Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Résumé

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Résumé

Cultures de neurones spécifiques de maladies humaines sont essentielles pour générer des modèles in vitro pour les maladies neurologiques humaines. Cependant, le manque d'accès aux cultures de neurones adultes humaines primaires soulève des défis uniques. Les développements récents dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) fournit une approche alternative pour obtenir des cultures de neurones à partir de fibroblastes de la peau grâce à des patients iPSC spécifique, mais ce processus est beaucoup de travail, nécessite une expertise spéciale et de grandes quantités de ressources, et peuvent prendre plusieurs mois. Cela empêche la large application de cette technologie à l'étude des maladies neurologiques. Pour surmonter certaines de ces questions, nous avons développé une méthode pour produire des cellules souches neurales directement à partir de sang périphérique humain adulte, en contournant le processus de dérivation iPSC. Des cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies à partir du sang périphérique humain adulte ont été cultivées in vitro et transfectées avec des vecteurs du virus Sendai contenant des facteurs de transcription Sox2, octobre4.3, Klf4, et c-Myc. Les résultats de transfection dans des changements morphologiques dans les cellules qui sont ensuite sélectionnés à l'aide de milieu neuronale progénitrice humaine contenant le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Les cellules résultantes sont caractérisées par l'expression de marqueurs de cellules souches neurales, comme la nestine et SOX2. Ces cellules souches neurales peuvent être en outre différenciés pour les neurones, astrocytes et oligodendrocytes dans un milieu de différenciation spécifique. En utilisant des échantillons facilement accessibles du sang périphérique humain, cette méthode pourrait être utilisée pour dériver des cellules souches neurales pour une différenciation plus poussée de cellules neurales pour la modélisation in vitro de troubles neurologiques et peut progresser les études liées à la pathogenèse et le traitement de ces maladies.

Introduction

In vitro des cultures de neurones ont été utilisés comme un outil fondamental pour l'étude des maladies neurologiques. Animaux primaires (principalement les rongeurs) des cultures de neurones ^{1, 2} et des lignées de cellules neurales humaines dérivées de gliomes et autres tumeurs sont le plus couramment utilisé dans de telles études. Cependant, il a été reconnu qu'il existe des différences significatives entre les rongeurs et les cellules humaines. Beaucoup de conclusions fondées sur les rongeurs ne peuvent pas être convertis pour les humains. En outre, avec l'évolution rapide dans l'analyse de l'information de masse génomique e....

Protocole

1. Enrichissement de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang total des adultes

REMARQUE: Les cellules progénitrices hématopoïétiques ou les cellules CD34 + peuvent être purifiés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant de diverses sources, dont le sang de cordon, la matière de cytaphérèse et le sang total en utilisant des procédés à base de centrifugation à gradient de densité. Procédé énumérés ici utilise le sang total, par exemple.

1. Isolement de PBMC de sang total:
   1. Ajouter 4,5 ml de milieu de séparation de lymphocytes au tube SepMate par aspiration à travers le trou central de ....

Résultats

La qualité des cellules CD34 est critique pour le succès de neurones transduction de cellules souches. Cellules CD34 haute qualité prolifèrent au cours du premier couple de jours de culture et apparaissent comme non adhérente, les cellules homogène rondes, flottant juste au-dessus du fond des récipients de culture (figure 1A). Les résultats de l'infection réussie en agrégats de cellules, qui se étend au fil du temps (figure 1B), tandis que les agrégats de cellules non spécifiques peuven.......

Discussion

Un protocole détaillé pour générer directement des cellules souches neurales à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques périphériques est fourni.

Par rapport à des cellules de fibroblastes, du sang périphérique humain est plus accessible. En utilisant le protocole présenté, plus de 1 x 10 ⁵ cellules progénitrices hématopoïétiques, ou des cellules positives CD34, peuvent être enrichies à partir de 10 ml de sang entier. Bien que la contamination par des plaquettes est génér.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu de séparation des lymphocytes	Lonza	17-829E	1x
SepMate	Stemcell Technologies	15415	15 ml
Sérum humain	Invitrogen	34005-100
Antibiotiques	Gibco	15240-062	1 %
CD34 MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-056-701
EDTA	Cellgro	46-034-Cl	2 mM
MACS LS colonne	Miltenyi Biotec	130-042-401
StemSpan SFEM medium	Stemcell Technologies	9650	1x
IMDM	Quality Biologicals	112-035-101	1x
TPO	Peprotech	300-18	100 ng/ml
Flt-3	Peprotech	300-19	100 ng/ml
SCF	Peprotech	300-07	100 ng/ml
IL-6	Peprotech	200-06	20 ng/ml
IL-7	Peprotech	200-07	20 ng/ml
IPS Sendai Kit de reprogrammation	Life Technologies	A1378001
Racleur de cellules	Sarstedt	83.183
DMSO	Sigma	D2650
CryoTube flacons	Thermo	368632
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
DMEM/F12	Life Technologies	12400-024	1x
supplément N2	Life Technologies	17502-048	1x
albumine sérique bovine	Sigma	A2934	0,1 % (p/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 supplément	Life Technologies	17504-044	1x
sérum sans sérum NSC moyen	Life Technologies	A1050901	1x
lamelles enrobées de poly-D-lysine/laminine	BD Bioscences	354087
cAMP	Sigma	A9501	300 ng/ml
Vitamine C	Sigma	A0278	0,2 mM
BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml
GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/ml
Poly-L-ornithine	Sigma	P4957	1x
PDGF-AA	Peprotech	100-13A	10 ng/ml
NT-3	Peprotech	450-03	2 ng/ml
Shh	Peprotech	1314-SH/CF	2 ng/ml
T3	Sigma	T6397	3 nM
PFA	Sigma	P6148	4 %
PBS	Qualité Biologique	119-069-101	1x
sérum de chèvre	Sigma	G9023	4 %
TritonX-100	Sigma	T9284
Souris monoclonale anti-Nestin	Millipore	AB5922	dilution 1:1 000
Anti-SOX2 anticorps	Cellules souches appliquées	ASA0120	Prêt à l’emploi
Souris anti-&bêta ; Anticorps III-tubuline	Promega	G712A	dilution 1:1 000
Anticorps anti-GFAP de lapin	Sigma	G4546	dilution 1:100
Anticorps anti-O4	R& D Systems	MAB1326	IgM ; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin	anticorps Life techniologies	A11012	dilution 1:400
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris	Life techniologies	A11001	dilution 1:400
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgM	anticorps Life techniologies	A21042	dilution 1:250
DAPI	Sigma	D9542	1 &mu ; g/ml