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Article de méthode

Reconstitution d'une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

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DOI :

10.3791/52281

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22 janvier 2015

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1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

Dans cet article

Résumé

La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et - électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie.

Résumé

Géant vésicules unilamellaires (GUVs) sont un système biomimétique populaire pour l'étude des phénomènes associés à membrane. Cependant, les protocoles couramment utilisés pour cultiver GUVs doivent être modifiés afin de former GUVs contenant des protéines transmembranaires fonctionnelles. Cet article décrit deux méthodes de déshydratation-réhydratation - électroformation et gonflement assisté gel - pour former GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP. Dans les deux procédés, une solution de petites vésicules unilamellaires contenant des protéines est partiellement déshydraté pour former un empilement de membranes, qui est ensuite laissé à gonfler dans un tampon de réhydratation. Pour la méthode de électroformation, le film est déposé sur des électrodes de platine de telle sorte qu'un champ en courant alternatif peut être appliquée au cours de la réhydratation pellicule. En revanche, le procédé de gonflement assisté gel utilise un substrat en gel d'agarose afin d'améliorer le film réhydratation. Les deux méthodes peuvent produire GUVs dans (par exemple, 100 mM) des concentrations faibles en sel (par exemple, 5 mM) et physiologiques. Les GUVs résultantes sont caractérisées par microscopie à fluorescence, et de la fonction des canaux reconstituées mesurées en utilisant la configuration patch-clamp intérieur vers l'extérieur. Bien que le gonflement en présence d'un champ électrique alternatif (de électroformation) donne un rendement élevé de GUVs sans défaut, le procédé de gonflement assisté gel produit une distribution plus homogène de la protéine et ne nécessite aucun équipement spécial.

Introduction

Lorsque l'on étudie les principes physiques qui régissent les systèmes vivants, les approches bottom-up permettent un expérimentateur de contrôler la composition du système et d'autres paramètres qui ne sont pas faciles à manipuler dans les systèmes à base de cellules-1. Pour les procédés membranaires, Giant vésicules unilamellaires (GUVs, diamètre ~ 1-100 um) se sont révélés être un système biomimétique très utile 2-7 comme ils sont bien adaptés pour les études de microscopie et micromanipulation 8-10. Bien qu'il existe de nombreux protocoles différents pour produire GUVs, la plupart tombent dans deux catégories - émulsion à base approches 11,12 et techniques basées sur la réhydratation d'un film lipidique 13-16. Dans les procédés à base d'émulsion, les dépliants interne et externe des membranes GUV sont assemblés de manière séquentielle à partir de monocouches lipidiques aux interfaces eau / huile. Cette approche est idéale pour encapsuler des protéines solubles avecdans les GUVs, et pour former GUVs avec dépliant composition lipidique asymétrique. Cependant, GUVs formés à partir d'émulsions peuvent conserver des traces de solvant qui changent les propriétés mécaniques de la membrane 17, et l'approche ne est pas particulièrement bien adapté à la reconstitution trans-membranaire des protéines.

Modes de réhydratation du film reposent sur le fait que le séchage (déshydratation) provoque de nombreux mélanges de lipides pour former un empilement multi-lamellaire de membranes. Si cette pile est ensuite mise en contact avec un tampon aqueux, les membranes de la pile se déplacent en dehors des flux de solvant entre eux et à la surface de l'empilement, les membranes individuelles peuvent se détacher pour former GUVs 13,18 (ainsi un véritable zoo de d'autres objets lipidiques). Cependant, même pour les compositions de tampons et de lipides optimales, cette méthode classique "de gonflement spontanée" a un rendement relativement faible des GUVs sans défaut. Une méthode largement utilisée pour stimuler le rendement de GUVs sans défaut est "électroformation221 ;, dans laquelle un champ de courant alternatif (AC) est appliquée pendant le film réhydratation. Bien que le mécanisme reste mal comprise, "électroformation" peuvent donner des rendements de GUV spectaculaires (> 90% dans des circonstances favorables) pour faible teneur en sel des tampons de concentration (<5 mM) 14,19, et peut même travailler dans des tampons physiologiques (~ 100 mm) en utilisant une fréquence plus élevée (par rapport à 500 Hz 10 Hz) de champ en courant alternatif et des électrodes en platine 15. Une approche alternative pour augmenter le rendement de GUVs sans défaut est "assisté gel gonflant", dans lequel la solution lipidique est déposé sur un substrat de gel polymère plutôt que le passif (par exemple, le verre, PTFE) substrats utilisés dans "gonflement spontanée classique ». Lorsque le film lipidique / gel résultant est réhydraté, GUVs peuvent former rapidement même pour les tampons physiologiques 16,20.

Toutes ces méthodes peuvent produire GUVs lipidiques seule qui peuvent être utilisés pour étudier la membrane associée phénomènes tels que lainteraction entre les protéines solubles et les membranes. Cependant, à incorporer une protéine trans-membranaire dans GUVs, des modifications importantes sont nécessaires pour garantir que la protéine reste dans un état fonctionnel tout au long de la procédure de reconstitution. Bien que les solutions de lipides dans des solvants organiques (par exemple, le chloroforme, le cyclohexane) sont idéales pour produire des films lipidiques, les protéines transmembranaires sont généralement seulement stable lorsque leur domaine transmembranaire hydrophobe est incorporé dans une bicouche lipidique, ou entouré par une micelle de détergent ( par exemple, lors de la purification des protéines). Ainsi, le matériau de départ pour une reconstitution est typiquement membranes natives, la protéine purifiée dans une solution de détergent ou de petites vésicules contenant des protéines unilamellaires (Proteo-SUV) et / ou des vésicules multilamellaires (protéo-MLV) formés par élimination du détergent dans le présence de lipides. La plupart des méthodes d'intégrer ces protéines membranaires en GUVs se répartissent en trois catégories.

Insertio directn: protéine trans-membranaire en suspension dans le détergent est mélangé avec des lipides, seuls GUVs préformés, légèrement détergentes solubilisées, et le détergent ensuite éliminé en utilisant BioBeads 21. Bien que conceptuellement simple, cette méthode nécessite un contrôle précis de la concentration en détergent, comme une trop forte concentration de détergent puisse dissoudre les GUVs pendant trop faible peut entraîner une concentration de la protéine ou l'agrégat de se dérouler.

GUV / Proteo-SUV Fusion: protéines dans Proteo-VUS est combiné avec, lipides seulement GUVs préformés et la fusion est facilitée avec des peptides fusogènes spéciales 22 ou 21 détergent. Typiquement, la mesure de la fusion est Limited soit GUVs avec une densité faible en protéines.

La déshydratation / réhydratation: un film lipidique contenant des protéines est formée par la déshydratation partielle d'un protéo-SUV (ou protéo-MLV) et GUVs solution est ensuite cultivée comme pour un film lipidique pure. Le défi évident est de protéger la protéine pendant la dehydrati partielleà l'étape 23, mais la méthode a été utilisée avec succès pour reconstituer les protéines transmembranaires telles que bactériorhodopsine, calcium-ATPase, intégrine et VDAC en GUVs 7,23 - 25.

Cet article décrit les protocoles de déshydratation / réhydratation pour faire GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP, de la Archaea, Aeropyrum pernix hyper-thermophile. KvAP a un degré élevé d'homologie tension eucaryote dépendants canaux potassiques 26 et une structure cristalline connue 27 , ce qui en fait un bon modèle pour étudier le mécanisme de déclenchement de la tension. La production des Proteo-VUS a été décrite en détail précédemment, et ne fait pas partie de ce tutoriel 26,28,29. Fait important, KvAP Proteo-SUV ne ont pas à être produit pour chaque préparation d'GUV, car ils peuvent être stockés dans de petites aliquotes (par exemple, 10 pi) à -80 ° C pendant des périodes de temps prolongées (> 1 an). Électroformationou gonflement assisté gel peut alors être utilisé pour développer des GUVs KvAP Proteo-VUS (ou proteo-MLV).

Les principales étapes du protocole de électroformation sont illustrés sur la figure 1. Gouttelettes d'une solution de SUV contenant la protéine sont déposées sur des fils de platine (voir figure 2). La déshydratation partielle de la suspension de SUV conduit à la formation d'un film de protéine de lipide par la fusion des SUV. Au cours de la réhydratation, un champ en courant alternatif est appliqué aux électrodes afin d'aider les couches lipidiques pour délaminer et former GUVs. Un champ de 10 Hz fonctionne bien lorsque vous utilisez "pauvre en sel" (<5 mM) tampon de réhydratation 28 et GUVs prennent plusieurs heures à se développer. En revanche, les tampons physiologiques (contenant environ 100 mM de sel) bien travailler avec une tension inférieure, 500 Hz champ AC mais nécessitent un prolongée (~ 12 h) Période de 15 gonflement. Cette méthode est basée sur un protocole antérieur utilisant ITO glisse 24, mais utilise une suite de chambre personnaliséeaining deux fils de platine comme le montre la figure 2 (voir la discussion pour plus de détails de conception et des suggestions pour simple, chambres improvisé).

La figure 3 illustre le procédé de gonflement assisté gel. Le protocole fonctionne bien avec des tampons ayant des concentrations salines physiologiques, est rapide et produit GUVs avec une distribution plus homogène de protéines. Toutefois, le rendement des isolés GUVs, apparemment sans défaut (ce est à dire, la membrane GUV est uniforme à longueur échelles optiques et ne englobe pas tous les objets) est plus faible, mais il fournit un nombre suffisant de patch-clamp et les expériences de micro-manipulation . Cette méthode est basée sur un protocole utilisant un gel d'agarose pour produire GUVs lipidiques seule 16 et nécessite un équipement moins spécialisé que la méthode de électroformation.

La caractérisation de GUVs avec la microscopie de fluorescence est décrite, ainsi que des modes opératoires utilisant un patch-clamp configuration standardmesurer l'activité KvAP dans "inside-out" excisées patches membranaires.

Croissance GUVs contenant des protéines peuvent être plus difficile que GUVs lipidiques seule. En particulier, le rendement en GUV finale peut dépendre sensible sur exactement comment la solution de SUV est déposé et déshydraté pour former l'empilement de membrane. Pour une personne sans expérience antérieure avec GUVs, il peut être utile d'augmenter premier GUVs lipidiques uniquement suivant un protocole classique 15,16 dans lequel le film de la membrane est formée par dépôt de lipides dans un solvant organique. Une fois le protocole classique fonctionne bien, dépôt SUV et déshydratation partielle peuvent être maîtrisés à l'aide VUS lipidiques seule, qui sont également très utile lors du réglage du protocole pour une nouvelle composition lipidique. Lorsque GUVs poussent fiable de VUS de lipides seulement, il ne est alors qu'une petite étape pour produire GUVs contenant des protéines de Proteo-VUS.

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Protocole

1. Solution Préparation

  1. Préparer 5 ml de "tampon de SUV" contenant 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou TRIS (pH 7,5) et 2 mM de trehalose. Filtrer le tampon avec un filtre à seringue de 0,2 um et diviser en portions aliquotes de 1 ml qui peuvent être stockées à -20 ° C.
    REMARQUE: Des détails supplémentaires pour les réactifs et les instruments sont donnés dans la liste des matériaux.
  2. Préparer 40 ml de «tampon croissance» GUV qui permettra de combler l'intérieur GUV pendant le film réhydratation. Pour une croissance «faible teneur en sel», combiner 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou 1 mM de TRIS (pH 7,5), et ~ 400 mM de saccharose. Pour une croissance 'de sel physiologique ", combiner KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de TRIS (pH 7,5) et 200 mM de saccharose ~.
  3. Préparer 40 ml de «tampon d'observation" pour la solution externe à la chambre expérimentale en combinant KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de TRIS (pH 7,5), et ~ 200 mM de glucose.
    NOTE: Ces tampons ne sont examples. Voir la discussion d'adapter les tampons pour d'autres expériences.
  4. Mesurer les osmolarités des tampons de croissance et d'observation avec un osmomètre. Ajouter granules de saccharose ou de glucose pour les faire correspondre à 1% afin que GUVs ne seront pas lyser ou se effondrer lors de son transfert de la chambre de croissance à la chambre d'observation.
    NOTE: Dans cette gamme de concentration, en ajoutant 1 mM de saccharose (13,7 mg par 40 ml) ou de glucose (7,2 mg par 40 ml) augmente osmolarité par ~ 1 mOsm.
  5. Filtrer les tampons de croissance et d'observation avec un filtre de 0,2 um et de les stocker à 4 ° C pour inhiber la croissance bactérienne.
  6. Dissoudre 50 mg de bêta-caséine dans 10 ml de TRIS (pH 7,5) de tampon 20 pour former une solution de bêta-caséine 5 mg / ml nécessaire pour passiver les surfaces des chambres expérimentales pour que GUVs ne collent pas, la propagation et rafale. Une fois que la bêta-caséine soit complètement dissous (jusqu'à plusieurs heures à 4 ° C), un filtre (0,2 pm) en aliquots de 0,5 ml qui peut être congelé et stocké éclairà -20 ° C pour une utilisation ultérieure (aliquotes décongelées stockées à 4 ° C peut généralement être utilisé jusqu'à une semaine 1).

2. Préparation SUV

  1. Préparer et congeler des aliquotes de Proteo-VUS suivants du protocole détaillé publié antérieurement 28. Utilisation KvAP marqué par fluorescence avec Alexa 488-maléimide, reconstitué dans DPhPC VUS (10 mg / ml) à une protéine à lipide de 1:10 (en masse).
    Remarque: de type sauvage contient une cystéine KvAP par monomère situé près du C-terminal intracellulaire (acide aminé 247).
  2. , VUS lipidiques seule fluorescentes:
    REMARQUE: Manipulez chloroforme sous une hotte de porter des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Éviter l'utilisation de toute matière plastique que le chloroforme peut les dissoudre. solutions dans le chloroforme peuvent être stockés dans des flacons en verre ambre avec des bouchons en Téflon et transférées au moyen de seringues en verre. Prenez soin de rincer toute la verrerie au moins 5 à 10 fois avec du chloroforme avant et après pipetage lipides.
    1. Préparer 100 ul de10 Véhicules mg / ml DPhPC contenant 0,5% en moles du lipide fluorescent rouge, le rouge Texas-DHPE, en mélangeant 100 ul de solution DPhPC (10 mg / ml dans le chloroforme) avec 8,2 ul de solution Texas Red-DHPE (1 mg / ml dans du methanol) dans un flacon en verre ambré de 1,5 ml.
    2. Sécher les lipides vers le bas sous un courant d'azote dans une hotte chimique tout en faisant tourner le flacon. Lorsque le film semble être sec, placez les lipides sous vide pendant 3 heures pour éliminer tout solvant résiduel.
    3. Ajouter 100 ul de tampon SUV aux lipides, et vortex vigoureusement jusqu'à ce qu'il ne reste collé lipidique sur les parois du flacon et la solution est laiteux uniforme.
    4. Soniquer la solution de lipide pour former VUS. Ajustez la position flacon jusqu'à ce que l'échographie cause le plus de mouvement et de circuler à l'intérieur du flacon, et de prendre soin de ne pas chauffer la solution inutilement. Continuer sonication jusqu'à la solution devient translucide, ou lorsque possible, transparent (2-5 min pour embout sonication, ~ 20 min pour les bains à ultrasons).
    5. Aliquot VUS (par exemple, 10 pi ou 20 pi) et gel (-20 ° C) pour une utilisation ultérieure.
      NOTE: Les lipides, en particulier les lipides insaturés, peut facilement ventilation. solutions lipidiques de magasin à 20 ° C (ou 80 ° C) sous argon et utiliser dans les 6 mois. Produits de dégradation des lipides peuvent être détectés avec chromatographie sur couche mince.

3. GUV croissance par électroformation

  1. Préparer la chambre de électroformation.
    1. Si la chambre n'a pas été nettoyé, retirez les fenêtres, essuyer le scellant et de graisse, extraire les fils, et rincer et frotter la chambre avec un tissu en utilisant l'eau et de l'éthanol (≥70%) en alternance.
    2. Frottez les fils ainsi, plonger les fils et la chambre dans l'acétone et soniquer pendant 5 min. Tout essuyer avec un tissu à nouveau avec de l'acétone. Mettre la chambre dans l'éthanol et de traitement par ultrasons pendant 5 min.
    3. Assemblez la chambre en insérant les fils à travers les trous, et faire pivoter et essuyez les fils pour vous assurer qu'ils are propre. Mettre la chambre dans l'eau distillée, sonication pendant 5 min et sécher la chambre avec un courant d'azote ou d'air.
  2. Préparer 30 ul de 3 mg / ml de suspension de SUV dans un tampon SUV. Pour former GUVs contenant des protéines, mélanger 8 pi de Proteo-VUS (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01h10), 2 pi de VUS fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) et 20 pi de SUV tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml pour une protéine finale de lipide (masse) d'un rapport de 1: 12,5 et 0,1% en moles TexasRed-DHPE. Mélanger vigoureusement la solution.
    1. Sinon, pour pratiquer le protocole avec lipides seulement VUS, simplement combiner 10 pi de VUS fluorescentes (10 mg / ml et 0,5 mol DPhPC% TexasRed-DHPE) avec le tampon de SUV de 20 pi.
  3. Déposer la solution SUV.
    1. Utiliser une pipette de 2 5 ul ul ou seringue en verre pour déposer de petites (<0,2 ul) des gouttelettes de la solution de SUV sur les fils. Environ 1 ul de solution sont nécessaires pour former une série de gouttes le long de1 cm de fil. Assurez-vous que les gouttes sont assez petit et suffisamment espacées qu'ils ne touchent pas ou le fusible.
    2. Laissez les VUS déposés sécher pendant ~ 30 min à l'air libre. Lorsque toutes les gouttes se sont installés, tourner le fil de sorte que les dépôts lipidiques sont plus faciles à observer avec le microscope.
      NOTE: Si les VUS ne se dessèchent pas suffisamment, ils peuvent tout simplement laver les fils lorsque la mémoire tampon de croissance est ajouté, pendant le séchage trop peut endommager les protéines. Étant donné que l'humidité de l'air influe sur la vitesse de séchage, le temps de séchage et / ou l'humidité de l'air peut être ajustée 30 pour des résultats optimaux. Le film lipidique sur les fils doit être visible sous un microscope.
  4. Assemblez la chambre.
    1. Sceller le fond de la chambre: Utiliser une seringue pour appliquer la graisse à vide au fond de la chambre autour des trois puits et appuyez doucement à 40 mm x 22 mm lamelle contre elle pour sceller le fond de la chambre, de sorte qu'il adhère sans lacune. Sceller les côtés de la chambre (où la sortie des fils) avecpâte d'étanchéité. Appliquer de la graisse à vide au-dessus de la chambre décrivant les trois puits.
    2. Ajouter lentement tampon de la croissance jusqu'à ce que chaque puits est rempli jusqu'en haut. Éviter tout mouvement rapide de la solution dans les puits comme cela peut décaper le film lipidique hors tension les électrodes.
    3. Fermez la chambre en appuyant sur la lame du capot supérieur doucement sur la graisse, en prenant soin de ne pas déloger la lamelle inférieure. Utilisez un tissu pour enlever les gouttes de tampon sur les bords du capot supérieur glissement.
      NOTE: Ce est un bon temps pour examiner la chambre sous le microscope pour confirmer que le film lipidique est resté sur les fils.
  5. Branchez le générateur de signal pour les câbles à l'aide de deux pinces crocodiles. Régler la fréquence (10 Hz / 500 Hz sinusoïdal pour le tampon de sel basse / haute) et utiliser un multimètre pour mesurer et ajuster la tension entre les fils à 0,7 / 0,35 V racine carrée (Vrms) pour le tampon de sel bas / haut signifie. Couvrir la chambre avec du papier aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière. Laissez tes GUVs croître pendant 2 à 3 h pour le tampon de faible teneur en sel, et 12 h ou H / N pour le tampon à haute teneur en sel.
  6. Déconnecter la chambre de générateur et soigneusement le placer sur un microscope inversé à évaluer l'évolution de la GUV. Utilisez des mouvements lents et réguliers ou l'écoulement de fluide dans les puits peut se détacher prématurément GUVs des fils.
    REMARQUE: GUVs sur les bords de fils sont généralement visibles en contraste de phase (40X travail de longue objectif à distance), alors que GUVs ne importe où sur la partie inférieure des fils sont visibles à épifluorescence. Si aucune GUVs sont visibles, essayez de tourner les fils à regarder la surface supérieure. GUVs peuvent être conservés à 4 ° C dans une chambre de croissance pendant plusieurs jours.

4. GUV croissance par Gonflement Gel assistée

  1. Préparer 10 ml d'une solution d'agarose à 1% en mélangeant 100 mg d'agarose avec 10 ml d'eau pure. Chauffer jusqu'à ébullition en le plaçant dans un micro-ondes à 480 W pour ~ 20 sec. Remuer pour se assurer que l'agarose est complètement dissous.
    REMARQUE: La solutionpeuvent être stockées à 4 ° C et réchauffé si nécessaire.
  2. (air plasma) de plasma nettoyer une couverture-toboggan pour 1 min afin que la solution d'agarose se étendra bien sur il. Utilisez les couvre-diapositives dans les 15 prochaines minutes que l'effet de nettoyage au plasma se dissipe rapidement.
  3. Appliquer 200 ul d'une solution chaude d'agarose à chaque 22 x 22 mm 2 de sorte que le coulisseau solution mouille toute la surface. Inclinez la lame verticalement et toucher le bord inférieur à un tissu pour enlever l'excès de liquide et il suffit de laisser une couche mince et lisse d'agarose sur la diapositive.
  4. Placer la lame sur une plaque chauffante ou un four à 60 ° C et laisser sécher pendant au moins 30 min. Le film est à peine visible agarose à l'oeil. Après les diapositives refroidir à température ambiante, les utiliser immédiatement, ou de les stocker pendant une semaine dans un récipient fermé à 4 ° C.
  5. Placez la lamelle d'agarose revêtues dans un plat de 3,5 cm de Pétri.
  6. Préparer la solution de SUV comme dans la section 3.2 et appliquer ~ 15 pi de la solution de SUV (3 mg / lipide ml) dans~ 30 très petites gouttes doucement sur la surface agarose. Prenez soin de ne pas fausser la couche d'agarose trop.
  7. Placez la lame sous un léger courant d'azote pendant environ 10 à 15 min et suivez l'évaporation de la mémoire tampon à l'oeil que les gouttelettes sèchent.
  8. Dès que les VUS ont séché, ajouter tampon de croissance pour couvrir la surface de glissement. Pour un petit 3,5 cm boîte de Pétri utilisation ~ 1 ml de tampon.
  9. Laisser le gonflement se dérouler pendant ~ 30 min, puis examiner la croissance de GUVs dans la chambre à l'aide d'un microscope inversé avec contraste de phase ou contraste d'interférence différentiel (DIC).
    NOTE: observation épifluorescence est difficile en raison de la solide expérience de fluorophores dans le gel et l'auto-fluorescence de l'agarose.

5. La récolte et observation GUVs

  1. Passiver la chambre d'observation (par exemple, une petite boîte de Pétri ou lamelle de verre) de sorte que GUVs ne collent pas, la propagation et éclater sur le fond de chambre. Couvrir le chambre de fond avec une solution de bêta-caséine, incuber pendant 5 min, rincer la solution de caséine avec de l'eau pure, sèche avec un courant d'air ou de l'azote, et enfin ajouter tampon d'observation (par exemple, ~ 5 mm de profondeur pour une petite boîte de Pétri).
  2. Récolter les GUVs. Couper le bout de 100 embouts de pipette ul donc l'ouverture est plus grande (~ 2 mm de diamètre), et aspirer lentement que la contrainte de cisaillement de pipetage peut facilement détruire GUVs.
    1. Pour GUVs électro-formée, ouvrir la chambre de croissance en retirant doucement la lamelle supérieure. Placez la pointe de la pipette directement au-dessus de chaque fil et aspirer ~ 50 pi tout en déplaçant la pointe de la pipette le long du fil de détacher les GUVs.
      NOTE: Il peut être utile pour faire tourner le fil de recueillir GUVs de "l'autre côté" du fil.
    2. Pour GUVs "assisté gel-gonflement", appuyez d'abord sur le côté de la boîte de Pétri à quelques reprises pour aider les GUVs détachent de la surface de lamelle. Placez la pointe de la pipette juste au-dessus de la lamelle et aspirer 50 pi tout en pulling la pointe de retour sur la surface. Transférer directement GUVs récoltés à une chambre d'observation, ou un magasin dans un tube de 1,5 ml à 4 ° C pendant 1 semaine.
  3. Placez la chambre d'observation sur un microscope inversé, ajouter les GUVs à la chambre d'observation, et attendre quelques minutes pour que les GUVs à se déposent au fond de la chambre.
  4. Enquête sur la chambre avec un contraste de phase ou DIC pour localiser rapidement lisses, sphériques ('sans défaut') "candidats GUV". Examinez chaque «candidat GUV» dans épifluorescence afin d'exclure tout petits liposomes contenant imbriquées à l'intérieur. Enfin, vérifiez que l'intensité de fluorescence des lipides est uniforme et compatible avec une seule membrane (ce est à dire, unilamellaire).
    NOTE: Dans certains bilamellaire (ou multi-lamellaires) vésicules, les membranes sont trop proches pour être résolus afin qu'ils apparaissent unilamellaire en contraste de phase ou images DIC. Cependant, ces objets peuvent être distingués des unilame réelGUVs Llar par leur fluorescence lipidique, qui est deux fois (ou plus) lumineux.

6. GUVs Patch-serrage

  1. Assurez-pipettes de patch avec un diamètre de pointe de 1-2 um à partir de verre borosilicate capillaire standard en utilisant le programme recommandé pour l'extracteur de pipette.
    NOTE: Les traitements spéciaux tels que polissage au feu ne sont pas nécessaires, et pipettes peuvent être utilisés pendant plusieurs jours après qu'ils ont été tirés se ils sont conservés dans une boîte fermée.
  2. Passiver la chambre par incubation avec une solution de bêta-caséine (5 mg / ml) pour se assurer que GUVs ne adhèrent pas, et répartis sur les surfaces de rupture de la chambre. Rincer la caséine éteint après 5 min.
  3. Insérez l'électrode de masse, remplir la chambre avec un tampon d'observation, transférer 10 pi de la suspension de GUV comme décrit dans l'étape 5.2 et 5.3, et attendre quelques minutes pour que les GUVs à se déposent au fond.
  4. Remplir une pipette de patch avec une solution fraîche (tampon d'observation ou d'une autre solution iso-osmotique) etmonter sur le patch-clamp amplificateur headstage.
  5. Recherche à travers la chambre pour trouver une GUV "sans défaut" comme décrit dans la section 5.4, et vérifiez qu'il contient une protéine fluorescente.
  6. Appliquer une pression positive constante (> 100 Pa, soit environ 1 cm H 2 O dans un manomètre) pour maintenir la pipette de patch intérieur propre, et insérez la pipette de patch dans la chambre. Apportez la pipette de patch dans le champ de vision, appliquer des impulsions de test pour mesurer / compenser le décalage et la résistance tension de pipette, et examiner la pipette sous éclairage fluorescent pour confirmer que la pointe est propre.
  7. Apportez la pipette de patch vers la GUV, et, si nécessaire, de réduire simultanément la pression positive pour l'écoulement vers l'extérieur de la pipette de patch ne rend pas la GUV "se enfuir". Lorsque la pipette de patch est proche de la GUV, appliquer une pression négative (jusqu'à 5 cm H 2 O) pour tirer la GUV contre la pipette de patch. Surveiller la résistance comme le "; Langue "de la membrane GUV entre dans la pipette de patch et les formulaires de gigaseal.
  8. Si un gigaseal ne forment pas, retirer la pipette de patch de la chambre et retourner à l'étape 6.4. Si la pièce de membrane formé un gigaseal, mais le GUV reste attaché à la pipette, exciser le patch en tirant loin de la GUV, éclatement de la GUV contre le fond de la chambre, ou brièvement déplacer la pipette de la solution.
  9. Lorsque la pièce de membrane inside-out a été excisé du GUV et la gigaseal est stable, éteindre les impulsions de test et appliquer un protocole de tension tel que celui représenté sur la figure 13.
    REMARQUE: Figure 13 suit la convention électrophysiologique standard pour un correctif inside-out dans lequel le courant circulant dans le patch-électrode est «positif», et V = V salle de bain - V pipette. Tenir le patch à un potentiel négatif (par exemple, V = -100 mV) pour ~ 30 sec endroits KvAP dans l'état de repos, tandis que les étapes (100 ms à 5 sec) à des potentiels plus positifs (par exemple, V = 100 mV) peut alors conduire dans conductrices (c.-à-ouverts) états actifs.
  10. Après les mesures sur une pièce de membrane sont finis, briser le patch avec une impulsion zap ou de la pression et vérifier que le décalage de l'électrode de patch tension n'a pas dérivé. Retirer la pipette de patch de la chambre, et retourner à l'étape 6.4.

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Résultats

La croissance de GUVs peut être évaluée en examinant rapidement la chambre de croissance sous le microscope. Pour électroformation, les GUVs ont tendance à croître en grappes le long des fils de platine, comme le montre la Figure 4. Au cours de gonflement assisté gel, GUVs apparaissent comme des structures sphériques qui se développent rapidement et fusionnent ensemble (figure 5).

GUVs sans défauts sont plus facilement identifiés et évalués après avoir trans...

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Discussion

Systèmes modèles biomimétiques sont un outil important pour étudier les propriétés et les interactions des protéines et les membranes. Comparé à d'autres systèmes reconstitués comme BLM ou membranes lipidiques supportées, GUV systèmes basés offrent plusieurs possibilités, y compris un contrôle considérable de la composition de la membrane, la tension et la géométrie, ainsi que d'être vraiment libre d'huile. Cependant, l'incorporation des protéines transmembranaires, comme KvAP, dans GUVs nécessite des ad...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Susanne Fenz d’avoir discuté de la possibilité de reconstituer les protéines par gonflement de l’agarose, Feng Ching Tsai pour les mesures actuelles, et les membres actuels et anciens du groupe Bassereau pour leur soutien et leur assistance. Le projet a été financé par l’Agence Nationale de la Recherche (subvention BLAN-0057-01), par la Commission européenne (NoE SoftComp), par l’Université Pierre et Marie Curie (subvention de la FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. a été soutenu par une bourse internationale de doctorat de l’Institut Curie, S.A. par une bourse de la Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. par une bourse internationale entrante Marie Curie de la Commission européenne et une bourse de l’Université Pierre et Marie Curie. Les frais de publication ont été pris en charge par le Labex 'CelTisPhyBio' (ANR-11-LABX0038).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids  ;850356P
Oeuf PC L-&alpha ;-phosphatidylcholine (Oeuf, Poulet)  ;Lipides Polaires Avanti·s² ;840051P
Oeuf PA Acide L-&alpha ;-phosphatidique (Oeuf, Poulet)Avanti Polar Lipids  ;840101P
18:1 (&Delta ; 9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids  ;850375P
Cholestérol (laine ovine, >98 %)  ;Lipides Polaires Avanti·s² ;700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MPlipide
marqué BPTR-CéramideInvirtogenD-7540  ;Lipide marqué
CholoroformeVWR22711.290AnalaR Normapur
AcétoneVWR20066.296AnalaR Normapur
EthanolVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
Hamilton seringues  ;Hamilton Bonaduz AGdiverse
Flacons ambrés et godets en téflonSigmaSU860083 et SU860076
ParafilmVWR291-1214
Tube à microcentrifugerEppendorfdiverse
AgaroseEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
SaccharoseSigma84097-1kg
Glucose  ;SigmaG8270-1kg
TrehaloseSigmaT9531-25G
KClSigmaP9333-1kg
HepesSigmaH3375-100G
TRISEuromexEU0011-A
OsmomètreWescorVapro
pH-mètreSchott instrumentsLab850
SonicateurElmasonicS 180 H
Filtre seringue 0.2 µ ; mSartorius steimMinisart 16532
Générateur de fonctionsTTiTG315
Fils de platineGoodfellowLS41307499,99+ %, d = 0,5 mm
PolytétrafluoroéthylèneGoodfellow
Dow Corning 'graisse sous videpousséVWR1597418
pâte d’étanchéitéVitrex medical A/S, DanemarkREF 140014Sigillum Wax Cover
slides 22 x 40 mm No1.5VWR631-0136
Slides de couverture 22 x 22 mm No1.5VWR  ;631-0125
Nettoyeur plasmaHarrickPDC-32Gairplasma, réglage 'haut’Boîtes de
PétriFalcon BDREF 3530013,5 cm x 1 cm
clamp amplificateurAxon instrumentsMulticlamp700B
DAQ CardNational InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instrumentsversion 8.6
Pipettes en verre boro silicate OD 1  ; mm ID 0.58  ; mmHarvard ApparatusGC100-15
Porte-électrodeWarner Instruments  ;Q45W-T10P
MicromanipulateurSutter  ;MP-285
Extracteur de pipetteSutter  ;P-2000  ;
Appareil photoProSilica  ;GC1380
Microscope Zeiss ZeissAxiovert 135
ObjectifZeiss40X longue distance de travail, Objectif à contraste de phase
  ;Zeiss100X Plan-Apochromat NA 1.3
Jeu de filtres GFP (pour Alexa-488)HoribaXF100-3
Jeu de filtres Cy3 (pour TexasRed)HoribaXF101-2
bêta-caséineSigma  ;C6905-1G
Microscope confocalNikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 Tête confocale
ObjectifNikonPlan Fluor 100X NA 1.3
MatlabMathworkspour le traitement d’images et l’analyse des traces de courant
patch

Références

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