Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Résumé

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques. Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Résumé

Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSCs) sont considérées comme la référence pour les applications d’ingénierie tissulaire à base de cellules souches. Cependant, le processus par lequel ils doivent être récoltés peut être associé à une morbidité importante du site donneur. En revanche, les cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) sont plus facilement abondantes et plus facilement récoltées, ce qui en fait une alternative attrayante aux BM-MSC. À l’instar des BM-MSC, les ASC peuvent se différencier en cellules de lignée ostéogénique et peuvent être utilisées dans des applications d’ingénierie tissulaire, telles que l’ensemencement sur des échafaudages pour une utilisation dans les défauts squelettiques craniofaciaux. Les ASC sont obtenues à partir de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux digéré, qui est un mélange hétérogène d’ASC, de cellules endothéliales et murales vasculaires, de cellules musculaires lisses, de péricytes, de fibroblastes et de cellules circulantes. L’analyse cytométrique en flux a montré que le profil des marqueurs de surface pour les ASC est similaire à celui des BM-MSC. Malgré plusieurs rapports publiés établissant des marqueurs pour le phénotype de l’ASC, il n’y a toujours pas de consensus sur les profils identifiant les cellules ostéoprogénitrices dans cette population hétérogène. Ce protocole décrit comment isoler et utiliser une sous-population d’ASC ayant une capacité ostéogénique accrue pour réparer les défauts calvaires de taille critique.

Introduction

La nature hétérogène des populations de cellules souches n’est pas encore entièrement comprise et reste un obstacle majeur au développement d’applications thérapeutiques à base de cellules souches cliniquement efficaces. L’une des façons les plus courantes de caractériser une population hétérogène de cellules souches consiste à utiliser une méthode de tri cellulaire, telle que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), pour séparer les cellules en fonction de leurs profils d’expression de marqueurs de surface. À mesure que les méthodes de tri deviennent plus complexes, il devient possible d’identifier des sous-populations fonctionnelles plus distinctes de cellu....

Protocole

REMARQUE: Tous les échantillons de patients ont été obtenus avec le consentement éclairé, et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Conseil d'examen Stanford University institutionnel (Protocole N ° 2188 et # 9999).

1. Isolement et culture cellulaire:

1. Obtenir le tissu adipeux sous-cutané humain provenant de patients sains de sexe féminin subissant lipoaspiration élective de l'abdomen, du flanc, et / région ou de la cuisse sous anesthésie locale / générale. Assurez-vous que l'Institutional Review Board (IRB) l'approbation a été obtenue pour le protocole d'isoler ASC de tissus humain....

Résultats

Utilisation de CD90 en tant que marqueur pour des cellules avec des résultats améliorés d'ostéogenèse en isolement d'une population hautement enrichi de CSA humains (Figure 1A, 1B). CSA ont été colorées avec Pacific Blue-CD45 anti-humain conjugué, conjugué à FITC anti-CD105 humain, et APC conjugué anti-CD90 humain. Après le tri, le niveau de pureté était supérieure à 98%, telle que quantifiée par une analyse post-tri.

Définir les groupes de cellules en fonction des profils d.......

Discussion

Actuellement, l'isolement des sous-populations homogènes de CSA de la SVF de tissu adipeux humain reste un défi si objectif souhaitable. L'isolement de sous-populations de l'ASC pro-ostéogéniques est particulièrement souhaitable, car ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la formation et l'homéostasie des tissus squelettiques. Toutefois, le SVF du tissu adipeux abrite hétérogénéité significative en ce qui concerne d'endiguer la capacité des cellules et le potentiel de différenciation. ^.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes coniques jetables de 250 ml	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, glycémie élevée, supplément GlutaMAX	Gibco	10566-016
PBS, pH 7,4	Gibco	10010-023
Bétadine - Solution antiseptique de povidone/iode	Purdue  ;	PFC-67618015017
saline équilibrée de Hank, 1X	Cellgro	21-023-CV
Sérum de veau fœtal, certifié, origine américaine	Gibco	16000-044
Collagénase de  ; Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Solution de détachement de cellules	souches Stem Cell Technologies	7920
APC Souris anti-humaine CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Souris anti-humaine CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (remplacement du bleu pacifique)  ;	eBioscience	48-9459-41
CD34 anti-humain APC	eBioscience	17-0349-41
CD31 anti-humain (PECAM-1)	PE eBioscience	12-0319-41
Streptavidine PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences

Solution