Article de méthode

Évaluation de l'efficacité des médicaments contre le cancer Sensibilisation

DOI :

10.3791/52388

⸱

6 février 2015

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1Microbiology and Immunology, Western University, 2Biochemistry, Western University, 3Surgery, Western University, 4Oncology, Western University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, la surveillance en temps réel du métabolisme des cellules tumorales, combinée à un modèle in vivo de métastases à membrane chorio-allantoïde (CAM) d’embryon de poulet, est utilisée pour évaluer de nouvelles cibles/agents anticancéreux pour leur capacité à sensibiliser les cellules tumorales aux chimiothérapies endommageant l’ADN.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En raison du niveau élevé de l'hétérogénéité et de mutations inhérentes dans les cancers humains, les thérapies d'agents simples ou les traitements d'association qui ciblent la même voie, sont susceptibles d'échouer. L'accent doit être mis sur l'inhibition des voies qui sont responsables de la résistance intrinsèque et / ou d'adaptation à la thérapie. Un champ actif de l'enquête est le développement et les tests d'inhibiteurs de réparation d'ADN qui favorisent l'action de, et empêchent la résistance à, couramment utilisé chimiothérapie et la radiothérapie. Nous avons utilisé un protocole selon l'invention pour évaluer l'efficacité de l'inhibition de BRCA2 en tant que moyen de sensibiliser les cellules tumorales à la cisplatine préjudiciable de médicaments de l'ADN. le métabolisme des cellules de la tumeur (acidification et la respiration) a été surveillé en temps réel pendant une période de 72 h à délimiter l'efficacité du traitement sur une base minute par minute. En combinaison, nous avons effectué une évaluation de la fréquence métastatique utilisant une membrane chorioallantoïque d'embryon de poulet (CAM) de modèle d'extravasation et l'invasion. Cetteprotocole répond à certaines des faiblesses des couramment utilisés in vitro et in vivo de méthodes pour évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques du cancer. Il peut être utilisé en plus des méthodes communes telles que des tests de prolifération cellulaire, les tests de la mort cellulaire, et les études in vivo de xénogreffes de souris, de discriminer davantage parmi les cibles et agents candidats, et ne choisissez que les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement.

Introduction

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Résistance à la cible et / ou le traitement du cancer cytotoxique est un problème clinique important qui peut conduire à l'échec du traitement, de la rechute acquise, et l'augmentation de la mortalité des patients 1. Compte tenu du degré élevé d'hétérogénéité dans la plupart des tumeurs, ce est une certitude mathématique qu'une tumeur du nombre suffisamment élevé de cellules contient un sous-ensemble de cellules résistantes à des traitements simples ou combinés ciblant les voies moléculaires à laquelle ces cellules dépendent de survie de 2,3. Ces cellules tumorales peuvent être sélectionnées positivement pour pendant le traitement, conduisant à la réapparition de la maladie. Le développement de nouvelles thérapies qui ciblent simultanément différents mécanismes de survie des cellules cancéreuses, soit avant, soit après le choix du traitement à médiation, est donc d'importance clinique.

Un niveau élevé d'instabilité du génome et la mutation dans le génome de la tumeur est une caractéristique fondamentale qui distingue les cellules cancéreuses à partir de cellules hôtes non tumorales 4. Par conséquent, un useful stratégie pour augmenter l'efficacité de la chimiothérapie endommageant l'ADN et d'empêcher le développement de la résistance est active pour inhiber la réparation de l'ADN dans les cellules tumorales 5. Ce est un champ actif de l'enquête et une variété de cibles de réparation d'ADN nouveaux sont à l'étude dans un cadre pré-clinique. Un certain nombre de petites molécules ou des inhibiteurs à base antisens-de ces objectifs ont été élaborés et sont en cours de test 6-8. L'objectif est d'identifier les candidats pré-cliniques les plus prometteurs et d'évaluer la sécurité et l'efficacité dans les essais cliniques.

Le coût élevé des essais cliniques et le risque d'échec (pour une variété de raisons, y compris l'évaluation pré-clinique sous-optimale) sont de formidables obstacles pour progresser dans le développement de nouvelles thérapies neuf. L'utilisation de modèles appropriées et rigoureuses pré-clinique pour évaluer adéquatement nouvelles cibles thérapeutiques et médicaments candidats peut diminuer le taux d'échec élevé de 10 essais cliniques .

Certaines méthodes précliniques couramment utilisés pour évaluer l'efficacité des thérapies anticancéreuses sont les suivantes: a) mesure de la capacité à réduire la prolifération des cellules tumorales in vitro (les essais de prolifération cellulaire), b) la réduction induite par un traitement dans la capacité des cellules tumorales à colonies de culture sous forme de tissu (essais de formation de colonie), c) la réduction induite par un traitement dans des cellules tumorales activité métabolique in vitro (transformation de colorant redox), d) induction induit par le traitement d'vitro la mort dans des cellules tumorales (apoptose, nécrose, autophagique, associé avec la mitose et autres) 11, et e) la réduction in vivo de la croissance ou l'ablation de xénogreffes humaines et de souris induite par un traitement de 12 à 14.

Une faiblesse majeure des méthodes énumérées in vitro, ce est qu'aucun d'entre eux fournissent évaluation en temps réel et en continu de l'effet de thérapies candidats. Plutôt, ils fournissent des informations sélectionnées, seulement à des points de temps largement séparésau cours du traitement. Ces mesures ont diminué la capacité de refléter avec précision l'ampleur et le calendrier des réponses des cellules tumorales. In vivo des modèles de xénogreffes de souris sont également limitées par le coût élevé, la longueur de temps pour terminer, et le risque de dosage et de traitement synchronisation sous-optimale (ordonnancement). En outre, il existe des preuves que les modèles rongeurs de xénogreffes sont des prédicteurs limitées d'efficacité clinique chez l'homme, par rapport à l'évaluation in vitro de réponses des cellules primaires de tumeurs humaines et établies des lignées de cellules tumorales humaines à des interventions thérapeutiques candidats 15,16.

Nous avons conçu un nouveau protocole de combinaison pour évaluer de nouvelles combinaisons de médicaments pré-clinique, d'une manière qui répond aux faiblesses des procédures plus communs énumérés ci-dessus. A la place de la prolifération, la formation de colonies, ou de colorant redox essais de conversion, nous avons utilisé un appareil de mesure du métabolisme d'analyser l'adhérence cellulaire, la respiration, et l'acidification en temps réelau cours de la période de traitement 17. En même temps, nous avons étudié les effets de la combinaison d'un traitement in vivo par l'utilisation d'un embryon de poulet membrane chorio-allantoïde de modèle (CAM) de l'invasion et de métastase 18,19. Nous avons utilisé ces méthodes pour évaluer la capacité d'un oligonucleotide antisens (ASO) ciblage BRCA2 pour potentialiser l'efficacité du cisplatine médicament chimiothérapeutique couramment utilisé.

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Protocole

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REMARQUE: Le protocole suivant a été conçu pour une utilisation avec des cellules adhérentes. Modifications sont nécessaires pour appliquer la méthode à des cellules non-adhérentes cultivées en suspension. Les expériences CAM décrites dans le protocole sont conçus pour une utilisation avec des cellules qui expriment un marqueur fluorescent (par exemple, la GFP, RFP, etc.). Neuf jours embryons de poulet sont tenus le jour 2 du protocole expérimental pour les expériences de CAM.

1. Préparation et transfection de cellules tumorales avec oligonucléotides antisens (OLS)

  1. Aspirer milieu du flacon T75 (s) contenant des cellules d'intérêt, laver avec 1XPBS, et ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% / EDTA. Ajouter 10 ml de milieu de croissance complet à chaque flacon et transférer les cellules dans une solution dans un tube de 50 ml. Compter les cellules et ajuster le volume de sorte que la concentration finale est 1,0x10 5 cellules par ml.
  2. Étiquette deux groupes de flacons T25: un groupe contiendront huit flacons étiquetés, 1-8, et seront used pour l'expérience de mesure du métabolisme en temps réel; et le second groupe contient également huit flacons et sera utilisé pour l'expérience de CAM d'embryon de poulet. Ajouter 2 ml de solution de cellules dans chaque flacon et le placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
  3. Le lendemain matin (jour 0, Temps 0), l'étiquette de trois 5 ml tubes comme suit: le contrôle (non-ciblage ASO ou siRNA), «cible d'intérêt» (ce est à dire, en ciblant ASO ou siRNA) et Lipofectamine 2000 (ou similaire réactif de transfection). Diluer les solutions disponibles ASO à la concentration appropriée du milieu sans sérum dans le tube approprié.
    1. Ajouter la quantité nécessaire de réactif de transfection au tube approprié et incuber dans un milieu exempt de sérum pendant 5 min. Ajouter la solution de réactif de transfection pour les tubes ASO et incuber pendant 20 min.
  4. Ajouter 250 ul de solution de réactif ASO de transfection de commande pour chacun des flacons de 1 à 4 dans chaque groupe, et 250pi de «cible d'intérêt 'ASO solution de réactif de transfection à chacun des flacons 5-8 dans chaque groupe. Incuber pendant 4 heures (37 ᵒC, 5% CO 2).
    1. Pendant l'incubation, effectuer les étapes décrites à la section 2.1. Après l'incubation, ajouter 3 ml de milieu complet à chaque flacon dans le groupe d'essai de CAM et revenir à l'incubateur O / N (37 ᵒC, 5% CO 2). Traiter le groupe de l'expérience du métabolisme selon la description à la section 2.2. Traiter l'expérience de cames selon la description à la section 4.

2. Biocapteur Chip Préparation et ensemencement cellulaire

  1. Dans un environnement stérile, laver soigneusement six puces de biocapteurs avec 400 pi de PBS. Stériliser les puces avec 400 ul d'éthanol à 70% pendant 20 min. Laver trois fois avec 400 ul de PBS.
    1. Placez les puces à l'intérieur de tissus stériles culture plats pour éviter la contamination. Placez trois puces dans un plat étiqueté «contrôle», et trois dans un plat étiqueté «cible d'intérêt '.
  2. Étiqueter deux tubes de 50 ml que «contrôle» et «cible d'intérêt '. Laver les cellules avec du PBS et ajouter un volume approprié de 0,25% de trypsine / EDTA. Attendez jusqu'à ce que les détache de monocouches et de recueillir les cellules dans chaque flacon. Déposer la solution dans le tube approprié.
    1. Compter les cellules et ajuster le volume de sorte que la concentration finale est 6.0x10 5 cellules / ml. Centrifuger les cellules et remettre en suspension si la concentration initiale est trop faible.
  3. Ajouter 250 pi de la solution cellulaire pour chaque puce de biocapteur dans le groupe approprié (pour un total de 1.25x10 5 cellules par puce). Effectuez cette tâche un groupe à la fois pour minimiser le risque de confondre les puces. Placez les plats stériles contenant les puces dans une chambre d'humidité pour éviter l'évaporation, et placer les cha d'humiditémbre dans l'incubateur O / N (37 ᵒC, 5% CO 2).
  4. Le matin suivant (jour 1), aspirer soigneusement le milieu de chaque puce et le remplacer par 250 ul de milieu de croissance supplémenté avec 0,2% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 x pénicilline et de streptomycine (P / S). Incuber pendant 4 heures (37 ᵒC, 5% CO 2).

De préparation du système de mesure et de métabolisme 3. Préparation de la solution

  1. Durant l'incubation, préparer les solutions de médicament requises et le système de mesure du métabolisme pour le dosage à venir.
    NOTE: Le système de mesure du métabolisme contient un total de six modules. Chaque module peut accueillir une puce par expérience.
    1. Subdiviser le dosage dans les groupes expérimentaux suivants: une puce de chacun des «contrôle» et «cible d'intérêt" groupes à recevoir véhicule pendant toute la durée de l'essai; deux puces de chaque groupe pour recevoir le traitement médicamenteux pendant une période de temps définie pendant la uneéssayé, suivie de véhicule au cours de la période de lavage.
    2. Pour les études drogues de sensibilisation, de modifier la longueur, le calendrier, et la concentration de traitement de la toxicomanie pour répondre à la drogue en question.
      NOTE: Pour le cisplatine, les étapes suivantes ont été déterminées empiriquement avec des cellules A549, et peut varier en fonction de la lignée cellulaire. Effectuez toutes les étapes avec le débit par défaut de 4 pi / min.
      6 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S
      24 h de 6 uM cisplatine en milieu + 0,2% de FBS 1x P / S
      24 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S
      18 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S
      4 h de 0,1% de Triton X-
      REMARQUE: Des dérogations à ces étapes, il faudra calcul pour déterminer le volume requis de solutions à moyen et médicaments basés sur le débit souhaité et la durée de l'expérience. Les sections suivantes sont basées sur les étapes décrites ci-dessus.
  2. Étiquette et remplir quatorze tubes de 50 ml avec 50 ml de croissance à moyen + 0,2% de FBS uned 1x P / S. Placez dans une six portoir de tubes du système de mesure du métabolisme, six dans l'autre, et les deux autres dans un troisième porte-tube qui contient également des tubes avec le cisplatine. Sceller les deux premières grilles d'une membrane perméable à l'air pour empêcher l'évaporation.
  3. Préparer une solution de 6 uM de cisplatine (du volume approprié) dans un milieu FBS + 0,2% avec 1 x P / S. Distribuer le volume requis de solution de cisplatine marqués en quatre tubes de 50 ml.
    1. Placer les tubes dans les quatre places restantes dans le rack de tube de mesure troisième métabolisme. Se assurer que les tubes sont placés dans les fentes appropriées qui correspondent aux Biomodules souhaités. Sceller les tubes avec une membrane perméable à l'air.
  4. Préparer et étiqueter six tubes de 50 ml et les remplir avec 20 ml chacune de solution à 0,1% de Triton-X dans le milieu. La solution Triton-X lyser toutes les cellules restantes et de fournir une valeur «zéro» pour chaque puce. Placer les tubes dans un rack tube quatrième unité de mesure du métabolisme et sceller l'esprith une membrane permable de l'air pour éviter l'évaporation excessive.
  5. Chargez les jetons dans les Biomodules et initier l'expérience.

Traitement et de drogues injectables 4. CAM Expérience

REMARQUE: Les étapes et la procédure pour la préparation des embryons de poulet pour une expérience de CAM sont décrits ailleurs 19

  1. Commencer le traitement de la heures après la transfection CAM expérience 48 (Jour 2). Sous-diviser le «contrôle» et «cible d'intérêt" des groupes en deux flacons pour véhicule, et deux pour cisplatine. Aspirer le milieu des flacons et reconstituer avec soit 3 ml de milieu frais, ou 6 uM de cisplatine. Incuber pendant 6 h (37 ᵒC, 5% de CO 2).
  2. Aspirer le milieu, puis lavez et trypsiniser les cellules; recueillir les cellules trypsinisées en solution en quatre correctement étiquetés tubes de 15 ml.
    1. Centrifuger les cellules et laver trois fois avec du PBS. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de PBS uneD compter les cellules.
    2. Ajuster le volume de sorte que la concentration cellulaire finale est 1,0x10 6 cellules / ml. Transférer la solution cellulaire dans étiquetés tubes de 5 ml pour l'injection, et le placer sur la glace. Retourner doucement les tubes avant l'injection afin de se assurer que les cellules sont bien mélangés.
  3. Mettez de côté un total de 24 embryons de poulet (vieilles 9 jours) pour injection (6 par groupe). Effectuer l'injection en utilisant une aiguille de verre fixé à un tube flexible relié à une seringue de 1 ml. La personne effectuant l'injection doit être aveugle au groupe de traitement.
    1. En utilisant un microscope stéréo, injecter 1,0x10 5 cellules dans un volume de 100 ul dans la circulation veineuse de la came. Utilisez, une technique de pulsation lente pour injecter la totalité du volume de cellules. Tamponnez délicatement le site d'injection avec un chiffon doux lingette pour endiguer le flux de sang et d'absorber tout déversement. Étiqueter chaque récipient embryonnaire suivante appropriée chaque injection.
  4. Confirmer la présence et Distrition de cellules fluorescentes dans le système vasculaire de la CAM après l'injection par les visualiser à l'aide d'un microscope à fluorescence. Prenez note de tous les embryons dans lequel le nombre de cellules tumorales semble faible, ou la distribution est médiocre.
  5. Placez les embryons de poulet dans une chambre d'humidité et de les stocker dans un incubateur (37 ° C, 60% d'humidité). Attendre 7-9 jours avant d'énumérer foyers métastatiques.

5. métastatique point Enumeration

  1. Au cours de la période d'incubation de 7-9 jours, surveiller les embryons et jetez les morts. Se assurer que la chambre d'humidité reste humide pendant toute la durée de la période d'incubation.
  2. En utilisant un microscope stéréo fluorescent à grossissement 20X, balayer la totalité de la surface supérieure de la CAM d'embryons dans un motif régulier, analogue à une grille.
  3. Comptez le nombre de foyers métastatiques dans chaque champ de vision, alors comptabiliser le nombre pour un total final par embryon. Cela pour les six embryons dans chaque groupe fournira un nombre o moyennef foyers métastatiques par traitement.

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Résultats

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Résultats et chiffres adaptés avec la permission de travaux publiés 22.

BRCA2 inhibition induit une diminution de la respiration dans les cellules tumorales traitées au cisplatine

Les cellules humaines de cancer du poumon A549 traitées avec BRCA2 ciblage ASO et le cisplatine exposé une baisse anticipée et irréversible dans la respiration, par rapport aux cellules qui ont reçu commande ASO et cisplatine seul; après 24 h de traitement par le cis...

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Discussion

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En raison du coût inhérent et le risque associé à des essais cliniques, il est nécessaire de développer une meilleure et plus rigoureuse méthodologie de test pré-clinique pour évaluer adéquatement les nouveaux schémas thérapeutiques anti-cancéreuses. Techniques couramment utilisées toutes les faiblesses actuelles d'exposition qui peuvent limiter leur capacité de distinguer entre cibles thérapeutiques / agents potentiellement prometteurs, et ceux qui peuvent être moins efficaces. Nous avons élaboré un protocole visan...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été rendu possible par des subventions à JK des Centres d'excellence de l'Ontario et le Fonds de la recherche en Ontario.

Nous tenons à remercier Siddika Pardhan et le Dr Peter Ferguson pour l'assistance technique pendant le tournage.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules A549ATCCCCL-185http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
film AeraSealCarl Roth GmbH
AMEMWisent Bioproducts210-011-QK
Oligodésoxynucléotides antisensAveciaBRCA2 séquence cible : 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 )
Axio Zoom V16 MicroscopeCarl Zeisshttp://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
Bionas BionasBionas GmbH et Micronas GmbHBIS8001D
Bionas Discovery 2500 System  ;Bionas GmbHhttp://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
CisplatineSigma Aldrich479306
Œufs de poule fécondésD’origine locale
Sérum de veau fœtal  ;Gibco - Life Technologies
Lipofectamine 2000  ;Invitrogen - Life Technologies  ;12566014http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html
PBSWisent Bioproducts311-010-CL
Trypsine (0,25 %)/EDTAWisent Bioproducts325-043-CL

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
  2. Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747(2013).
  3. Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78(2013).
  6. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
  7. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
  8. Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
  9. Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
  10. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  11. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
  12. Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
  13. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
  14. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
  15. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
  16. Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
  17. Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714(2011).
  18. Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
  19. Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
  20. Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
  21. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  22. Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).

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Mots-clés

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