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Article de méthode

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

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DOI :

10.3791/52298

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28 janvier 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Résumé

Cultures de neurones spécifiques de maladies humaines sont essentielles pour générer des modèles in vitro pour les maladies neurologiques humaines. Cependant, le manque d'accès aux cultures de neurones adultes humaines primaires soulève des défis uniques. Les développements récents dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) fournit une approche alternative pour obtenir des cultures de neurones à partir de fibroblastes de la peau grâce à des patients iPSC spécifique, mais ce processus est beaucoup de travail, nécessite une expertise spéciale et de grandes quantités de ressources, et peuvent prendre plusieurs mois. Cela empêche la large application de cette technologie à l'étude des maladies neurologiques. Pour surmonter certaines de ces questions, nous avons développé une méthode pour produire des cellules souches neurales directement à partir de sang périphérique humain adulte, en contournant le processus de dérivation iPSC. Des cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies à partir du sang périphérique humain adulte ont été cultivées in vitro et transfectées avec des vecteurs du virus Sendai contenant des facteurs de transcription Sox2, octobre4.3, Klf4, et c-Myc. Les résultats de transfection dans des changements morphologiques dans les cellules qui sont ensuite sélectionnés à l'aide de milieu neuronale progénitrice humaine contenant le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Les cellules résultantes sont caractérisées par l'expression de marqueurs de cellules souches neurales, comme la nestine et SOX2. Ces cellules souches neurales peuvent être en outre différenciés pour les neurones, astrocytes et oligodendrocytes dans un milieu de différenciation spécifique. En utilisant des échantillons facilement accessibles du sang périphérique humain, cette méthode pourrait être utilisée pour dériver des cellules souches neurales pour une différenciation plus poussée de cellules neurales pour la modélisation in vitro de troubles neurologiques et peut progresser les études liées à la pathogenèse et le traitement de ces maladies.

Introduction

In vitro des cultures de neurones ont été utilisés comme un outil fondamental pour l'étude des maladies neurologiques. Animaux primaires (principalement les rongeurs) des cultures de neurones 1, 2 et des lignées de cellules neurales humaines dérivées de gliomes et autres tumeurs sont le plus couramment utilisé dans de telles études. Cependant, il a été reconnu qu'il existe des différences significatives entre les rongeurs et les cellules humaines. Beaucoup de conclusions fondées sur les rongeurs ne peuvent pas être convertis pour les humains. En outre, avec l'évolution rapide dans l'analyse de l'information de masse génomique et le montage de gène relativement facile et le séquençage du génome entier, la tendance est de plus en plus axé sur la découverte de gènes sujettes aux maladies et de délimiter leurs fonctions et leurs rôles dans les maladies spécifiques, ce qui rend les quelques neuronal humain lignées cellulaires ne ont limité l'utilisation. Théoriquement, les cultures de neurones primaires humaines dérivées à partir d'échantillons du système nerveux du patient sont le meilleur choix, mais ils sont impossibles à obtenir; meth donc alternatifSAO sont nécessaires. Au cours des dernières années, certaines approches ont été poursuivis, avec deux étant le plus distinguée. Après le développement de la technique de génération de cellules souches pluripotentes induites (CISP) en utilisant la souris et des cellules somatiques humaines 3, 4, cellules neurales pourrait être encore différencié d'eux 7.5. Cependant, la génération et la caractérisation iPSC demande de main-d'œuvre, les techniques, et l'entrée de temps, parfois même prohibitif. Peu de temps après, une autre approche a été développée pour transformer directement des cellules neuronales à partir de cellules somatiques 8, 9. Comme les neurones qui en résultent sont non proliférative, il limite son application dans des études intensives et le criblage de médicaments, ce qui nécessite une grande quantité de cellules. Pour profiter des avantages des deux techniques, dérivation directe des souches neurales / cellules progénitrices de cellules somatiques a été explorée par plusieurs groupes de 10 à 12, qui contourne le processus fastidieux de la production et la caractérisation iPSC mais toujours dispodes un nombre décent de cellules souches neurales pour différenciation neurale tard. Nous avons précédemment montré que, suite à l'introduction de facteurs de transcription Yamanaka dans des cellules progénitrices hématopoïétiques, les cellules souches neurales peuvent être générés directement en utilisant une cellule neuronale progénitrice 13 Sélection du support. Ici, nous rapportons la méthode en détail.

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Protocole

1. Enrichissement de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang total des adultes

REMARQUE: Les cellules progénitrices hématopoïétiques ou les cellules CD34 + peuvent être purifiés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant de diverses sources, dont le sang de cordon, la matière de cytaphérèse et le sang total en utilisant des procédés à base de centrifugation à gradient de densité. Procédé énumérés ici utilise le sang total, par exemple.

  1. Isolement de PBMC de sang total:
    1. Ajouter 4,5 ml de milieu de séparation de lymphocytes au tube SepMate par aspiration à travers le trou central de l'insert.
    2. Diluer l'échantillon de sang avec un volume égal de DPBS stériles contenant 2% de sérum humain (v / v). Par exemple, diluer 5 ml d'échantillon avec 5 ml de DPBS + 2% de sérum humain.
    3. Ajouter l'échantillon dilué par pipetage vers le bas le côté du tube. Prenez soin de ne pas verser l'échantillon directement dans le trou central.
    4. Centrifuger à 1200 g pendant 10 min à température ambiante.
    5. Retirer délicatement le surnageant au-dessus de la couche PMBC.
    6. Recueillir la couche PBMC (de trouble) dans un nouveau tube.
    7. Ajouter 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco contenant 2% de sérum humain dans le tube et centrifuger à 150 g pendant 10 min à température ambiante avec le frein hors tension.
    8. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 15 ml de DPBS contenant 2% de sérum humain. Comptez le nombre de cellules.
    9. Centrifuger à 690 g pendant 10 min à température ambiante. Retirez tout le surnageant du tube.
    10. Resuspendre les cellules à 1 x 10 7 cellules par ml de milieu 15 (IMDM) de Dulbecco modifié par Iscove contenant 1% d'antibiotique (v / v) et 10% de sérum humain (v / v).
    11. Incuber les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur avant d'isoler des cellules CD34 +.
  2. La sélection positive de cellules CD34 + à partir de PBMC en utilisant CD34 Multisort Kit:
    REMARQUE: travailler vite et d'utiliser des solutions pré-refroidi à rendre les cellules froid et prévenir plafonnementdes anticorps sur la surface cellulaire et marquage des cellules non-spécifique par l'instruction du kit.
    1. Ramassez tous PMBC dans un tube de 50 ml et de compter le nombre de cellules totales dans le milieu.
    2. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min. Retirez tout le surnageant complètement.
    3. Remettre en suspension à 10 8 cellules par 300 pi de tampon de talon (DPBS contenant 0,5% de sérum humain (v / v) et 2 mM EDTA).
    4. Ajouter 100 pi de réactif de blocage FcR et ajouter 100 pi de MultiSortMicroBeads CD34.
    5. Mélangez bien et incuber pendant 30 min au réfrigérateur (2-8 ° C).
    6. Laver les cellules par addition de 2 ml de tampon de talon 10 8 cellules par centrifugation et à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant complètement.
    7. Remettre en suspension à 10 8 cellules dans 500 ul de tampon.
    8. Placer la colonne MACS LS dans le champ magnétique d'un séparateur MACS et préparer colonne par rinçage avec 3 ml de tampon de talon.
    9. Appliquer suspension cellulaire sur le center de la colonne. Cellules non marquées iront à travers lequel peuvent être collectées si l'on préfère.
    10. Laver la colonne trois fois avec 3 ml de tampon de talon.
    11. Retirer la colonne du séparateur et le placer sur un tube de 15 ml.
    12. Ajouter 5 ml de tampon de perles sur la colonne et rincer immédiatement les cellules magnétiquement marquées en poussant le piston dans la colonne.
    13. Ajouter 20 ul de réactif Multisort sortie pour 1 ml de suspension cellulaire. Mélangez bien et incuber pendant 10 min au réfrigérateur (2-8 ° C).
    14. Ajouter 1-2 ml de tampon de talon pour 10 7 cellules et centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant complètement.
    15. Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon de talon pour 10 7 cellules.
    16. Ajouter 30 ul de Multisort arrêt réactif par 10 7 cellules et incuber pendant 15 min au réfrigérateur.
    17. Ajouter 5 ml de tampon de talon et centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant.

2. Dérivation de induite cellules souches neurales à partir de cellules CD34 +

  1. Cellules CD34 + la culture:
    REMARQUE: milieu fraîchement préparée doit être utilisée dans les 7 jours lorsqu'ils sont conservés dans le réfrigérateur. Importante perte de cellules CD34 pourrait être observée après 24 h, mais la prolifération significative des cellules doit être perceptible, surtout après jour 5. Si le nombre de cellules diminue de façon continue ou il n'y a pas la prolifération, il implique soit mauvaise qualité des cellules de moyennes ou CD34 et les cellules ne doit pas être utilisé pour l'étape suivante.
    1. Remettre en suspension et la culture des cellules CD34 + à CD34 maintien milieu (milieu StemSpan SFEM contenant thrombopoïétine humaine (TPO, 100 ng / ml), fms-like tyrosine kinase 3 (Flt-3) ligand (100 ng / ml) et facteur des cellules souches (SCF, 100 ng / ml), interleukine-6 ​​(IL-6, 20 ng / ml) et d'interleukine-7 (IL-7, 20 ng / ml)) dans une plaque à 24 puits (jusqu'à 3 x 10 5 / puits dans 1 ml de milieu par puits) à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    2. After 24 h, de recueillir les cellules flottantes et centrifuger les cellules à 110 xg à température ambiante pour se débarrasser de toutes les cellules attachées et les débris cellulaires. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de CD34 maintenir à moyen et graines fraîches dans une nouvelle plaque de 24 puits (jusqu'à 1 x 10 5 / puits) à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur pour cinq jours supplémentaires.
    3. Remplacer la moitié du milieu tous les deux jours en aspirant soigneusement la partie supérieure du surnageant, tandis que les cellules CD34 + sont flottantes sur le fond des puits (figure 1A).
  2. Virus Sendai transfection:
    1. Au jour 5, recueillir les cellules CD34 et centrifuger les cellules à 170 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant.
    2. Remettre en suspension les cellules dans du milieu frais à 1 x 10 5 / puits dans une plaque à 24 puits dans 1 ml de milieu.
    3. Décongeler un kit de reprogrammation cytotune-iPS Sendai immergeant d'abord par les fonds des tubes dans un bain d'eau à 37 C ° pendant 10 secondes puis dégeler complètement unt RT. Centrifuger brièvement les tubes et les mettre sur la glace. Préparer le mélange de virus de Sendai en mélangeant la quantité recommandée de chaque virus figurant sur le certificat d'analyse (COA) pour le lot correspondant. MOI 15 est recommandé.
    4. Ajouter virus Sendai mélange à chaque puits de cellules CD34. Mélanger les puits en agitant doucement. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    5. Observer l'efficacité de transfection après 24 h. Notez que des agrégats de cellules et la formation de sphère sont des indicateurs pour la transfection avec succès (Figure 1B).
    6. Changer la moitié du milieu par le transfert attentivement la moitié supérieure du milieu à un autre puits. Se il ya des sphères de cellules dans le nouveau puits, ajouter la même quantité de milieu frais.
    7. Changer le milieu tous les jours par l'autre étape 2.2.6 répéter.
  3. Neural induction de cellules souches:
    REMARQUE: Selon les conditions cellulaires, environ 5 ou 7 jours après la transfection, les cellules adhérentes monocouches atteindront 30 -50% de confluence (figure 1C).
    1. Retirer le surnageant contenant des cellules et des sphères flottantes, puis ajouter 1 ml de milieu de progéniteur neural (milieu de Eagle modifié par Dulbecco: mélange nutritif F-12 (DMEM / F12), contient 1x N2 supplément, 0,1% (p / v) de sérum-albumine bovine ( BSA), 1% (v / v) d'antibiotiques, 20 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), et 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF)) dans les cellules adhérentes.
    2. Eventuellement, dissocier les sphères de cellules par pipetage doucement et centrifuger les cellules à 170 xg pendant 10 min. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de progéniteur neural dans une nouvelle plaque à 24 puits revêtue de Matrigel par l'instruction en tant que back up.
    3. Changer le support tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 60 à 80% de confluence, généralement après 1 semaine.
    4. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de cellules neuronales souches de cellules (milieu sans sérum, NSC SFM). Dissocier les cellules en utilisant un grattoir à cellules suiviepar pipetage très doux.
    5. Retirez les cellules et ensemencer tous dans un puits d'une plaque à 6 puits. Ajouter un autre 1 ml de milieu de cellules souches neurales pour faire 2 ml de milieu pour chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    6. Changer le milieu tous les autres jours.
    7. Lorsque les cellules ont atteint 60% de confluence, se dissocier et Réensemencement les cellules au ratio de 1: 3 suivant les étapes 2.3.4 et 2.3.6.
  4. La congélation des cellules souches neurales:
    1. Préparer cellules neuronales souches milieu de congélation par addition de 20% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le milieu de cellules souches neurales. Gardez le milieu de congélation sur la glace.
    2. Dissocier les cellules dans une plaque à 6 puits, à l'aide grattoir à cellules suivie par un léger pipetage. Compter les cellules. Centrifuger les cellules à 170 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant.
    3. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de cellules souches neurales à 1 x 10 6 / ml. Ajouter le même volume de milieu de congélation aux cellules.
    4. Ajouter 1 ml (5 x 10 5 cellules totales) de cellules dans un cryotube. Geler les cellules en utilisant un récipient de congélation M. Froster suivant les instructions.

3. Neural différenciation cellulaire

  1. La différenciation des cellules neuronales:
    1. Lorsque les cellules souches neurales atteignent 80% de confluence, détacher les cellules souches neurales en utilisant une spatule en caoutchouc, puis dissocier par un léger pipetage.
    2. Compter les cellules et ajuster la concentration de 1 x 10 5 / ml dans un milieu de cellules souches neurales.
    3. Pour la différenciation neuronale, la plaque sur les cellules poly-D-lysine / laminine couvercle glisse dans des plaques à 24 puits à 1 x 10 5 / puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    4. Remplacer le milieu par du milieu de différenciation neuronale (DMEM / F12 contenant 1x N2 sus, 1x B27, 300 ng / ml AMPc, 0,2 mM de vitamine C, 10 cerveau ng / ml facteur neurotrophique dérivé (BDNF) et 10 ng / ml dérivé des cellules gliales facteur neurotrophique (GDNF)) after 24 h. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    5. Changer milieu de différenciation neuronale deux fois par semaine pendant 2 semaines.
  2. La différenciation astrogliale:
    1. Dissocier les cellules souches neurales par pipetage.
    2. Compter les cellules et ajuster la concentration de cellules de 5 x 10 4 cellules / ml. Ensemencer les cellules sur des plaques à 24 puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    3. Remplacer le milieu par du DMEM / F12 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    4. Changer le milieu deux fois par semaine pendant deux semaines. Si les cellules atteignent la confluence avant deux semaines, Réensemencement les cellules suivantes étapes 3.2.1 et 3.2.2.
  3. différenciation des oligodendrocytes:
    1. Dissocier les cellules souches neurales par pipetage.
    2. Compter les cellules et des semences 1 x 10 5 cellules sur des plaques à 24 puits revêtues de poly-L-ornithine dans 1 ml de oligodendrocytes differentiSupport d'ation constitué de DMEM / F12 contenant du supplément N2, 10 ng / ml de dérivé des plaquettes facteur-AA de croissance (PDGF-AA), 2 ng / ml de la neurotrophine-3 (NT-3), 2 ng / ml de sonic hedgehog ( Shh), et 3 nM de triiodothyronine (T3). Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    3. Changer le milieu deux fois par semaine pendant deux semaines.
    4. Remplacez le support avec du DMEM / F12 avec supplément 1xN2 et 3 nM de T3 et de la culture des cellules pour une semaine supplémentaire pour la protéine de base myéline (MBP) production.

4. immunofluorescence

  1. Remplacez le support avec 4% de paraformaldehyde (PFA). Incuber pendant 10 min à température ambiante.
  2. Jeter PFA et laver avec du PBS contenant 0,1% de Triton X-100 (PBS-T) 3 fois, 5 min à chaque fois.
  3. Perméabiliser les cellules avec du PBS contenant 0,5% de Triton X-100 pendant 10 min à température ambiante.
  4. Bloquer les cellules avec du PBS-T contenant du sérum de chèvre à 4% pendant 20 min à température ambiante.
  5. Incuber les cellules avec Antibo primaire correspondantematrices dilué dans du PBS-T contenant 0,1% de BSA pendant 2 h à RT ou O / N dans la chambre froide.
  6. Laver les cellules à trois reprises avec du PBS-T, 5 min à chaque fois. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires couplés à un fluorochrome en utilisant une correspondant: 400 dilution dans du PBS-T contenant 0,1% de BSA pendant 1 heure sur un agitateur dans l'obscurité.
  7. Laver les cellules avec du PBS-T contenant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min à température ambiante.
  8. Laver les cellules deux fois avec du PBS-T pendant 5 min chacun à TA.
  9. Respecter les cellules marquées à l'aide d'un microscope et prendre des photos (figure 3).

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Résultats

La qualité des cellules CD34 est critique pour le succès de neurones transduction de cellules souches. Cellules CD34 haute qualité prolifèrent au cours du premier couple de jours de culture et apparaissent comme non adhérente, les cellules homogène rondes, flottant juste au-dessus du fond des récipients de culture (figure 1A). Les résultats de l'infection réussie en agrégats de cellules, qui se étend au fil du temps (figure 1B), tandis que les agrégats de cellules non spécifiq...

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Discussion

Un protocole détaillé pour générer directement des cellules souches neurales à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques périphériques est fourni.

Par rapport à des cellules de fibroblastes, du sang périphérique humain est plus accessible. En utilisant le protocole présenté, plus de 1 x 10 5 cellules progénitrices hématopoïétiques, ou des cellules positives CD34, peuvent être enrichies à partir de 10 ml de sang entier. Bien que la contamination par des plaquettes est génér...

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Déclarations de divulgation

L’étude est financée par des fonds intra-muros des NIH.

Remerciements

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu de séparation des lymphocytesLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 ml
Sérum humainInvitrogen34005-100
AntibiotiquesGibco15240-0621 %
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS colonneMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM mediumStemcell Technologies96501x
IMDMQuality Biologicals112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
IPS Sendai Kit de reprogrammationLife TechnologiesA1378001
Racleur de cellulesSarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
CryoTube flaconsThermo368632
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
supplément N2Life Technologies17502-0481x
albumine sérique bovineSigmaA29340,1 % (p/v)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFPeprotechAF-100-15
B27 supplémentLife Technologies17504-0441x
sérum sans sérum NSC moyenLife TechnologiesA10509011x
lamelles enrobées de poly-D-lysine/laminineBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
Vitamine CSigmaA02780,2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
Poly-L-ornithineSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
PFASigmaP61484 %
PBSQualité Biologique119-069-1011x
sérum de chèvreSigmaG90234 %
TritonX-100SigmaT9284
Souris monoclonale anti-NestinMilliporeAB5922dilution 1:1 000
Anti-SOX2 anticorpsCellules souches appliquéesASA0120Prêt à l’emploi
Souris anti-&bêta ; Anticorps III-tubulinePromegaG712Adilution 1:1 000
Anticorps anti-GFAP de lapinSigmaG4546dilution 1:100
Anticorps anti-O4R& D SystemsMAB1326IgM ; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapinanticorps Life techniologiesA11012dilution 1:400
Alexa Fluor 488 chèvre anti-sourisLife techniologiesA11001dilution 1:400
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgManticorps Life techniologiesA21042dilution 1:250
DAPISigmaD95421 &mu ; g/ml

Références

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Réimpressions et autorisations

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