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Article de méthode
Murin iléocoliques résection du côlon avec anastomose primaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les résections intestinales sont fréquemment nécessaires pour le traitement de maladies impliquant le tractus gastro-intestinal, la maladie de Crohn et le cancer du côlon étant deux exemples courants. Malgré la fréquence de ces procédures, il reste une lacune importante dans les connaissances sur la description des effets inhérents de la résection intestinale sur la physiologie de l’hôte et la physiopathologie de la maladie. Cet article fournit des instructions détaillées pour une résection iléocolique avec anastomose primaire de bout en bout chez la souris, ainsi que des aspects essentiels des soins périopératoires pour maximiser le succès postopératoire. Lorsqu’elle est suivie de près, cette procédure permet d’obtenir un taux de survie à long terme de 95 %, aucun retard de croissance et de minimiser les complications postopératoires de l’occlusion intestinale et de la fuite anastomotique. Les défis techniques liés à la réalisation de la procédure chez la souris constituent un obstacle à son utilisation généralisée dans la recherche. Les compétences décrites dans cet article peuvent être acquises sans expérience chirurgicale préalable. Une fois maîtrisée, la procédure de résection iléo-colique murine fournira un outil reproductible pour étudier les effets de la résection intestinale dans des modèles de maladie humaine.
Introduction
La résection iléo-colique (RCI) est une procédure courante pratiquée dans des situations d’urgence et électives pour diverses maladies. La maladie de Crohn et les cancers du côlon sont les deux indications les plus courantes de l’ICR. Dans les deux maladies, la récidive dans l’intestin au site de la chirurgie représente un problème clinique majeur. Les taux de récidive locale du cancer du côlon restent un problème, même avec les résections les plus agressives1. Après la RCI dans la maladie de Crohn, la maladie récidive le plus fréquemment (jusqu’à 80 %) dans l’iléon néo-terminal 1 an après l’intervention chirurgicale2. Compte tenu de l’impact de ces deux maladies et de leur récurrence après la chirurgie, il est important de comprendre les facteurs intestinaux locaux après ICR, qui peuvent avoir des influences intrinsèques sur l’histoire naturelle de ces maladies. De plus, il est également important d’envisager une cicatrisation anastomotique après l’ICR. Au début de la période postopératoire, les fuites anastomotiques peuvent avoir des conséquences dévastatrices pour les patients, entraînant des interventions chirurgicales répétées, des créations de stomie, une morbidité importante et même une mortalité3. Malgré l’importance de ce sujet, notre compréhension actuelle de la guérison anastomotique n’en est qu’à ses balbutiements en tant que sujet de recherche. Les modèles animaux d’ICR, en particulier les souris, constituent une excellente plate-forme pour étudier la cicatrisation intestinale et anastomotique après une intervention chirurgicale.
Un modèle murin d’ICR a été initialement développé par Helmrath et al. pour être utilisé comme modèle du syndrome de l’intestin court4. Les auteurs ont expérimenté divers régimes alimentaires et tailles de sutures pour optimiser la survie des animaux après l’ICR. Ils ont conclu que l’alimentation avec un régime liquide pendant la période périopératoire et l’utilisation de sutures monofilaments 9-0 entraînaient une survie postopératoire optimale de 88 %. Depuis cette publication initiale, l’ICR chez la souris en enlevant 50 % de l’intestin grêle a été utilisé dans plusieurs études pour explorer la dynamique de la résection massive de l’intestin grêle et la réponse de croissance adaptative dans le but de développer de nouvelles thérapies pour le syndrome de l’intestin court5,6.
La première application du modèle murin ICR à la maladie de Crohn a utilisé le modèle murin IL-10-/-, qui développe spontanément une colite7. Les auteurs ont constaté qu’après l’ICR, ces animaux développaient une inflammation de l’iléon néo-terminal similaire à celle observée chez les patients postopératoires atteints de la maladie de Crohn, et que cette inflammation dépendait de la présence de bactéries7. Plus récemment, ce modèle a été utilisé pour explorer les changements bactériens induits par l’ICR. Dans la maladie de Crohn, il y a une dysbiose associée avec des diminutions relatives des bactéries connues pour avoir des propriétés anti-inflammatoires et des augmentations des espèces envahissantes de bactéries8,9. L’association est vraie en cas de récidive postopératoire10. Deux études ont cherché à identifier les changements microbiens résultant de l’ICR. Le premier a utilisé des souris nulles IL-10 et a effectué une électrophorèse sur gel dénaturant pour comparer la similitude bactérienne entre l’intestin grêle et le côlon après ICR11. Cette étude a démontré que les populations bactériennes devenaient similaires dans l’intestin grêle et le côlon après l’ICR. Une étude ultérieure a utilisé des souris de type sauvage et le pyroséquençage 16s pour la classification phylogénétique des espèces bactériennes après l’opération. Cette étude a mis en évidence un changement marqué dans les espèces bactériennes résultant de la seule intervention chirurgicale, les espèces de Clostridium devenant dominantes, ainsi qu’une augmentation des Υ-protéobactéries. Les résultats ont également confirmé les résultats de l’étude précédente avec des populations similaires trouvées dans l’intestin grêle et le côlon après ICR12.
ICR est une procédure courante pour les patients atteints d’un cancer du côlon impliquant le cæcum et le côlon ascendant, et il est de plus en plus reconnu que la réponse de l’hôte à la chirurgie contribue probablement à la récidive tumorale locale et distante13. Malgré cette observation, les modèles d’ICR n’ont pas été utilisés pour l’étude du cancer colorectal et de la récidive postopératoire. Il sera important de comprendre les changements immunologiques systémiques et locaux résultant de l’ICR dans l’étude des thérapies futures. Les voies potentielles impliquées dans la récidive du cancer après l’ICR comprennent la régulation à la hausse des facteurs de croissance, qui peuvent sauver les cellules de l’apoptose et stimuler la prolifération, la perturbation mécanique de la tumeur avec l’excrétion cellulaire et la perte de surveillance immunitaire par l’immunosuppressionpostopératoire13,14.
Les modèles murins de l’ICR ont le potentiel d’être un outil puissant pour l’étude du syndrome de l’intestin court, de la maladie de Crohn et du cancer du côlon. Ils peuvent également fournir des leçons sur la façon de prévenir les complications anastomotiques postopératoires précoces en définissant davantage les voies cellulaires et biochimiques impliquées dans la guérison de l’anastomose nouvellement construite. Un obstacle majeur à l’utilisation du modèle ICR murin est la difficulté technique. L’anastomose intestinale nécessite l’utilisation de 8-0 ou une suture 9-0, un microscope opératoire et une formation aux techniques microchirurgicales. L’objectif de cet article est de fournir des instructions claires sur la façon d’effectuer l’ICR chez la souris dans le but d’utiliser cette procédure dans des modèles de maladie.
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Protocole
les protocoles d'utilisation des animaux ont été approuvés par le comité de soins et d'utilisation des animaux sciences de la santé à l'Université de l'Alberta.
1. Préparation des instruments, les animaux et configuration opérationnelle
- Transférer les animaux à une nouvelle, propre absent de la cage de tout solide nourriture 24 heures avant l'intervention. Ils peuvent avoir accès gratuitement à l'eau, et le liquide alimentation ad lib jusqu'à ce que le temps de la procédure.
- Autoclave tous les instruments nécessaires à la procédure. Surface de travail propre et anesthésique cône de nez avec 70% d'éthanol.
- Mettre en place la surface d'exploitation avec microscope opératoire, appareil d'anesthésie et des produits d'une manière qui est confortable pour le chirurgien. Les coudes du chirurgien devraient être autorisés à se reposer confortablement sur la table d'opération, avec les mains et les bras dégagée par les équipements. Instruments, des sutures, des cotons-tiges, et une seringue de 10 ml doivent être placés dans une position qui permet un accès facile au cours de la procédure.
- Installerlampes chauffantes puissent fournir à la fois la chaleur de l'animal durant la procédure et de la lumière pour la surface d'exploitation.
- Remplir un tube conique de 50 ml avec une solution saline à 0,9%, et un tube de 1,5 ml avec de la vaseline et le lieu près de la surface de fonctionnement.
REMARQUE: Stériliser tous les instruments et de fournitures chirurgicales. Parce que l'intestin est sectionné, la procédure elle-même ne sont pas stériles. Il est considéré comme propre-contaminée. Prendre des mesures pour éviter l'introduction de sources exogènes de l'infection.
2. iléocoliques résection avec anastomose
- Induire une anesthésie par administration de 4% d'isoflurane avec un débit d'oxygène de 2 L / min par l'intermédiaire de la coiffe jusqu'à ce que le vaporisateur isoflurane fréquence respiratoire des animaux ralentit à environ 30 à 40 respirations / min. Appliquer une pression modérée sur le pied arrière de la souris pour assurer qu'il n'y a pas de réponse à la douleur avant de lancer la procédure. À ce stade, baissez isoflurane à 2% et le flux d'oxygène à 0,5 L / min. Intermittentevérifier la réponse de la douleur au cours de la procédure et régler le débit de l'isoflurane en conséquence.
- Appliquez de la vaseline pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie, et immobiliser la souris dans la position couchée sur le dos avec les membres sécurisées à l'aide du ruban adhésif transparent.
- Nettoyez l'abdomen avec une solution povodine / d'iode, et se transformer en nouveaux gants stériles.
- Faire un 1,5 cm incision de la peau sur la ligne médiane supérieure de l'abdomen à l'aide de ciseaux pointu dissection pour exposer le fascia et du péritoine. Ouvrez la couche aponévrotique / péritonéale de la même façon à travers la ligne blanche pour exposer le contenu du péritoine.
- En revanche chez l'homme, le caecum de souris se trouve généralement dans le quadrant supérieur gauche de l'abdomen. Une fois identifié, saisir doucement le caecum avec une pince et de le livrer à travers l'incision. Utilisez des cotons-tiges humectés de ventilateur sur environ 3 cm de l'iléon terminal extension du caecum sur une gaze stérile drapée sur la surface abdominale (figure 1A).Assurez-vous de l'intestin exposé est maintenu humide avec 0,9% de solution saline pendant toute la durée de la procédure.
- Identifier l'artère iléo-caecale bifurcation de l'artère mésentérique supérieure le long du côlon (Figure 1A) à l'aide du microscope opératoire. Disséquer les tissus adjacents avasculaire de l'artère iléo-colique, encercler et ligaturer l'artère avec une cravate de soie 5-0. Ensuite, localisez l'approvisionnement en sang régional de l'iléon terminal et choisir un point de sectionnement 1,5-2 cm en amont de la jonction iléo-colique. Ligaturer les branches de cette section de l'iléon comme ci-dessus. Diviser les artères avec micro dissection ciseaux.
- Diviser les parties ischémiques de l'iléon et du colon assurer qu'il ya un apport sanguin adéquat aux extrémités sectionnées (figure 1B). Il est souvent utile à la spatule en divisant l'iléon à un angle de 30 degrés pour augmenter le diamètre de la lumière de sorte qu'elle corresponde plus étroitement le côlon. Une fois la partie iléo-colique intestinale a été supprimé, aligner leextrémités sectionnées de l'iléon et du colon sur la toile, assurant les frontières de chaque mésentériques sont alignés.
- Construire l'anastomose en rapprochant l'extrémité sectionnée de l'iléon à l'extrémité sectionnée du côlon à l'aide interrompu 8-0 sutures en polypropylene (figure 1c). Le premier point est placé à la frontière mésentérique, avec des sutures ultérieures placés tous les 0,5 mm jusqu'à l'anastomose iléo-colique est étanche. Lors du passage de l'aiguille de suture à travers l'iléon et du côlon, de sorte que l'arête de coupe ne sont pas aplatis, et les piqûres d'aiguille sont de 0,5 mm à partir des bords de l'intestin de coupe. Une anastomose typique, il faudra 14 à 16 sutures interrompues. Testez l'intégrité et la perméabilité de l'anastomose à la fin en faisant rouler une proximale coton-tige à distal sur l'iléon de forcer contenu à travers l'anastomose. Contenu de l'intestin grêle devraient passer librement dans le côlon sans fuite anastomotique.
- Rincer l'intestin exposé avec 3-4 ml d'une solution saline à 0,9% à partir de la seringue de 10 mlpour laver les selles de la surface de l'intestin, et fournir l'intestin dans la cavité péritonéale. En utilisant 2 ml de solution saline 0,9% rincer la cavité péritonéale, et puis les égoutter ce fluide en appliquant une légère pression à la paroi abdominale latérale.
- Fermer l'incision avec une suture 3-0 fonctionnement de la soie, et interrompre le flux de l'isoflurane. Administrer 0,1 mg / kg de l'opiacé à action prolongée -buprenorphine- voie sous-cutanée pour le contrôle de la douleur post-opératoire.
- Observer les animaux sous la lampe de chaleur jusqu'à ce qu'ils soient mobiles puis de les transférer dans une cage sans cesse réchauffé.
3. Soins post-opératoires et de surveillance
- De surveiller les animaux dans une cage sans cesse réchauffé les signes de détresse pour le reste de la journée. Transférer les animaux vers le centre de protection des animaux dans une nouvelle cage stérile avec accès à l'alimentation liquide et de l'eau ad lib. Les animaux peuvent être hébergés en groupes de 3-4.
- Effectuer un contrôle sur les animaux post-opératoires, le lendemain matin,assurer que les animaux ne semblent pas en détresse. Nourrir seul régime liquide. Si elles apparaissent mal à l'aise (ie, une posture voûtée ou activité minimale) administrer une dose supplémentaire de buprénorphine sous-cutanée. Arrivée sur les animaux une fois de plus dans l'après-midi le jour post-opératoire 1.
- Le matin du jour post-opératoire 2, les animaux doivent apparaître complètement récupéré. Preuve de la consommation alimentaire et des selles sont des signes positifs de reprise. Maintenant, reprendre une alimentation chow solide pour les animaux.
REMARQUE: Les signes de détresse comprennent une posture voûtée, toilettage pauvres, et une activité minimale. Si des signes de détresse sont au premier plan les animaux doivent être euthanasiés. - Euthanasier les animaux en induisant anesthésie profonde avec 4% d'isoflurane à un débit O 2 de 2 L / min jusqu'à ce que les animaux ne réagissent pas à la pression du pied. Effectuer dislocation cervicale, et d'observer les signes de l'euthanasie approprié.
- Lignes directrices varient, se réfèrent à des institutions recommandations concernant les indicationspour et des méthodes appropriées d'euthanasie chez les souris.
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Résultats
Les taux de mortalité et le changement de poids post-op.
Les taux de mortalité suivants IC chez les souris de type sauvage 129S1 sont généralement ~ 5%. La cause la plus fréquente de la morale est une occlusion intestinale à l'anastomose. Les autres causes de mortalité incluent fuite anastomotique et hernie interne entraînant une occlusion intestinale.
La perte de poids peut être vu jusqu'à 14 jours après l'opération, mais est généralement non significative. Les souris ont tend...
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Discussion
La souris ICR est un modèle puissant qui peut être utilisé pour étudier les effets de la chirurgie dans les maladies de l'intestin. Cet article décrit un procédé de réalisation IC chez la souris avec un taux de réussite de 95% et pas de problèmes avec un retard de croissance, comme en témoigne poids stables jusqu'à 28 jours après l'intervention. Les défis les plus importants de la réussite ICR notamment d'éviter obstructions intestinales à l'anastomose et les fuites anastomotiques.
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à révéler
Remerciements
Nous tenons à souligner les contributions financières du Fonds canadien de recherche chirurgicale, du Fonds d’aide à la recherche des employés municipaux d’Edmonton et du Consortium sur les MII de l’Alberta par le biais d’une subvention d’Alberta Innovates.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| LD101 régime alimentaire liquide pour rongeurs | testdiet.com | ||
| 0,9 % NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection de qualité saline |
| Microscope opératoire | Ziess | ||
| Isoflurane Vaporisateur anesthésique | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott ; | 05260-05 | |
| Plaque | Pour surface de travail | ||
| Cotons-tiges | |||
| , incurvé | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo Ciseaux droits | World Precision Instruments | 555530S | |
| Ciseaux de dissection | World Precision Instruments | 15922 | |
| Pince à pansement x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 sutures prédécoupées en soie | Ethicon | A182H | Pour la ligature des vaisseaux |
| 8-0 Prolene sur aiguille BV130-5 | Ethicon | 8732H | Pour l’anastomose |
| 3-0 Soie sur aiguilles FS-2 | Ethicon | 8665G | Pour la fermeture de la paroi abdominale |
| Vaseline | Vaseline | ||
| Seringue de 10 ml | BD biosciences | ||
| Povidone iodée 7,5 % chirurgical Scrub | betadine.com | ||
| Lampes chauffantes | |||
| buprénorphine 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. ; | PL36699/0006 |
Références
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Réimpressions et autorisations
