiques sont inclus.

Protocole

Ce protocole a été optimisé en utilisant des tampons produits dans le commerce, des gels et des piles de transfert afin de réduire la variabilité et améliorer la cohérence. Reportez-vous à la liste de matériaux pour une liste complète des consommables nécessaires.

Protocole WB fluorescent à l'aide I-Blot transfert rapide et LI-COR système d'imagerie Odyssey

1. Préparation de l'échantillon

  1. Sélection Tampon / préparation
    1. Sélectionnez un tampon d'extraction approprié pour l'homogénéisation et veiller à ce que le tampon est compatible avec toutes les techniques en aval à utiliser. Préparer un tampon d'extraction: un tampon RIPA (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, le désoxycholate de sodium à 1%, SDS 0,1%) contenant l'inhibiteur de protease de 5% cocktail avant l'isolement de l'échantillon.
      NOTE: Il existe de nombreux types de tampons d'extraction et la disposition sont choisis en fonction de la localisation de la protéine d'intérêt dans la cellule. Ceux-ci comprennent, mais ne sont paslimité à un tampon RIPA (cellules entières, des mitochondries et des composants nucléaires), NP-40 tampon de lyse (ou une membrane cellulaire lié ensemble) et Tris-Triton (cytoplasmique lié squelettique). Cependant, certains détergents chimiques à l'intérieur des tampons d'extraction peuvent aider à solubiliser ou même désactiver une protéine mais peuvent interférer avec le dosage des protéines en utilisant un dosage spécifique de la détermination des protéines, à savoir, l'acide Bicinchoninic (BCA). Vérifiez les recommandations du fabricant concernant la compatibilité chimique avec le dosage.
  2. L'extraction des protéines / solubilisation
    1. Macérer manuellement l'échantillon de tissu avec des ciseaux et / ou d'un scalpel, suivie par homogénéisation en utilisant soit un dounce ou un homogénéisateur électrique à main avec une pointe de polypropylène dans le tampon d'extraction préparés à environ 1h10 w v (poids de tissus de volume / tampon) / jusqu'à un homogénat lisse / cohérent est produit.
      NOTE: Pour les plus petits, précieux / difficile d'obtenir des échantillons, détergent à base extractions can encore être efficace jusqu'à 1: 5.
    2. Diffusez homogénéisation, centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Retirer le surnageant contenant les protéines solubilisées et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Conserver culots insolubles pour permettre une extraction plus plus strictes si nécessaire plus tard. Passez à l'étape de détermination de la protéine 1.3.
  3. Détermination des protéines
    1. Déterminer la concentration de protéine dans chaque échantillon extrait en utilisant soit une BCA, Bradford ou un dosage similaire. Lors du calcul de la courbe d'étalonnage, en sorte que le coefficient de détermination de rapport, la valeur de R au carré, est supérieure ou égale à 0,99 qui reflète la détermination plus précise de la protéine dans les échantillons abondance 15.
      REMARQUE: Tous les échantillons comparés par QFWB doit être testée par rapport à la même courbe standard.
  4. Préparation de l'échantillon
    1. Planifier et d'enregistrer l'ordre de chargement des échelles et des échantillons de 2 g identiqueEls: gel 1 pour le transfert et le gel 2 en tant que témoin de charge. Chargez le contrôle et les échantillons «traités» de manière séquentielle pour éviter tout biais qui pourrait survenir avec transfert pauvres ou sans équivoque.
    2. Calculer le volume de protéine requise pour chaque échantillon. Une charge de protéine standard pour détecter les protéines neuronales dans des isolats est de 15 mg. Faire de chaque échantillon à un volume de 10 pi avec dH 2 O. Ajouter 5 ul de tampon de charge, vortex et la chaleur à 98 ° C pendant 2 min.
    3. Inclure un échantillon de contrôle positif comme une protéine recombinante pour aider à l'identification de la bande correcte d'intérêt. Cependant préparer l'échantillon de contrôle positif correctement en suivant les directives du fabricant pour éviter la sélection des mauvaises bandes. Voir Figure 1.

figure-protocol-1
Figure 1. Psélection de commande ositive. L'ajout de contrôles positifs à une expérience confirme l'étiquetage détectée est réel. Cependant, des précautions doivent être prises pour assurer que votre commande fonctionne correctement avant d'utiliser les échantillons expérimentaux. A) La protéine de fusion TREM 2 a été chargé à les directives du fabricant de 1 ug / ml, mais le marquage observé à 110 conflits avec la fiche kDa prédit moléculaire poids de 60 à 70 kDa. B) Après addition et incubation avec l'agent réducteur, le marquage des protéines de fusion a été détecté au poids moléculaire prévu. Toutefois, cela signifie une plus grande charge de protéine est nécessaire que le processus de réduction a diminué le signal de la protéine.

2. Séparation électrophorétique des protéines

  1. Préparation de 4-12% gel Bis / tris (1,0 mm)
    REMARQUE: gels de gradient sont utilisés pour produire une plus grande séparation des protéines à travers une large gamme de poids moléculaire.
    1. Choisir et préparer MESou tampon de migration MOPS (1 L par réservoir) par dilution avec dH 2 O. Tampon MES donne une meilleure résolution des protéines à l'intérieur de 3,5 à 160 kDa alors que tampon de migration MOPS est préférée pour détecter les protéines de poids moléculaire supérieur à 200 kDa ci-dessus aura cependant moins bonne résolution des protéines de bas poids moléculaire inférieure à 15 kDa.
    2. Retirer le peigne et bande de ruban adhésif qui recouvre le pied du gel. Lavez délicatement les puits avec du tampon courante avec une pipette de 1 ml. Remplir les puits avec du tampon en cours d'exécution et assurent l'absence de bulles restent dans le gel.
  2. préparation de gel et de chargement
    1. Insérez les gels dans le réservoir et remplir le compartiment inter-gel avec le tampon en marche pour vérifier tous les joints sont efficaces.
    2. Ajouter 3 pi de standard de poids moléculaire dans le premier puits dans le gel et gel 1 2. Charge 10 pi de chaque échantillon dans les puits suivants.
      NOTE: À l'exception des échelles, gel 1 & 2 gel doivent être identiques. Il est impératif eà la norme de poids moléculaire pré-coloré utilisé pour le gel 2 est bleu et visibles en utilisant une tache de protéines totales afin d'être visible dans le canal de Odyssey 700 imageur.
    3. Une fois les deux gels sont chargés, remplir le réservoir avec le tampon de fonctionnement résiduelle et fermer le couvercle.
  3. Électrophorèse
    1. "Exécuter" le gel à 80 V pendant 4 min à assurer que l'échantillon pénètre dans la matrice de gel de polyacrylamide d'une manière uniforme. Par la suite, augmenter la tension et le temps de 180 V pendant 50 min, respectivement, jusqu'à ce que l'échantillon ou le colorant peut être vu au pied du gel.
      Remarque: Plus tensions peuvent être appliquées à raccourcir les délais d'exécution. Toutefois, cela peut entraîner des gels "smiley" où les échantillons du milieu des gels courir plus vite que les échantillons de voies extérieures causées par une augmentation de la température 14.

3. Total des taches de protéines du gel de commande de chargement

  1. gel de sortie 2 de la cassette à l'aideun couteau de gel. Retirer les puits et le pied du gel. Marquer le gel pour aider orientation.
  2. Décanter environ 30 ml de la tache de protéine dans une boîte de Pétri carré (taille d'environ 12 x 12 cm). Placer le gel 2 sur la tache de protéine, assurant la solution couvre la totalité du gel, puis agiter le gel pendant 1 heure minimum à la température ambiante pour colorer.
  3. Décanter la tache de protéines et laver les 3x de gel dans de l'eau distillée avant visualisation. Passez à l'étape 6.3 de visualiser.

Protein 4. I-Blot semi sec Transfert rapide

Remarque: Tous les réactifs nécessaires pour le transfert de la protéine à l'aide de la machine-Blot I sont des produits du commerce spécialement conçu pour la méthode I-Blot et peuvent être trouvés dans la liste de matériaux.

  1. Préparer le "fond" pile de transfert. Retirer le couvercle de papier d'aluminium et pré-humide avec un tampon directement dans le réservoir de gel en cours d'exécution. Papier filtre pré-mouillé avec de l'eau distillée.
  2. Répétez l'étape 3.1 et lieu gel 1 surle "fond" pile de transfert préparé.
  3. Poser le papier filtre pré-humide sur le gel. Rouler le papier filtre et gel pour garantir l'absence de bulles sont emprisonnées entre les couches.
  4. Retirez le couvercle de la pile de feuille de transfert haut et mettre la pile en haut au-dessus du papier filtre et la pile bas. Rouler la pile de transfert "sandwich" pour éliminer les bulles d'air.
  5. Insérez l'éponge du kit de pile de transfert sur le couvercle de la machine I-Blot. Placez le sandwich de la pile de transfert sur l'espace dédié sur la machine I-Blot puis fermer le couvercle en toute sécurité. Lancer la I-Blot et transférer 8,5 min sur le programme 3.
  6. Si il ya un signal faible en protéines ou inégales élevés: taux de protéines de faible poids moléculaire, de tester les temps de transfert du fabricant lors de l'utilisation d'une méthode semi sec "rapide" de transfert. Exécutez un protocole d'optimisation simple en utilisant des répétitions de charge identique d'échantillons pour déterminer la combinaison idéale transfert tension / temps comme le montre la figure 2 .

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Figure 2. Optimisation de transfert en utilisant le I-Blot. A) Gel seul chargé avec l'échelle et 15 pg de murin entier homogénat de cerveau à trois répétitions en tandem a été coupé en trois parties. Une partie n'a pas été transféré, une a été transférée pour 7,5 min (selon les directives du fabricant) et un pour 8,5 min. Les coupes de gel ont ensuite été colorées avec Instant Bleu protéine tache, numérisé sur un imageur infrarouge dans le canal 680 et quantifiés. B) Représentation graphique des valeurs de quantification qui démontrent la différence de teneur en protéine résiduelle de chaque gel suite à 0, 7,5, et 8,5 min de transfert. Notez qu'une minute supplémentaire de temps de transfert donné lieu à un transfert supplémentaire de la protéine d'environ 45%.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. Anticorps détection de protéines

  1. Préparation de membranes et de blocage
    1. Retirez la pile de transfert de la machine I-Blot. Enlever la couche supérieure du papier filtre et l'exposition du gel sur la pile de transfert de fond.
    2. Couper autour du gel avec un scalpel et veiller à ce qu'une coupe triangulaire à des fins d'orientation est représentée sur la membrane. Après découpage de la membrane, de protéines tache le gel de vérifier l'efficacité de transfert et / ou les jeter.
    3. Déplacer rapidement la membrane dans un tube propre de 50 ml (ou un récipient équivalent) contenant 5 ml de PBS 1x et placer sur un rouleau mécanique (ou plate-forme orbitale) pour agitation constante.
      NOTE: Il est essentiel que la membrane ne soit pas autorisé à se dessécher. Pendant le transfert semi-sec de la membrane devient chaud. Attendez 2 min avant d'ouvrir la pile de transfert car cela permettra it à refroidir et le temps de séchage lent pendant pile déconstruction. Utilisation d'un rouleau et d'un tube d'agitation au cours de lavages et incubations permet de réduire sensiblement le volume de solution requis.
    4. Laver la membrane 3 x 5 min dans du PBS 1X. Jeter le PBS 1x et bloquer la membrane avec un tampon de blocage non dilué pour un minimum de 30 min à température ambiante.
  2. Préparation d'anticorps primaire.
    1. Préparer l'anticorps primaire selon les directives du fabricant de 5 ml de tampon de blocage avec 0,1% de Tween 20. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire préparée durant la nuit à 4 ° C avec agitation constante.
      NOTE: Le tampon de blocage est généralement utilisé non dilué, mais peut être dilué jusqu'à 1: 4 avec du PBS, si l'anticorps primaire a suffisamment de spécificité élevé.
    2. Jeter l'anticorps primaire et laver la membrane 6 fois pendant 5 min chacun avec PBS 1x.
  3. Sélection et préparation d'anticorps secondaire
    1. Pour secoNdary seule évaluation à des fins de contrôle d'étiquetage, omettre les étapes 5.2.1 et 5.2.2 ci-dessus et passez à l'étape 5.3 pour déterminer les profils de bandes secondaires spécifiques à l'échantillon. Voir la Figure 3.

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Figure 3. Optimisation des anticorps secondaires. A) Une comparaison des espèces multiples de seulement marquage non spécifique secondaire contre 15 ug de murin (M), la viande ovine (O) et équins (E) homogénats de tissu nerveux avec une variété de fluorescent marqué Anticorps secondaires . L est l'échelle de poids moléculaire. Broyat de tissu ovine était le seul échantillon de réaction croisée avec l'étiquetage secondaire lors de l'utilisation d'âne anti-chèvre 800 anticorps. B) Il est également important de vérifier si l'étiquetage est non-spécifique se produit lors de l'utilisation d'un échantillon de tissu différent, à savoir, jumeau murin muscle (15 _6, la charge g). Cet échantillon a une réaction croisée avec l'anticorps secondaire d'âne anti-souris 680, mais cela ne se produit pas lors de l'utilisation d'homogénat de cerveau de souris.

  1. Préparer le fluorescent marqué anticorps secondaire 680 ou 800 (rouge ou canal vert) suite fabricant concentrations recommandé dans un tampon de blocage avec 0,1% de Tween 20. Incuber la membrane dans l'obscurité avec l'anticorps secondaire préparé pendant 90 minutes à température ambiante avec agitation constante.
  2. Jeter l'anticorps secondaire et laver la membrane 6 fois pendant 5 min par lavage avec du PBS 1X. Passez à l'étape 6 - visualisation.
    1. Si la visualisation de marqueurs ne fonctionne pas comme prévu, les échelles d'examen avec une gamme d'anticorps secondaires comme une étape supplémentaire approprié. Tous les anticorps secondaires permettent pas la visualisation de toutes les bandes de marquage dans toutes les échelles disponibles dans le commerce.
    2. Si bandes attendues ne sont pas visibles, utilisez un hôte secondaire alternatif, à savoir, donkanti-lapin ey contre chèvre anti lapin représente une modification du protocole approprié. Voir Figure 4. Espèces hôtes utilisées pour élever un anticorps secondaire peuvent parfois causer un problème avec visualisation en raison du manque de spécificité des anticorps primaires spécifiques.

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Figure 4. dépannage anticorps secondaire spécificité de Western blot d'une série d'échantillons de tissus (protéine de 15 pg par piste.) - Graisse, le muscle, le foie et les os - incubées avec l'anticorps primaire ERK et incubées avec des anticorps secondaires trois différentes. Panneau supérieur: WB marqué avec LI-COR chèvre anti-lapin 680 anticorps secondaire produite faible étiquetage des gras et des os et aucun signal n'a été détecté dans les échantillons de foie et les muscles. Panneau central: Membrane (de haut) a été dépouillé et reprobed en utilisant la méthodologie ECL et de chèvre anti-lapin HRP liée secondaire. Bandes sont maintenant visibles dans les échantillons de muscle et de foie et l'étiquetage apparaît plus intense dans les échantillons de graisse et des os. Panneau inférieur: Membrane (à partir de panneau supérieur et moyen) a été dépouillé et sondé à l'aide LI-COR âne anti-lapin 680 anticorps secondaire qui a montré une plus grande affinité pour l'anticorps primaire ERK. Étiquetage pour les muscles et le foie est maintenant visible à une augmentation de l'intensité du signal à partir d'échantillons à la fois de la graisse et des os. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

6. Visualisation

NOTE: Toutes les images sont acquises à l'aide de l'imageur LI-COR Odyssey classique et l'image associée logiciel d'analyse Pro (version 3.1.4).

  1. Tourner et se connecter à l'ordinateur et d'un imageur. Ouvrez le logiciel d'imagerie et de créer un nouveau fichier. Voir la figure 5.


Figure 5. Visualisation et quantification de transfert de western. Numérisation d'un Western blot montrant muscle gastrocnémien murin (30 pg de charge) sondé avec un anticorps primaire annexine V (36 kDa) et de chèvre anti-lapin de 800 d'anticorps secondaire. La membrane a été numérisé et visualisé dans le canal 800. Pour quantifier la protéine (annexine V), une boîte rectangulaire est dessinée autour de la bande d'intérêt à partir de l'échantillon 1. Il est ensuite copié et collé sur les voies d'échantillons restants pour assurer une mesure de la même zone. Arrière-plan est représenté automatiquement autour de la forme dessinée, mais ce peut être modifiée pour assurer la mesure d'arrière-plan est définie avec précision. Le tableau ci-dessous présente les mesures chiffrées de chaque forme dessinée dont le signal total obtenu, fond et le signal de fond soustrait. Cette information peut ensuite être exporté dans untableur pour calculer des ratios d'expression (telle que déterminée par l'intensité relative de fluorescence) et permet des analyses statistiques complémentaires qui seront nécessaires. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
  1. Ouvrez le couvercle de l'imageur. Verser une petite quantité de PBS 1x sur le verre sur le coin inférieur gauche, puis placez la membrane sur le dessus de la PBS. Veiller à la membrane est de forme carrée avec l'axe de l'imageur et un espace de 1 cm est laissé entre la membrane et l'axe de la grille.
    1. Rouler la membrane pour assurer qu'aucun de bulles d'air entre le verre et la membrane.
    2. Comptez le nombre de places de la membrane occupe sur l'axe des x et y. Fermez le couvercle de l'imageur. Entrez le nombre de carrés de la membrane occupe sur le logiciel de l'ordinateur.
    3. Sélectionnez le canal approprié pour analyser la membrane qui dépendra du marqueur fluorescentde l'anticorps secondaire, à savoir 700 ou 800 canaux canal quand un anticorps marqué fluorescent 680 ou 800, respectivement, a été utilisé. Lorsque le double étiquetage est effectué, de numérisation dans les deux canaux.
      REMARQUE: Optimiser seul marquage de protéines avant d'effectuer le double étiquetage.
    4. Sélectionner l'intensité de balayer la membrane, si une protéine en forte abondance utiliser un balayage de faible intensité. Alternativement, si l'anticorps primaire a une mauvaise affinité pour la protéine d'intérêt Sélectionner un balayage d'intensité plus élevée, à savoir, niveau 5. Appuyez sur Start pour commencer la numérisation. Passez à l'étape 6.4.
  2. La visualisation du gel de commande de chargement (Figure 6).
    figure-protocol-5
    Figure 6. étiquetage des protéines totales et de l'analyse. A) Photographie d'une protéine gel totale marquée contenant 20 ug d'équine homogénat de ganglions cervicaux par voie. B) Gel de Groupe Anumérisée dans le canal 680 Graph. C) des mesures quantifiées de la protéine totale gel coloré obtenu en utilisant un logiciel d'imagerie. Une gamme de mesures déterminé par des marqueurs de poids moléculaire, c.-à-30-110 kDa, sont prises pour assurer un histogramme des mesures pour assurer erreur standard (SEM) est faible (des échantillons groupés) indiquant que les taux de protéines totales dans chaque échantillon sont uniformes à travers le gel. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
    1. Suivez les étapes 6.1 et 6.2.
    2. Versez de l'eau distillée sur le verre dans le coin inférieur de l'imageur où l'axe de la grille commence.
    3. Placer le gel sur la surface de l'eau et de manoeuvrer ainsi les voies sont perpendiculaires l'une l'axe x ou y de la grille. Laisser un espace de 1 cm entre l'axe x et y de la grille et le gel et compter le nombre de carrés du gel occupe sur l'axe de grille. Prèsle couvercle de l'imageur.
    4. Entrez le nombre de places le gel occupe sur le logiciel de l'ordinateur.
    5. Sélectionnez le canal 700 pour balayer le gel de protéine colorées totale.
      REMARQUE: bleu fluorescent dans le canal 700.
    6. Réglez l'intensité à 5 et appuyez sur Start.
  3. Quantification de l'image numérisée
    1. Réglez les boutons de luminosité et de contraste pour produire la meilleure qualité d'image. Si il semble y avoir un bruit de fond élevé, relecture de la membrane à une intensité plus faible et utiliser le réglage de la numérisation de haute qualité.
      NOTE: Les ajustements ne modifient pas les données fluorescentes acquises lors de la numérisation.
    2. Faire pivoter les images de 90 °, 180 ° et 270 ° afin de voir dans l'orientation souhaitée sans modification des données acquises. Cependant, lors de petits ajustements de l'orientation en "rotation libre", par plus de 3 °, les données acquises dans les valeurs de pixilation peuvent se déformer et ainsi affecter les résultats de quantification.
    3. Sélectionnez une forme dans le menu de formes - utiliser un rectangle dans la plupart des cas - et d'en tirer autour de la bande d'intérêt (BM) ou le passage en entier (gel de protéines totales) dans l'échantillon voie 1.
    4. Copiez et collez la forme à travers de l'échantillon voie 2 bande d'intérêt ou toute voie. Répéter à travers chaque bande d'intérêt pour chaque échantillon et chaque voie pour le total des gels de protéines.
    5. Vérifiez que la mesure de fond ne comporte pas de signal dans la voie d'à côté. Le fond peut être déduite automatiquement par le logiciel et englobe bord entier autour de la forme dessinée ou il peut être spécifié à être haut / bas ou à gauche et à droite de la forme. Sinon, désigner une boîte de fond définie par l'utilisateur.
    6. Afficher le signal de la table de formes pour chaque forme dessinée en unités de fluorescence arbitraires. Le fond sera automatiquement déduit à partir du signal.
    7. Exporter l'image comme un fichier TIF à voir dans un autre logiciel. Ne pas exporter l'image et manipuler using non l'image pro logiciel que ceci modifie les données originales acquises par l'imageur générer de fausses données.
    8. Répétez les étapes 6.4.3-6.4.7 lors de la quantification double étiquetage ou la mise en oeuvre des mesures multiples sur des gels de contrôle de chargement pour générer et compiler les données d'erreur standard.

7. Publier visualisation

  1. Gardez membranes en 1x PBS ou sécher pour le stockage à long terme pour l'avenir de re-sondage et le décapage de membranes pour d'autres protéines d'intérêt.
  2. Décapage et re-sonder des membranes. Voir la Figure 7.
    figure-protocol-6
    Figure 7. Membrane de décapage et reprobing. Des exemples représentatifs de membranes suivant différentes étapes de décapage numérisées avec un système d'imagerie infrarouge. A. La première immunodétection a été réalisée avec l'anticorps primaire CSP (lapin) et balayé à 700 canal. B. Première décapage et reprobing avec ROCK2 (lapin) avec 800 canaux. Flèche orange indique restant CSP anticorps primaire présente après la bande et re-sonde. Cela ne porte pas atteinte à la mesure de ROCK2 que le groupe est présent à un plus haut poids moléculaire (flèche blanche). C. Deuxième décapage et sondé avec β-spectrine anticorps (chèvre) et visualisées dans le canal 800. D. Troisième décapage et reprobing avec l'anticorps α-synucléine (lapin). E. Quatrième décapage et reprobing ubiquitine avec l'anticorps (de la souris) avec 800 canaux. Il est toujours en restant signal de la dernière anticorps (α-synucléine. Flèche orange). F. Cinquième décapage et reprobing CALB2 avec un anticorps (de lapin) imagé dans le canal 700. Les anticorps secondaires utilisés étaient: chèvre 800CW anti-souris, chèvre anti-lapin 680rd, chèvre anti-lapin 800CW, âne anti-chèvre 800CW (voir la liste des matériaux). étiquettes de Lane: L - échelle, 1/260; - échantillon au 1/2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
    1. Placer la membrane (s) dans un plat carré de Petri contenant environ 30 ml de tampon de décapage Revitablot et sont incubés entre 5-20 min à température ambiante sous agitation constante.
    2. Laver la membrane (s) 3 fois dans du PBS puis rescanner sur l'imageur à assurer l'élimination complète de la fluorescence a eu lieu - cette étape doit être répétée après chaque bande.
    3. Incuber membrane (s) pour des périodes plus longues si fluorescence reste. Relecture de la membrane après chaque bande pour confirmer qu'il n'y a pas de signal secondaire restant.
      REMARQUE: Membrane (s) ne doit être retiré et sondé un maximum de 3 fois afin de garantir que l'intégrité de la membrane n'a pas été compromise résultant dans un bruit de fond indésirable à signaler rapport.

Résultats

Comme la sensibilité à QFWB et la plage linéaire de détection est supérieure à la détection ECL classique, il ya un certain nombre de mesures de contrôle qui sont essentiels pour assurer l'exactitude des données sont collectées, facilitant ainsi l'interprétation efficace. Tout d'abord, l'inclusion des échantillons témoins positifs comme représenté sur la figure 1. D'autre part, l'optimisation du transfert de garantir un mouvement équivalent de protéines de haut et de bas poids moléculaire à partir du gel à la membrane comme présenté dans la figure 2. En troisième lieu, l'optimisation d'anticorps, en particulier secondaire des anticorps dont l'optimisation est souvent négligé, mais qui peuvent produire non spécifique bandes capables d'interférer avec l'interprétation correcte de la protéine (s) d'intérêt. Voir Figure 3. Quatrièmement, il peut aussi être le cas que quand une protéine apparaît indétectable mais devrait être présente, cela peut aussi être une question d'anticorps secondaire qui peut être corrigé en utilisant simplement un raïs secondairesed dans un hôte de différentes espèces. Voir figure 4. Cinquièmement, l'étiquetage de la protéine totale et l'analyse est une méthode beaucoup plus robuste et quantifiable par rapport à l'utilisation unique de protéine traditionnel (s) qui sont exprimés de façon ubiquitaire à des étalons de référence internes 3. Beaucoup de ces protéines simples ont été trouvés à être exprimés de manière différentielle dans des modèles de maladies neurodégénératives, ainsi qu'entre les échantillons de tissus différents et l'uniformité d'expression peut modifier dans le même tissu 3. Par conséquent, la production d'un gel de commande de charge confirme l'uniformité de la charge de l'échantillon lorsqu'il est combiné avec une analyse des protéines totales par la comparaison et la quantification de la charge de protéine dans chaque ligne à différentes gammes de poids moléculaires mesurés par rapport à chaque échantillon pour indiquer l'erreur standard comme le montre la figure 6 . Fait important, l'ensemble de ces techniques et des contrôles de dépannage ne sont efficaces que la sensibilité et la cohérence de l'analyse tutils appliquées par l'opérateur (figure 5). Enfin cette technique se prête bien à l'arrachement et re-sondage de membranes avec plus de souplesse que ECL en raison de facteurs y compris, mais sans s'y limiter, une sensibilité accrue, de fond réduit, la détection de double couleur et la stabilité de la membrane dans des conditions de stockage à long terme. Voir la Figure 7.

Discussion

Une attention particulière et de la planification est essentielle avant toute expérience et peuvent en fin de compte déterminer le succès de la technique utilisée. Les progrès dans la détection de la protéine à l'aide de la Banque mondiale peut présenter une pléthore d'obstacles potentiels en essayant de choisir les anticorps, de transfert et de visualisation des méthodes appropriées à utiliser. Heureusement, en utilisant une liste de contrôle attentif et des mesures de contrôle appropriées QFWB peut être utilisée en routine pour déterminer la présence de la protéine et des différences d'expression de plus en plus subtiles entre les échantillons. Ce protocole fournit un guide complet fluorescent western blot quantitatif ainsi que quelques stratégies de dépannage pour éviter et / ou de surmonter quelques-uns des nombreux écueils les plus courants associés.

Les étapes essentielles utilisées pour maintenir la sensibilité et obtenir vraiment des mesures quantifiables et comparables comprennent: 1) l'extraction des protéines robuste à partir d'échantillons de tissus; 2) la préparation des échantillons; 3) précise loadin de protéinesg déterminée par l'analyse des protéines totales; 4) un transfert optimal de protéines en utilisant I-Blot; 5) la préparation d'anticorps primaires et secondaires dans le tampon de blocage contenant 0,1% de Tween 20, et 6) visualisation correcte et analyse à l'aide d'un imageur infrarouge et les logiciels associés.

Détection fluorescente infrarouge est vraiment quantitative et offre une plus grande sensibilité par rapport à d'autres techniques de détection ECL traditionnelles 3,11. Ce système de détection est à plusieurs facettes, et en tant que tel ne se limite pas à QFWB. Ce système est capable de formation d'image de marquage immunohistochimique à faible puissance permettant la visualisation et la quantification des coupes de tissus entiers 12. Ceci est une zone de développement potentiel futur en termes de résolution qui pourrait voir l'imagerie rouge lointain rivalisant avec capture d'immunofluorescence conventionnelle avec des microscopes conventionnels en termes d'évaluation quantitative.

Cependant, avec une plus grande sensibilité à des changements subtils dans protein expression, il est essentiel de veiller à la variabilité est réduite au minimum et les mesures de contrôle sont strictes avec des protocoles robustes. Cela commence avec l'extraction des protéines rigoureuse de l'échantillon de tissu suivie par la production de protéines colorées au total gels à fournir l'assurance que le chargement des échantillons est uniforme, optimisation des anticorps primaires et secondaires afin de déterminer si la détection est réel et tester les directives du fabricant en ce qui concerne le transfert fois pour obtenir le transfert de la protéine efficace.

Néanmoins, même lorsque les conditions de la Banque mondiale sont optimisés, il peut y avoir encore des problèmes associés à la gestion des westerns qui peuvent ne pas avoir été pleinement explorées ici. Ceux-ci comprennent, sans s'y limiter, les facteurs, y compris la solubilisation de la protéine et le choix de tampon d'extraction. Des tampons peuvent interférer avec des dosages de la concentration de protéine, et certains tissus sont particulièrement difficiles à solubiliser, ce qui nécessite des techniques plus robustes telles que l'utilisation de macération automatiséTing emballage étanche, tel que M TUBES ensemble avec un dissociateur Mac. En outre, des mesures de contrôle simples pour le stockage de la matière extraite et non extraite à -80 ° C peuvent faire la différence entre l'obtention d'étiquetage optimale immédiatement après l'extraction et ayant pauvres résultats semaines plus tard.

Méthodes de QFWB modernes se sont révélés être plus sensible pour capturer des différences subtiles dans l'expression des protéines et permettent aux plus polyvalent simultanée double étiquetage 3 par rapport aux techniques plus anciennes comme ECL. Il est essentiel que les protocoles de transfert de Western sont robustes et facilement reproductible pour la quantification précise et l'analyse statistique. Ce protocole est sensible et suffisamment robuste pour être utilisée en routine pour la détection de protéines à travers une série d'échantillons de tissus et d'espèces différentes et 3 permet la quantification des protéines de faible abondance et élevés à l'intérieur de la même QFWB réduisant par conséquent l'utilisation des consommables ainsi que le temps pour l'expérience 1. 1 En outre, la sensibilité accrue de cette technique permet la validation de plus en plus populaire - études omiques 9,14 Cependant, l'exactitude est cruciale et l'inclusion de mesures de contrôle appropriées doivent être respectées évitant ainsi l'acquisition de données erronées.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier pour le soutien financier qui suit: BBSRC Institut stratégique de financement des programmes - CF & TMW; Financement BBSRC Est Bio DTP - LG; Le Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Nous tenons également à remercier le Dr Barry McColl pour permission d'inclure l'optimisation TREM2 dans ce manuscrit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon RIPAFisher Scientific UK Ltd10230544
M TubesMiltenyi Biotec Inc.130-093-236
Pile de transfert iBlot, PVDF RegularLife Technologies, Royaume-UniIB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)Life Technologies, UKLC5602Utilisation dans le gel 1 pour le Western blot
SeeBlue Norme de protéines pré-coloréesLife Technologies, UKLC5625  ;Utilisation dans le gel 2 Gel coloré aux protéines totales
Tampon d’échantillonnage NuPAge LDS 4xLife Technologies, Royaume-UniNP0007
Tampon de fonctionnement NuPAGE MES SDS (pour gels Bis-Tris uniquement) (20x)Life Technologies, Royaume-UniNP0002
NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris Gel 1,0 mm, 12 puitsLife Technologies, Royaume-UniNP0322BOX
Comprimé salin tamponné au phosphateSigma-Aldrich,Royaume-Uni P4417-100TAB
Micro BCA, Kit de dosage des protéinesFisher Scientific UK Ltd10249133
tampon bloquant OdysseyLi-Cor BiosciencesP/N 927-40000
IRDye 680RD IgG anti-lapin de chèvre (H+L), 0,5 mgLi-Cor Biosciences926-68071
IRDye 680RD IgG anti-souris d’âne (H+L), 0,5 mg ;Li-Cor Biosciences926-68072
IRDye 800CW IgG anti-Lapin Chèvre (H + L), 0,5 mgLi-Cor Biosciences926-32211
IRDye 800CW Âne IgG anti-Chèvre (H + L), 0,5 mgLi-Cor Biosciences926-32214
ODYSSEY CL Imageur infrarougeLi-Cor BiosciencesAppel à devis
iBlot 7-Minute Blot SystemLife technologies, Royaume-UniCe modèle n’est plus en production
InstantBlue Proteinstain Expedeon, UKISB1L
Revitablot western blot stripping buffer  ;Rockland Immunochemicals Inc.MB-085-0050

Références

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Mots-clés

Western blot fluorescentd tection de prot inesquantification des prot inescoloration des prot ines totalestransfert semi secanticorps secondaire fluorescentimagerie infrarougeblocage de la membranedilution d anticorps

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