Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Résumé

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques. Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Résumé

Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSCs) sont considérées comme la référence pour les applications d’ingénierie tissulaire à base de cellules souches. Cependant, le processus par lequel ils doivent être récoltés peut être associé à une morbidité importante du site donneur. En revanche, les cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) sont plus facilement abondantes et plus facilement récoltées, ce qui en fait une alternative attrayante aux BM-MSC. À l’instar des BM-MSC, les ASC peuvent se différencier en cellules de lignée ostéogénique et peuvent être utilisées dans des applications d’ingénierie tissulaire, telles que l’ensemencement sur des échafaudages pour une utilisation dans les défauts squelettiques craniofaciaux. Les ASC sont obtenues à partir de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux digéré, qui est un mélange hétérogène d’ASC, de cellules endothéliales et murales vasculaires, de cellules musculaires lisses, de péricytes, de fibroblastes et de cellules circulantes. L’analyse cytométrique en flux a montré que le profil des marqueurs de surface pour les ASC est similaire à celui des BM-MSC. Malgré plusieurs rapports publiés établissant des marqueurs pour le phénotype de l’ASC, il n’y a toujours pas de consensus sur les profils identifiant les cellules ostéoprogénitrices dans cette population hétérogène. Ce protocole décrit comment isoler et utiliser une sous-population d’ASC ayant une capacité ostéogénique accrue pour réparer les défauts calvaires de taille critique.

Introduction

La nature hétérogène des populations de cellules souches n’est pas encore entièrement comprise et reste un obstacle majeur au développement d’applications thérapeutiques à base de cellules souches cliniquement efficaces. L’une des façons les plus courantes de caractériser une population hétérogène de cellules souches consiste à utiliser une méthode de tri cellulaire, telle que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), pour séparer les cellules en fonction de leurs profils d’expression de marqueurs de surface. À mesure que les méthodes de tri deviennent plus complexes, il devient possible d’identifier des sous-populations fonctionnelles plus distinctes de cellules. Les technologies basées sur la microfluidique sont de plus en plus fréquemment utilisées dans l’analyse de l’expression des gènes au niveau de la cellule unique. La réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR) multiplexée au sein d’une puce microfluidique permet une analyse transcriptionnelle efficace et fiable à haute résolution sur cellule unique. ^{1 à 5}

Dans une étude précédente utilisant le profilage transcriptionnel de 48 gènes, une hétérogénéité transcriptionnelle considérable a été observée entre les ASC. ⁶ Cependant, la distribution des gènes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 a montré une forte association avec un groupe de cellules possédant des profils transcriptionnels hautement ostéogéniques. Pour isoler les cellules selon ce profil d’expression génique ostéogénique, les modèles d’expression de l’antigène de surface ont été corrélés avec les modèles de transcription et l’expression du marqueur de surface de l’endogline (CD105) s’est avérée étroitement corrélée avec le potentiel de différenciation ostéogénique amélioré des ASC. Indépendamment de l’expression de CD105, l’expression du récepteur de surface Thy-1 (CD90), une protéine membranaire liée au glycosyl-phosphatidylinositol précédemment montrée par Chen et al. comme étant associée aux cellules ostéoprogénitrices, était également corrélée avec l’expression génique ostéogénique. ^6,7 Ces résultats offrent l’occasion d’isoler prospectivement des sous-populations au sein d’un pool hétérogène plus large d’ASC avec une capacité ostéogénique accrue pour les applications d’ingénierie des tissus osseux à base de cellules.

Protocole

REMARQUE: Tous les échantillons de patients ont été obtenus avec le consentement éclairé, et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Conseil d'examen Stanford University institutionnel (Protocole N ° 2188 et # 9999).

1. Isolement et culture cellulaire:

1. Obtenir le tissu adipeux sous-cutané humain provenant de patients sains de sexe féminin subissant lipoaspiration élective de l'abdomen, du flanc, et / région ou de la cuisse sous anesthésie locale / générale. Assurez-vous que l'Institutional Review Board (IRB) l'approbation a été obtenue pour le protocole d'isoler ASC de tissus humains, et suivre les précautions de sécurité institutionnels tout en travaillant avec de tels matériaux.
2. Pour obtenir le SVF à partir du tissu adipeux lipoaspirated, le lipoaspirat premier laver trois fois avec des volumes égaux de 1x solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Aspirer soigneusement et jeter la couche aqueuse inférieure.
3. Préparer le tampon collagénase de digestion: 0,075% collagénase de type I dans HankBalanced Salt Solution (HBSS). Préparer tampon FACS: 2% de FBS, 1% et 1% P188 Pen-Strep dans du PBS. Filtrez les deux solutions en utilisant un 0,22 um taille des pores débit rapide filtre polyéthersulfone disponible dans le commerce.
4. Pour digérer le tissu adipeux lavé, ajouter un volume égal de tampon de digestion à la collagénase et le placer récipient de digestion en toute sécurité dans un bain-marie à agitation pendant 60 min à 37 ° C (environ 180 secousses / min).
   REMARQUE: Il est préférable d'utiliser un récipient de digestion de volume plus important que nécessaire, car cela permet à la digestion maximale pendant l'agitation (c.-250 ml de tampon de digestion collagénase, 250 ml de tissu adipeux lavé dans un flacon stérile 1L).
5. Neutraliser l'activité enzymatique par addition d'un volume égal de tampon pour FACS et permettant de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min. Ensuite, centrifuger à 233 g pendant 20 min à 4 ° C.
6. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot SVF-haute densité.
7. Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de RT rougeTampon de lyse cellulaire, selon la taille du culot. Laissez la solution de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min et centrifuger à 233 g pendant 5 min à température ambiante.
8. Aspirer le surnageant et remettre le culot en ajoutant 5-10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille de pellets (milieu de Eagle modifié Dulbecco [DMEM] / 10% de FBS / 1% de pénicilline-streptomycine solution [pen-strep]).
9. On filtre la suspension à travers un filtre cellulaire en nylon de 100 um pour éliminer les débris cellulaires.
10. Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, et jeter le surnageant sans perturber le culot.
11. Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille du culot.
12. Placez 2 x 10 ⁶ cellules dans une boîte de culture de 15 cm standard et établir des cultures primaires O / N à 37 ° C / 21% d'O _2, 5% de CO _2. Maintenir au niveau sous-confluentes à prévenir une différenciation spontanée à 37 ° C / 21% O _2, 5% CO ₂ dans des milieux de croissance.
    La densité cellulaire dans un cadre entièrement: NOTEconfluentes 15 cm plaque est d'environ 4-6 x 10 ⁶ cellules.

2. coloration

1. CSA de la culture dans un milieu de croissance classique à 37 ° C / 21% O _2, 5% de CO _2, pendant 36 heures avant la coloration / tri.
2. ASC Ascenseur à partir de plaques de culture à l'aide Accutase (selon le protocole du fabricant).
3. Laver les cellules une fois avec du tampon FACS (PBS avec 2% de FBS et 1% de Pen-strep).
4. Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C.
5. Jeter le surnageant sans perturber le culot. Remettre en suspension les cellules dans 0,5 à 1 ml de tampon FACS (selon le nombre de cellules et la quantité souhaitée de l'anticorps).
   NOTE: Le volume de la suspension cellulaire, selon les recommandations du fabricant d'anticorps FACS, détermine la concentration d'anticorps. Cependant, le titrage de la concentration en anticorps, en utilisant une concentration de départ de 1: 100, est habituellement conseillé si ce est la première fois d'utiliser un anticorps.
6. Comptez le nombre total decellules en utilisant un hémocytomètre.
7. Réserve aliquotes de 100 ul dans 1,5 ml tubes de centrifugeuse à utiliser pour un échantillon non colorées et les contrôles d'une seule couleur (selon le nombre d'anticorps fluorescents utilisés).
8. Ajouter les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence appropriés (à des concentrations prédéterminées, selon les instructions du fabricant) et incuber pendant 20-30 min sur la glace, à l'abri de la lumière.
   1. Pour étiqueter sous-population ostéogénique: Diluer anti-CD90 (CD90 APC anti-humain (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humain (endogline)) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50.
   2. Pour marquer d'autres populations de cellules (par exemple, hématopoïétiques et les cellules endothéliales): Diluer anti-CD45 (anti-humain CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-humain CD34 APC), et / ou anti-CD31 (anti-humain CD31 PE ) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50.
   3. Si vous ne utilisez anticorps directement conjugués, utiliser un anticorps primaire biotinylé avec une seconde de streptavidine conjugué appropriéeary anticorps, tels que la streptavidine PE-Cy7, à une dilution de 1: 100.
9. Après incubation, laver les cellules deux fois: remplir les tubes avec du tampon FACS et centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, aspiration surnageant.
10. Remettre en suspension les cellules dans 400 à 500 échantillons ul FACS tampons et filtrer à travers une cellule de nylon filtre 70 um pour éliminer les grumeaux de cellules.
11. Transfert cellules marquées dans des tubes FACS avec le dessus du filtre et conserver des échantillons sur la glace pendant la durée de l'analyse.

3. fluorescence tri cellulaire activé

REMARQUE: Les étapes suivantes prescrivent des connaissances préalables dans la cellule activé par fluorescence (FACS) ou l'assistance d'un technicien qualifié.

1. Utilisation du logiciel FACS appropriées, parcelles d'analyse de conception pour examiner diffusion vers l'avant (FSC), diffusion latérale (SSC), la phycoérythrine (PE) -Texas rouge, bleu Pacifique, isothiocyanate de fluorescéine (FITC), Allophycocyanin (APC) et toute autre utilisation de fluorophored pour marquer les cellules.
2. Avant de charger dans le trieur de cellules, vortex brièvement chaque échantillon pour remettre en suspension les cellules.
3. Commencer avec l'analyse de l'échantillon non coloré afin de mettre en portes pour la population totale de la cellule, pour exclure les débris cellulaires, et de déterminer autofluorescence base.
4. Ajouter l'iodure de propidium (PI) à l'échantillon non colorées et les analyser afin de visualiser la population de cellules vivantes dans la population totale de la cellule. Construire une porte autour de cette population.
5. Analyser un échantillon de contrôle d'une seule couleur pour chaque fluorochrome pour régler la compensation de fluorescence.
6. Analyser l'échantillon teinté pour régler la position des portes pour le tri.
7. Ajouter PI à l'échantillon coloré pour colorer les cellules mortes.
8. Trier les populations cellulaires marqués. Trier soit 1,5 ml dans des tubes à centrifuger ou tubes coniques (15 ml) contenant du milieu de culture.
9. Cesser tri manuellement une fois que la quantité requise de cellules a été obtenue.
10. Nousing FACS, effectuer une vérification de la pureté en analysant une petite fraction (ex., 500 cellules) de la population de cellules acquise.
    NOTE: Cette étape confirme la pureté des populations de cellules triées. Idéalement, la pureté soit supérieure à 90-95%.
11. Centrifuger les cellules à 233 g pendant 5 min à 4 ° C immédiatement après la fin du tri et remettre en suspension dans 1 ml de milieu frais contenant 10% de FBS.
    REMARQUE: La quantité de support utilisé peut être augmentée en fonction de la taille du culot cellulaire.
12. Plate sur des plaques revêtues de gélatine pour améliorer la viabilité des cellules. Selon le rendement cellulaire finale, plaque 300000 cellules par puits dans une plaque à 6 puits, 100 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits.

Résultats

Utilisation de CD90 en tant que marqueur pour des cellules avec des résultats améliorés d'ostéogenèse en isolement d'une population hautement enrichi de CSA humains (Figure 1A, 1B). CSA ont été colorées avec Pacific Blue-CD45 anti-humain conjugué, conjugué à FITC anti-CD105 humain, et APC conjugué anti-CD90 humain. Après le tri, le niveau de pureté était supérieure à 98%, telle que quantifiée par une analyse post-tri.

Définir les groupes de cellules en fonction des profils d...

Discussion

Actuellement, l'isolement des sous-populations homogènes de CSA de la SVF de tissu adipeux humain reste un défi si objectif souhaitable. L'isolement de sous-populations de l'ASC pro-ostéogéniques est particulièrement souhaitable, car ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la formation et l'homéostasie des tissus squelettiques. Toutefois, le SVF du tissu adipeux abrite hétérogénéité significative en ce qui concerne d'endiguer la capacité des cellules et le potentiel de différenciation. ^...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes coniques jetables de 250 ml	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, glycémie élevée, supplément GlutaMAX	Gibco	10566-016
PBS, pH 7,4	Gibco	10010-023
Bétadine - Solution antiseptique de povidone/iode	Purdue  ;	PFC-67618015017
saline équilibrée de Hank, 1X	Cellgro	21-023-CV
Sérum de veau fœtal, certifié, origine américaine	Gibco	16000-044
Collagénase de  ; Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Solution de détachement de cellules	souches Stem Cell Technologies	7920
APC Souris anti-humaine CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Souris anti-humaine CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (remplacement du bleu pacifique)  ;	eBioscience	48-9459-41
CD34 anti-humain APC	eBioscience	17-0349-41
CD31 anti-humain (PECAM-1)	PE eBioscience	12-0319-41
Streptavidine PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences

Solution