Le lymphatiques mésentériques Duct Cannulated Rat Modèle: application à l'évaluation des lymphatique intestinale transport des médicaments

Résumé

Nous décrivons ici une technique de canulation du canal lymphatique mésentérique chez le rat qui permet de quantifier le transport des lipides et des médicaments par le système lymphatique après l’administration intestinale. La technique peut être adaptée pour évaluer les concentrations de lymphe mésentérique et/ou le transport de liquide, de cellules immunitaires, de peptides, de protéines et de molécules lipophiles.

Résumé

Le système lymphatique intestinale joue un rôle clé dans le transport de fluide, l'absorption des lipides et la fonction immunitaire. Lymphatique découle directement de l'intestin grêle par une série de vaisseaux lymphatiques et des ganglions qui convergent au niveau du conduit supérieure lymphatiques mésentériques. Canulation du canal lymphatique mésentérique permet ainsi la collection de lymphe mésentérique se écoulant à partir de l'intestin. Lymphatiques mésentériques se compose d'une fraction cellulaire de cellules immunitaires (lymphocytes 99%), la fraction aqueuse (liquide, des peptides et des protéines telles que les cytokines et les hormones de l'intestin) et la fraction de lipoprotéine (lipides, les molécules lipophiles et Apo-protéines). Le modèle mésentérique canulation conduit lymphatique peut donc être utilisé pour mesurer la concentration et le taux de transport d'un éventail de facteurs de l'intestin via le système lymphatique. Les variations de ces facteurs en réponse à différents problèmes (par exemple, les régimes alimentaires, les antigènes, médicaments) et dans la maladie (par exemple, une maladie intestinale inflammatoire, le VIH, le diabète) peuvent également be déterminée. Une zone d'expansion intérêt est le rôle du transport lymphatique dans l'absorption de médicaments administrés par voie orale lipophiles et précurseurs qui se associent avec les voies d'absorption intestinale des lipides. Nous décrivons ici, en détail, un modèle de rat de canulée conduit lymphatiques mésentériques qui permet d'évaluer le taux et l'étendue de lipides et le transport de la drogue par le système lymphatique pendant plusieurs heures après la livraison intestinale. Le procédé est facilement adaptable à la mesure d'autres paramètres dans la lymphe. Nous fournissons des descriptions détaillées des difficultés qui peuvent être rencontrées lors de l'établissement de cette méthode chirurgicale complexe, ainsi que des données représentatives des expériences ratées et réussies de fournir des instructions sur la façon de confirmer le succès expérimental et interpréter les données obtenues.

Introduction

La lymphe se écoule de l'intestin grêle par un processus unidirectionnel qui provient à lactés simples qui sont contenus dans chaque petit villosités intestinales ^1. Lactés sont relativement perméables aux fluides, des macromolécules et des cellules et la formation de la lymphe ainsi commence avec l'entrée de ces facteurs dans lactés. La lymphe initiale dans les vaisseaux lactés se écoule ensuite à partir de l'intestin par l'intermédiaire d'un réseau de micro-vaisseaux lymphatiques, de collecte (afférente) des vaisseaux lymphatiques, une série de ganglions lymphatiques mésentériques et, finalement, les post-nodal (efférent) vaisseaux lymphatiques. Dans les noeuds lymphatiques passe à travers une série de sinus médullaires où se produit l'échange avec les cellules immunitaires noeud résidentes ainsi que du matériel qui entrent dans le noeud à partir du sang. Tous lymphatique découlant de l'intestin grêle converge finalement dans le conduit efférent mésentérique supérieure lymphatique et par la suite la citerne de Pecquet. La citerne de Pecquet recueille également lymphatique drainant les tissus périphériques caudales, intestInal, régions hépatiques et lombaires et rejoint le canal lymphatique thoracique avec la lymphe du médiastin et des parties du corps crâniens. Le conduit de la lymphe thoracique vide lymphatique directement dans le système veineux à la jonction des veines jugulaires et sous-clavière gauche internes. Le protocole décrit ici, qui permet la collecte de la lymphe directement à partir du conduit lymphatique mésentérique supérieure, facilitant ainsi l'analyse de différents facteurs qui transitent directement de l'intestin à la systémique (général) la circulation par le système lymphatique intestinal.

Les principales fonctions physiologiques affectés au système lymphatique intestinal sont à maintenir l'équilibre de fluide, afin de faciliter l'absorption des lipides et de molécule lipophile, et pour permettre ^une réponses immunitaires appropriées. Les cellules tumorales et les virus se propagent également via les vaisseaux lymphatiques intestinaux ^2-4 et principales modifications se produisent dans les vaisseaux lymphatiques dans plusieurs pathologies inflammatoires et métaboliques ^5-7. Pouvoirnulation du conduit de lymphe mésentérique à recueillir la lymphe dans le mésentère permet une analyse de flux de fluide en vrac via les vaisseaux lymphatiques intestinaux ainsi que la quantification du taux de diverses cellules et des molécules concentration et de transport. Les modifications apportées à la concentration ou de transit de ces facteurs en réponse à divers défis (par exemple, les régimes alimentaires, les antigènes, médicaments) et dans les modèles de la maladie (par exemple, la colite, le VIH, le diabète) peuvent également être évalués. Se il est impossible de décrire longuement chaque composant lymphatique qui peut être analysé et comparé ici, lymphatiques mésentériques consiste simpliste d'une solution aqueuse, lipidique et phases cellulaires. Composants d'intérêt dans la phase aqueuse comprennent des peptides et des protéines telles que des antigènes ou des tolérogènes, ⁸ messagers immunitaires tels que les cytokines et les médiateurs des mastocytes, ⁹ et médiateurs métaboliques telles que les incrétines ^10. La fraction cellulaire de la lymphe mésentérique post-ganglionnaire est presque entièrement (plus de 99%) des lymphocytes ^11. Diverses cellules immunitaires (cellules dendritiques, les mastocytes, etc.) pénètrent dans les vaisseaux lymphatiques mésentériques pré-nodaux, mais restent dans le noeud ^12. Si les cellules au sein de la lymphe afférente sont d'un intérêt, il est possible de recueillir ces cellules par l'intermédiaire de la suppression des nœuds lymphatiques mésentériques plusieurs jours avant la canulation de la veine ¹² lymphatiques mésentériques. De cette manière, les canaux afférents et efférents lymphatiques sont directement reliés, et les cellules lymphatiques de la lymphe afférente passent directement dans le canal lymphatique mésentérique. Le transit et le phénotype de diverses cellules immunitaires passant par les vaisseaux lymphatiques intestinaux peuvent ainsi être examinés. Peut-être la raison la plus fréquemment invoquée pour recueillir lymphatiques mésentériques à ce jour, cependant, est d'étudier le traitement intestinale, l'absorption et le transport des lipides alimentaires et des molécules lipophiles ^10.

Après l'ingestion, les lipides alimentaires sont digérés (par exemple, à partir de triglycérides en acides gras et les monoglycérides, phospholipid aux acides et lysophospholipide gras et cholestérol ester d'acide gras et de cholestérol, etc.) et dispersées dans la lumière intestinale en petites micelles et structures vésiculaires par l'addition d'agents amphiphiles de la bile (phospholipides, des sels de cholestérol et biliaires) et l'action de enzymes pancréatiques ^10,13. De là, ils sont absorbés dans les entérocytes. Une partie des composants absorbés sont ré-estérifiés pour former des triglycérides, des phospholipides et des esters de cholestérol dans les cellules absorbantes (entérocytes). Ces ré-estérifiés lipides sont assemblés à partir d'une combinaison de manière exogène ingérée composants lipidiques et les composants lipidiques endogènes de la bile sécrétée, piscines lipidiques muqueuses ou l'approvisionnement en sang ¹³ intestinal. De là, les lipides sont soit estérifiés stockés dans les entérocytes ou assemblés en lipoprotéines intestinaux (chylomicrons, les lipoprotéines de très faible densité (VLDL)) avec diverses apoprotéines et d'autres molécules lipophiles ( par exemple, vitamines) ^10,13. Après avoir quitté les entérocytes, les lipoprotéines sont spécifiquement transportés depuis l'intestin vers la circulation systémique par l'intermédiaire du système lymphatique mésentérique que les vaisseaux lactés intestinaux sont plus perméables à leur entrée de capillaires sanguins intestinaux. Une partie des composants lipidiques absorbées sont également transportés à partir de l'intestin dans la circulation systémique par l'intermédiaire des capillaires sanguins et la veine porte comme unique, non-lipoprotéines associées, des molécules ^14. En général, cependant, la voie de transport de la veine portale est seulement un rôle important dans l'absorption des lipides court et moyen terme de longueur de chaîne.

La collection de lymphe mésentérique permet ainsi l'évaluation du transport des lipoprotéines et des composants associés (lipides, des molécules lipophiles, les apo-protéines) à partir de l'intestin. Les lipoprotéines peuvent être quantifiés et caractérisé avec l'avantage que les lipoprotéines lymphatiques mésentériques, en général, sont dans une nascent Etat car ils ne ont pas été largement modifié par les enzymes systémiques tels que la lipoprotéine lipase ^15. Bien que le modèle de rat canulée lymphatique mésentérique a peut-être été historiquement les plus largement décrit pour l'analyse du transport des lipides / lipoprotéines à partir de l'intestin, une zone d'expansion intérêt est le rôle des vaisseaux lymphatiques dans le transport des médicaments lipophiles, les promédicaments et d'autres xénobiotiques ^13,16 qui est la mise au point du modèle décrit ici. Médicaments lipophiles (généralement ceux dont log P> 5 et la solubilité dans longue chaîne triglycérides> 50 mg / g bien que des exceptions sont apparents) ^17,18, prodrogues ¹⁹ et d'autres xénobiotiques ^13,16 peuvent accéder aux vaisseaux lymphatiques intestinaux passivement ou par intégrer activement dans lipoprotéines intestinale voies de transport ^19.

La lymphe mésentérique technique de cathétérisme de rat a donc de nombreuses applications. Bollman et al. Décrit d'abord un technique à Cathétériser le conduit lymphatiques mésentériques chez les rats en 1948 ^20. Depuis lors, un certain nombre de variations sur le modèle ont été décrits. Par exemple, la collecte peut se produire lorsque le rat est anesthésié avec différents anesthésiques ^21,22, ou à l'état conscient tout en retenu ¹⁵ ou se déplacer librement ^23,24. Les rats peuvent être administrés par différentes solutions de réhydratation et d'autres substances telles que des lipides et des formulations de médicaments à des taux différents dans l'estomac, l'intestin ou parenterale (en général de 0 à 5 ml / h) ^25. Dans certaines études, la lymphe canal thoracique plutôt que canal lymphatique mésentérique est canulée pour estimer le transport de l'intestin par l'intermédiaire des vaisseaux lymphatiques, bien que cela peut surestimer transit dans l'intestin grêle, en fonction du facteur d'intérêt, comme le conduit de la lymphe thoracique reçoit également la lymphe des autres ^22,26 régions. Des modèles de canulation lymphatiques ont également été décrits dans plusieurs autres espèces, y compris les souris, ^15,27 mini-pigs ^{12, 28,29} moutons, les cochons et les chiens ^{30 31.} Cependant, le modèle de rat est le plus largement et uniformément citée. Des protocoles détaillés pour canulation du canal lymphatiques mésentériques suivie par collection de la lymphe dans conscient ²⁵ ou ²² anesthésié les rats et les souris ^15,27 ont déjà été publiés et le lecteur intéressé est dirigé à ces protocoles. Ce protocole est la première à démontrer la technique dans un format visualisée.

Le modèle de rat lymphatique canule a des avantages sur les modèles animaux plus grands en termes de dépenses, la facilité de la chirurgie et des considérations éthiques. Par rapport au modèle de la souris, la chirurgie de canulation lymphatique mésentérique est également plus facile chez le rat, bien que le modèle de la souris permet des études plus détaillées de ²⁷ animaux transgéniques. Néanmoins, il existe certaines limites du modèle de rat, en particulier ceux qui sont associés à des différences dans la physiologie, cette limite extrapolatà d'autres situations d'ions pré-cliniques et cliniques. Par exemple, dans le flux de bile de rat est constant et indépendant de la prise alimentaire tandis que dans l'alimentation ultérieure des espèces ou des lipides de stimuler l'écoulement de bile ^32. Cela crée des défis à l'obtention d'environnements pré et post-prandiale représentatifs chez le rat qui reflètent ce que l'on voit dans les grandes espèces et les humains. Pour les études d'administration de médicament, les espèces plus grandes peuvent également être préférées lorsque l'évaluation du transport lymphatique après l'administration de la dose humaine ²⁵ forme réaliste. Dans une étude récente, les taux de transport des lipides dans la lymphe mésentérique ont été jugées comparables entre les espèces (souris, rat, chien) après l'administration d'une masse équivalente et le type de lipides qui fournit une certaine confiance dans l'extrapolation des données de transport des lipides à travers les espèces ^27. Toutefois, le transport d'un modèle lipophile drogue, halofantrine, classées dans l'ordre de la taille de l'animal (ce est à dire, chien> rat> souris). Un facteur d'échelle peut donc être nécessaire pour extrapolate données lymphatiques de transport de la drogue de rat à d'autres espèces.

Une limitation de la lymphe modèles de canulation, en général, est que la collecte de la lymphe passif directement à partir d'un canal lymphatique peut modifier la circulation lymphatique et le transport depuis les vaisseaux lymphatiques travailler contre un gradient de pression qui est modifié une fois que le récipient est pourvue d'une canule ^33. Le modèle de la lymphe cathétérisme peut aussi être difficile à établir dans les laboratoires qui ne sont pas familiers avec la technique. D'autres modèles ont ainsi été décrits. Par exemple, le transport de facteurs via le système lymphatique intestinal, telles que les lipoprotéines et des molécules lipophiles, a été étudié indirectement via la collecte du sang. Un tel modèle consiste à comparer les concentrations sanguines de lipides et / ou après l'administration orale de médicaments en présence et en l'absence d'inhibiteurs (par exemple, la colchicine, Pluronic L81, cycloheximide) de production de lipoprotéine qui bloquent le transport intestinal ³⁴ lymphatique. Un avantagedes modèles qui quantifient transport lymphatique indirectement via la collecte d'échantillons de sang, ce est qu'il permet une certaine évaluation du transport lymphatique chez l'homme que la chirurgie invasive ne est pas nécessaire ^35. Toutefois, les inhibiteurs de transport lymphatique ne sont pas spécifiques et les facteurs qui sont transportés via les vaisseaux lymphatiques sont dilués et modifiées dans la circulation systémique qui complique ces évaluations. Alternatives in vitro ont également été décrites. Par exemple, les cultures cellulaire Caco-2 ou entérocytes isolés ont été utilisés pour étudier plus en détail la sécrétion intestinale des molécules qui entrent dans les vaisseaux lymphatiques ^36-38. Un modèle avancé in vitro qui est plus représentatif du microenvironnement intestinal humain a également été récemment décrit ^39. Dans ce modèle d'une couche de cellules endothéliales lymphatique est co-cultivées avec des cellules Caco-2 qui permet une analyse plus détaillée du transfert de substances de l'intestin dans les lymphatiques. Toutefois, dans vitro systèmes cellulaires manquent flux d'échange et de transmission, à savoir l'interconnexion avec une lumière intestinale et le sang sous-jacente et la vascularisation lymphatique. Dans une autre approche, Kassis et al. A établi un double canal (champ lumineux vidéo à grande vitesse et la fluorescence) système d'imagerie in situ qui permet des comparaisons quantitatives entre la contraction des vaisseaux, la circulation lymphatique et les concentrations de lipides fluorescents dans les vaisseaux lymphatiques mésentériques ³³ dans. Un avantage de ce modèle au cours de ce qui précède dans des systèmes in vitro est qu'elle permet un suivi précis du passage de cellules immunitaires à travers les vaisseaux lymphatiques. Les mesures absolues de lipides masse (ou médicament) transports sont, cependant, pas encore établis en utilisant des méthodes d'imagerie. In vitro et in silico approches de prédire précisément la mesure du transport lipophile de drogue via les vaisseaux lymphatiques intestinaux ont également été publiés ^40-42. Par exemple, l'affinité ex vivo de plusieurs compounds pour chylomicrons plasmatiques a été trouvé pour corréler raisonnablement bien avec leur transport lymphatique in vivo ^41. Par la suite, le même groupe a établi un modèle en silico pour prédire l'affinité du médicament pour les chylomicrons sur la base de plusieurs propriétés physico-chimiques ^40. Holm et al. A également établi un relativement complexe modèle in silico pour prédire d'emblée transport lymphatique de composés lipophiles sur la base de ⁴² descripteurs moléculaires. Ces modèles peuvent fournir une approche utile pour prédire l'ampleur du transport lymphatique des drogues inconnues. Validation des modèles avec un large éventail de médicaments et entre les différents laboratoires sera toutefois être nécessaire pour confirmer leur précision et la reproductibilité.

Canulation du canal de lymphatiques mésentériques reste donc le seul moyen d'examiner directement le contenu de drainage lymphatique de l'intestin grêle et le taux de l'ensemble complexe de facteurs (cellules, protéines de transit,peptides, des lipides, des médicaments) dans la lymphe dans une situation in vivo. Ici, nous décrivons un protocole pour la canulation de la lymphe et conduit carotide artère mésentérique qui permet la collecte de sang et de lymphe mésentérique systémique de rats anesthésiés. Les données représentatives démontrent comment le modèle peut être utilisé pour examiner lipidique et le transport de la drogue de l'intestin via le système lymphatique mésentérique. Elle est suivie par une discussion des difficultés qui peuvent être rencontrées pour établir le modèle et un guide de dépannage. Une fois établi le modèle est un outil puissant pour étudier le transport lymphatique intestinal.

Protocole

Les études décrites dans ce manuscrit ont été approuvés par le comité d'éthique local et animales ont été menées en conformité avec le Conseil australien et néo-zélandais pour le soin des animaux dans les lignes directrices de recherche et d'enseignement. Avant de commencer toute procédure animale, se assurer que l'autorisation appropriée est obtenue par l'institution / organisation locale. Comme avec toutes les chirurgies d'animaux, se assurer que l'opération est effectuée par des opérateurs dûment formés, dans des conditions aseptiques et que les anesthésiques, des analgésiques et des antibiotiques sont administrés en cas de besoin pour assurer un résultat éthique et réussie.

1. Préparatifs de la veille de l'intervention chirurgicale

1. Jeûner le rat la nuit avant la chirurgie si nécessaire. Assurer le rat a libre accès à l'eau.
2. Préparer les solutions devant être administrées chez le rat.
   1. Préparer une solution de réhydratation tel qu'une solution saline stérile ou une solution de Ringer.
   2. Préparer unsolutions esthétiques au besoin. L'anesthésique utilisé dans les expériences décrites ici est composée de "cocktail 1" préparé en combinant 1,9 ml de kétamine à 100 mg / ml, 0,5 ml de xylazine 100 mg / ml, 0,2 ml d'acépromazine 10 mg / ml et 2,5 ml de solution saline et " Cocktail 2 "constitué par 1 ml de kétamine 100 mg / ml et 0,1 ml acépromazine 10 mg / ml. REMARQUE: inhalation d'isoflurane ou de sévoflurane peut être préféré, car il peut fournir un plan chirurgical de l'anesthésie pendant une période de temps plus longue.
   3. Éventuellement préparer une formulation contenant le médicament, par exemple, une émulsion lipidique. Effectuer des études de stabilité appropriées pour assurer la stabilité de la formulation au cours de la période de stockage et l'administration.
      REMARQUE: La nature exacte de la formulation et de médicament à administrer variera en fonction de chaque étude, le but des études de transport de médicament lymphatiques est le plus souvent d'évaluer l'efficacité du transport lymphatique de médicaments en fonction de la formulation et de drogues adminiSTERED.
      1. La formulation utilisée dans les expériences représentatives de la Figure 4 et 5 ici est préparé, comme décrit précédemment ^43. En bref, incorporer l'acide oléique C ¹⁴ (5.2 uCi) et l'halofantrine (200 ug) dans 40 mg d'acide oléique avant la dispersion dans 5,6 ml d'une phase aqueuse consistant en le taurocholate de sodium à 5 mM dans du tampon phosphate salin (pH 6,9).
      2. Pour les formulations contenant du 2-mono-oléine, ajouter 7,1 mg de 2-mono-oléine avec d'autres composants, à la phase aqueuse en même temps que l'halofantrine de phase contenant l'acide oléique. Préparer les formulations contenant du 2-mono-oléine immédiatement avant l'administration chez le rat que le 2-mono-oléine est relativement instable et isomérise au 1-mono-oléine.
      3. Émulsifier la suite, les formulations par traitement aux ultrasons pendant 2 minutes à température ambiante.
         NOTE: Comme cela a été décrit précédemment ^43, surveiller la stabilité des formulations par i) une inspection visuelle de la emulSion sous lumière polarisée pour se assurer que l'émulsion ne est pas une séparation de phase, ii) l'analyse de la taille des particules immédiatement après la préparation et à la suite de dosage utilisant la diffusion dynamique de la lumière pour fournir une indication des changements et / ou la séparation de phase, et iii) l'analyse des concentrations de l'halofantrine en utilisant un dosage par HPLC validée.
3. Préparer la solution anti-coagulant contenant 10 mg / ml d'EDTA dans de l'eau stérile ou 10 UI / ml d'héparine dans une solution saline pour rincer la canule lymphatique. Aussi préparer solution anti-coagulant contenant de 2,5 à 10 UI / ml d'héparine dans une solution saline pour rincer la canule de l'artère carotide.
4. Préparer les canules de polyethylene pour l'insertion dans le canal lymphatique mésentérique (0,8 mm de diamètre extérieur, 0,5 mm de DI), l'artère carotide (0,96 mm de diamètre extérieur, 0,58 mm de diamètre intérieur 0,8 mm de diamètre extérieur, 0,5 mm de diamètre intérieur) et du duodénum (0,96 mm de diamètre extérieur, 0,58 mm de diamètre )
   1. Couper les canules à la longueur souhaitée (typiquement 25 à 30 cm de l'artère carotide et la canule duodénale et de 10 à 15 cm pour le Cann lymphatiqueula) et placer un biseau à l'extrémité des canules en utilisant une lame chirurgicale stérile (voir la figure 1).
      NOTE: Cela augmente la facilité d'insertion de la canule et réduit l'incidence de la canule blocage post-insertion.
   2. Placez un point d'ancrage J de forme dans la canule intraduodénale en bouclant une petite partie de la canule sur lui-même, le chauffant avec une plaque briquet ou chaude, puis couper à la taille (voir la figure 1).
5. Fixer la canule de lymphe à une aiguille de 25 G et une seringue contenant une solution anticoagulante (préparé à l'étape 1.3). Remplir la canule lymphatique avec la solution anticoagulante et laisser la solution dans la canule O / N pour réduire l'incidence de la formation de caillot dans la canule lymphatique lors de la collecte de la lymphe.
6. Préparer des tubes de collecte de la lymphe et l'échantillon de sang. Pré-peser les tubes de prélèvement de la lymphe, tubes d'étiquettes pour la collecte de la lymphe et échantillon de sang et ajouter la solution anti-coagulant. Ajouter solut anti-coagulant suffisanteion pour atteindre une concentration finale de 1 mg / ml d'EDTA dans de l'eau stérile ou 10-20 UI / ml d'héparine dans le sang ou la lymphe collectée.

2. Préparation immédiatement avant de commencer l'intervention chirurgicale

1. Vérifier tous les canules en rinçant avec une solution saline stérile ou une solution anti-coagulante pour se assurer qu'ils sont brevet.
2. Préparer le rat pour l'intervention chirurgicale.
   REMARQUE: Le conduit lymphatiques mésentériques est plus visible chez les rats qui ont mangé ou ont été administrés une dose d'huile que la lymphe mésentérique devient laiteuse et opaque avec une plus grande lipides chargement. Certains opérateurs, en particulier ceux qui sont nouveaux à la chirurgie, donc il est plus facile à cathétériser le canal lymphatiques mésentériques lorsque les rats sont pré-dosés avec une huile (environ 0,1 à 1 ml) comme d'olive ou l'huile de soja 0,5 à 2 h avant la chirurgie à compter . Cependant, l'huile de pré-dosage affecte le transport lymphatique des lipides, des médicaments lipophiles et d'autres facteurs dans la lymphe de telle sorte qu'il peut ne pas être optimal pour une pré-dose huileen fonction du but de l'expérience.
   1. Anesthésier le rat tout au long de la période de collecte chirurgie et l'échantillon.
      1. Par exemple, engager l'anesthésie par injection sous-cutanée de 1,5 ml / kg de Cocktail I (de l'étape 1.2.2) dans un pli de la peau à l'arrière du cou de rats en utilisant une seringue de 1 ml attaché à une aiguille 25 G. Maintenir l'anesthésie par injection intraperitoneale de 0,44 ml / kg de cocktail 2 (de l'étape 1.2.2) environ toutes les heures si nécessaire, en utilisant une seringue de 1 ml fixée à une aiguille G 25.
      2. Avant de commencer l'opération en sorte que la profondeur de l'anesthésie est suffisante en observant la fréquence respiratoire, le mouvement des moustaches, du tonus musculaire et de réponses à des stimuli tels que le pincement du pied. Administrer une anesthésie supplémentaires au besoin.
   2. Raser les poils des régions chirurgicales, qui comprennent le côté droit de l'abdomen de la lymphe et canulation du duodénum, ​​et le col et la région de la clavicule gauche pour canule de l'artère carotidetion.
   3. Nettoyez les régions chirurgicales aseptique en utilisant une solution ou solution de chlorhexidine povidine-iode et un gommage d'éthanol à 70%. Répétez cette opération 3 fois pour chaque région, la finition avec un nettoyage final avec 70% d'éthanol.
3. Placez l'animal en décubitus dorsal sur une feuille blanche dessus d'un coussin chirurgicale chauffée (37 ° C).

3. Le cathétérisme de l'lymphatiques mésentériques Duct

1. Placez l'animal avec son côté droit tourné vers l'opérateur. Effectuer la chirurgie avec ou sans l'aide d'un microscope chirurgical selon les besoins.
2. Ouvrez la couche supérieure de la paroi musculaire abdominale avec un straight 4 incision cm se étendant de la ligne médiane (appendice xiphoïde) pour le flanc droit environ 2 cm en dessous de la cage thoracique (marge costale) à l'aide d'un scalpel stérile (voir la figure 2B).
3. Ouvrir les couches restantes de la paroi musculaire abdominale 4-5 mm de la ligne médiane latérale vers la droite avec une petite pairede ciseaux chirurgicaux (voir la figure 2B).
4. Rentrer l'intestin grêle sous la paroi abdominale gauche musculaire et le maintenir en place en utilisant 2-3 morceaux de gaze stérile saturés avec une solution saline normale.
5. Combler le rat sur une seringue en plastique de 10 ml placé horizontalement sous le dos du rat au niveau du rein droit pour faciliter la visualisation du conduit lymphatiques mésentériques.
6. Localisez le mésentérique supérieure lymphatique conduit: un navire d'environ 0,5 à 1 mm de diamètre qui est perpendiculaire au rein droit et immédiatement rostrale et parallèle à l'artère mésentérique (un sombre vaisseau sanguin rouge pulsatoire; voir la figure 2C).
   REMARQUE: Chez les rats non à jeun ou d'huile pré-dosé le récipient est blanc, opaque et plus facile à visualiser que chez les rats à jeun dans lesquelles il est très translucide.
7. Inspecter la zone immédiatement caudale à la grande gaine lymphatique mésentérique supérieure et l'artère mésentérique à déterminer si un deuxième, plus petit canal lymphatique accessoireprésente. Le cas échéant, bloquer le flux de la lymphe à travers le canal de séparation et le conduit d'occlusion avec de la colle ou liant un fil de suture autour du conduit, afin de se assurer que la totalité du volume de la lymphe circulant à partir de l'intestin est recueilli à partir du conduit supérieur lymphatique mésentérique.
8. Passer une paire de pinces droites à travers le lit de graisse péri-rénale au bord inférieur du rein droit, et à travers les couches de tissu conjonctif immédiatement en dessous de la veine cave, dans une direction parallèle avec le conduit supérieur lymphatique mésentérique.
9. Utilisation de la pointe de la pince se emparer de la canule de la lymphe et le tirer à travers le lit de graisse péri-rénale avec une extrémité à proximité immédiate du conduit de lymphe mésentérique et l'autre extériorisée de l'animal au niveau du rein droit.
10. Isoler le conduit lymphatiques mésentériques de couches superposées de tissu conjonctif et la graisse par dissection. Prenez soin de ne pas percer ou endommager le conduit lymphatique.
11. Après avoir isolé le conduit lymphatique, faire une petite hole dans le conduit lymphatique soit avec des micro-ciseaux, la pointe acérée d'une pince de bijoutier ou une aiguille 25 G. Prenez soin de ne pas couper complètement le navire.
12. Se assurer que la canule lymphatique est complètement rempli de solution anti-coagulante (en utilisant une seringue et une aiguille 25 G) sans espace d'air. Insérer la canule lymphatique environ 2 - 4 mm à l'intérieur du conduit de la lymphe mésentérique par le petit trou à l'aide d'une petite pince.
13. Observez la canule lymphatique pour un couple de minutes. Observer un écoulement graduel de la lymphe intestinale de l'extrémité de collecte de droits de la canule si la canule est réussie. Si la ponction ne est pas réussie, répétez les étapes 3.8 à 3.12.
14. Si la canule est réussie, fixez la canule en plaçant une petite goutte de colle vétérinaire sur le trou d'entrée dans le canal de la lymphe. Prenez soin de ne pas obstruer le vaisseau par l'application de l'adhésif en excès vétérinaire.
15. Dans l'attente de l'adhésif vétérinaire pour définir, observe le flux de la lymphe pendant plusieurs minutes pour assurer que la procédure d'insertion de canule a réussi. Une fois certain de la réussite de l'insertion de canule, enlever les morceaux de gaze qui ont été placés dans la cavité abdominale avec soin et placer l'intestin grêle dans sa position initiale.
16. Placer un tube collecteur lymphatique contenant des anticorps anti-coagulant (voir étape 1.6) à l'extrémité de la canule pour collecter la lymphe se écoulant librement.
17. Ensuite, cathétériser le duodénum pour perfusion de solutions et / ou des formulations réhydratation.

4. Canulation du duodénum

1. Attacher le duodénum canule à une seringue (par exemple, 10 ml) rempli avec la solution de réhydratation.
2. Identifier le duodénum que le rose vif (avec plus de vaisseaux sanguins) section de l'intestin grêle, qui, après la baisse légère tirant révèle l'estomac.
3. Faites un petit trou de perforation dans le duodénum environ 2 cm en dessous de la jonction de l'estomac et du duodénum (le pylore) à l'aideune aiguille 23 G stérile.
4. Insérez l'extrémité recourbée en forme de J de la canule duodénale à travers le trou de perforation. Fixez en place avec une goutte de colle cyanoacrylate.
5. Commencer hydratation du rat par la fixation de la canule de la seringue de réhydratation chargé dans une pompe à perfusion. Selon la littérature taux de réhydratation varient de 0,5 à 3 ml / h ^15,25.
6. Après l'achèvement de la lymphe et canulation duodénum, ​​fermer l'incision dans la paroi musculaire abdominale avec des sutures. Puis fermer l'incision de la peau en appliquant quelques gouttes de colle tissulaire (cyanoacrylate) le long du côté de l'incision de la peau et le pincement des deux côtés de l'incision ensemble.

5. Le cathétérisme de l'artère carotide

La canulation de l'artère carotide peut être effectuée avant ou après la canulation de la veine lymphatique mésentérique. Certains opérateurs préfèrent cathétériser l'artère carotide avant canulation du canal lymphatique afin de réduire podéloger tiellement la canule lymphatiques lors du déplacement de l'animal.

1. Placez une marque sur la canule de l'artère carotide 2,5 cm de la pointe conique pour identifier la partie du tube à insérer dans l'artère. Connectez l'autre extrémité de la canule (ie, sans chanfrein) à une aiguille 23 ou 25 G attachée à une seringue remplie de solution anti-coagulant et remplir la canule avec la solution anti-coagulant en se assurant qu'aucun des espaces d'air sont présents.
2. Pour faciliter la canulation, placez le rat anesthésié en décubitus dorsal avec le cou tendu et la tête tournée vers l'opérateur. Notez que certains opérateurs préfèrent effectuer cette technique avec la queue du rat en direction de l'opérateur.
3. Placer un 1 - incision longitudinale de 1,5 cm à travers la couche de peau au-dessus de la gauche de la trachée dans le plan sagittal.
4. Disséquer le tissu conjonctif sous-cutané en utilisant une pince à embout arrondi de sous-jacents pour exposer les muscles du cou appariés.
5. Rétracter les muscles du cou to révéler l'artère carotide gauche (situé ~ 1 cm en dessous de la surface de la peau et pulsation). Nettoyez le tissu conjonctif recouvrant de l'artère par dissection.
6. Isoler une section ~ 1 cm de l'artère soigneusement à l'aide des pinces de tissus émoussés, en prenant soin de ne pas endommager la piste adjacente du nerf vagal. Effectuez cette en ouvrant et fermant la pince à embout arrondi verticalement le long de chaque côté de l'artère pour la libérer du tissu environnant et nerf vague.
7. Utilisation pince fine pointe de, enfiler deux sutures de soie sous l'artère carotide et placez-les à chaque extrémité de la section de l'artère isolée. Nouez la suture plus proche de l'opérateur et la plus éloignée de coeur et la clavicule (figure 3A le) du rat.
8. Occlure le flux sanguin dans l'artère en plaçant une paire de droites fines pinces d'extrémité en dessous de l'artère (figure 3B).
9. En utilisant les ciseaux fins pointe de l'iris, placez une petite incision sur la surface supérieure de l'artère (environ 1/3 de lachemin vers le bas à partir du haut de la zone isolée). Rincer toute sang répandu sur la surface de l'artère avec une solution saline héparinisée et essuyez doucement à l'aide des conseils de coton.
10. Insérez l'extrémité de la canule dans l'artère avec une paire de pinces à pointe recourbée. Une fois inséré, retirer la pince à pointe fine droites d'occlusion du flux sanguin et de faire avancer la canule 2,5 cm dans l'artère à l'aide de deux paires de pinces, une pour tenir la canule à l'intérieur de l'artère à arrêter le sang de se écouler en arrière et l'autre pour insérer la canule.
11. Utiliser une petite pince à artère pour maintenir la canule à l'intérieur de l'artère et enlever la pince à pointe fine droites qui ont été placés au-dessous de l'artère à l'étape 5.8 pour occlure le flux sanguin.
12. Confirmez la perméabilité de la canule en injectant une solution anti-coagulant dans la canule et en reculant une petite quantité de sang (figure 3C). Ensuite, rincez la canule avec une solution anticoagulante et sceller la fin en utilisant la flamme d'un briquet ou d'un bouchon de canule.
13. Attachez ee canule en place avec les deux sutures placées sous l'artère à l'étape 5.8.
14. Retirer le collier de l'artère et de sécuriser tiers suture autour de l'artère et la canule. Fermez le cou enroulé avec des sutures.

Période 6. post-opératoire et la formulation Infusion

1. Continuer à maintenir le rat sous anesthésie et sur le coussin chauffant.
2. Réhydrater le rat par perfusion de solution de réhydratation dans le duodénum pendant au moins 0,5 heure après l'achèvement des canules. Observez la diminution du taux de circulation de la lymphe (~ 0,1 à 0,5 ml / h) pendant la période initiale suivant cathétérisme et bientôt augmenter à une ligne de base constante (0,4 à 2,5 ml / h en fonction du taux de réhydratation).
3. Après la période de récupération, infuser la formulation d'intérêt (contenant des lipides, des médicaments, etc.) dans le duodénum via la canule. Eventuellement, utiliser une pompe à perfusion pour réguler le débit de la formulation de flux. NOTE: Dans le protocole décrit ici les animaux restent ANAESthetised pendant toute la durée de la chirurgie et de la collecte et de la lymphe sont euthanasiés sous anesthésie tel que l'analgésie supplémentaire ne est nécessaire. Si le protocole est modifié et les animaux sont permis de reprendre conscience alors analgésie appropriée et les soins post-opératoires seront nécessaires.
4. A la fin de la perfusion de formulation continuer à réhydrater le rat à raison de 1,5 à 3 ml / h avec une solution saline normale dans le duodénum pour éviter la déshydratation.
5. Continuer à garder le rat sur le pavé chirurgicale chauffée 37 ° C pour maintenir la température (comme pour l'étape 2.3), l'urine expresse de la vessie via douce poussée vers le bas sur le bas de l'abdomen, au besoin et réappliquer pommade ophtalmique toutes les heures (selon l'étape 2.2. 3). Réguliers changements de position du corps sont recommandés si l'animal est de reprendre conscience après la procédure.

7. Collection de la lymphe et des échantillons sanguins pour évaluer lipides et l'absorption du médicament

1. Recueillir lymphatique en continu dansdes tubes contenant de l'anti-coagulant. Changer tubes à des intervalles de temps nécessaires (par exemple, toutes les heures).
2. Prélever des échantillons de sang à des moments de jeu.
   1. Occlure le flux sanguin à travers la canule en pliant la canule arrière d'environ 2 cm de l'extrémité scellée. Desceller la canule en coupant l'extrémité scellée ou de retirer la fiche de la canule.
   2. Utilisation d'une seringue vide, retirer solution saline héparinisée de la canule jusqu'au sang remplit toute la canule.
   3. En utilisant une nouvelle seringue vide, retirer le volume souhaité de sang et placer dans un tube contenant anti-coagulant.
   4. Utilisation de la première seringue, remplacer le sang prélevé avant l'échantillonnage pour réduire la perte de sang inutile. Avant l'injection, faites glisser la seringue tout en le maintenant en position verticale afin d'assurer qu'aucune bulle d'air pénètrent dans la canule.
   5. En utilisant une seringue, remplacer le volume de sang retiré du rat avec une solution anti-coagulant. Assurez-vous que pas de sang résiduelle est visible dans la canule que tout reste peut coaguleret de bloquer la canule.
   6. Bend la canule environ 2 cm de l'extrémité non scellée pour bloquer le flux sanguin et retirer la seringue. Utiliser la flamme d'un briquet ou d'un bouchon de canule, reboucher la canule.
3. A la fin de la collecte de sang et la lymphe du rat, le rat euthanasie par administration intraperitoneale de> 100 mg / kg de pentobarbitone de sodium.
4. Déterminer la vitesse d'écoulement de lymphe par mesure de la masse de la lymphe collectée pendant chaque période de temps.
5. Mesurer la concentration de médicament et de lipide dans le sang et la lymphe utilisant, par exemple, HPLC, HPLC-MS ou en utilisant des kits commerciaux, des lipides et d'évaluer l'absorption du médicament efficacité.
6. Calculer le transport de masse des médicaments et des lipides dans la lymphe du produit des concentrations et le volume de la lymphe mesurées recueillies.

Résultats

Les résultats d'une expérience représentative pour quantifier la mesure cumulative et le taux de lipide et le transport du médicament à travers le système lymphatique après l'accouchement intestinal en utilisant le modèle lymphe de canulation mésentérique sont représentés sur la figure 4 et la figure 5. Dans cette expérience, 200 pg du modèle lipophile médicament halofantrine a été administré dans le duodénum de rat en 2 heures dans une formulation contenant 40 mg d'acide ol...

Discussion

Le modèle rat lymphatiques mésentériques de cathétérisme permet une quantification directe de la concentration et de taux de transport de diverses cellules et molécules (comme les lipides et les médicaments) de l'intestin dans la lymphe et les modifications apportées à ceux-ci qui se produisent en réponse à contester de diverses substances (régime alimentaire , antigènes, des médicaments, des formulations, etc.) et les maladies ^10,27 (cancer, les virus, la colite, la résistance à l'insuline, ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline stérile	Baxter healthcare	AHB 1307	Toutes les marques peuvent être utilisées. Exemple : Baxter 100 ml sacs salins, boîte de 50
à 70 % d’éthanol dans l’eau	N’importe quelle marque peut		être utilisée
Solution de gluconate de chlorhexidine (Microshield 4)	Livingstone International	JJ60243L N’importe	quelle marque peut être utilisée. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L
Solution de bétadine	Livingstone International	BU0510	N’importe quelle marque peut être utilisée. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510
Ilium Ketamil (Kétamine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA  ;	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium xylazil (xylazine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA  ;	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acépromazine 10 mg/ml)	PROVET VICTORIA  ;	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Pentobarbital sodique	PROVET VICTORIA  ;	24529	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est Lethabarb® ; 325 mg/ml de pentobarbital de sodium, Virbac Santé Animale. http://www.provet.com.au
Héparine (35000I.U. dans 35 mL)	Sigma Pharmaceuticals	337220	http://sigmaco.com.au/
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) sel disodique dihydraté	Sigma-Aldrich	E1644	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est le sel disodique d’EDTA de Sigma.
Canule en polyéthylène (PE) d.e. 0,96 mm x d.i. 0,58 mm	Rallonges de microtubes	PE8050	N’importe quelle marque peut être utilisée. Exemple : Tube PE 0,96 x 0,58 mm, 30 m
Canule en polyéthylène (PE) diamètre extérieur 0,8 mm x diamètre intérieur 0,5 mm	Extensions de microtubes	PE9658	N’importe quelle marque peut être utilisée. Exemple : tube PE 0,8 x0,5 mm, 30 m
Règle	N’importe quelle marque peut		être utilisée
Marqueurs	N’importe quelle marque peut		être utilisée
Briquet	N’importe quelle marque N’importe quelle		marque peut être utilisée
Adhésif vétérinaire	N’importe quelle	marque peut être utilisée
calibre 23	Livingstone International	DN23GX0.75LV	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est l’aiguille jetable Livingstone, stérile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6& search=DN23GX0.75LV
Aiguilles de calibre 25	Livingstone International	DN25GX1.0LV	Toutes les marques peuvent être utilisées. L’exemple ici est l’aiguille jetable Livingstone, stérile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV
Seringue 1 ml	Livingstone International	T3SS01TA N’importe	quelle marque peut être utilisée. Exemple : seringue Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/boîte. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search = T3SS01TA
seringue de 10 ml	Livingstone International	T3SS10SA N’importe	quelle marque peut être utilisée. Exemple, ici : seringue Terumo 10 ml Slip 100/boîte. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Tampons de gaze	Livingstone International	GSC075 N’importe	quelle marque peut être utilisée et coupée à la taille requise. L’exemple ici est des cotons-tiges remplis de coton 7,5 x 7,5 cm, 8 plis. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Cotons-tiges	Livingstone International	CTAST075DP	Toutes les marques peuvent être utilisées. L’exemple ici est l’applicateur en plastique Livingstone à double pointe. 75MM. 100/PQT. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP
Coussin chauffant	Ratek	WT1	Toute marque qui maintient la température à 37C peut être utilisée. L’exemple ici est le plateau chauffant Ratek.
Lampe chirurgicale	Harvard Apparatus	72-0215 avec 72-0267 N’importe	quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est l’appareil Harvard V-Lux 1000 Source de lumière froide avec guide de lumière à col de cygne bifurqué, noir, diamètre de fibre de 4,7 mm (chaque bras). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail et  ; http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___
Microscope chirurgical	Zeiss	495005-0014-000	N’importe quelle marque peut être utilisée. C’est le cas du stéréomicroscope Zeiss Stemi 2000-C avec support S, double spot et KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Suture en soie	Livingstone International	DTSK163019F4 N’importe	quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est   ; 3/8 cercle coupe inversée suture en soie 3/0 fil 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Lames de scalpel	Fine Science Tools (FST)	10020-00	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est la lame de scalpel FST #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Manche de scalpel	Fine Science Tools (FST)	10004-13	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est le manche de scalpel FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Petits ciseaux chirurgicaux	Fine Science Tools (FST)	14060-09	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est les ciseaux fins FST, 9 cm avec tranchant de 21 mm, tranchants, droits. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Pince à pointe incurvée dentelée	Fine Science Tools (FST)	11001-13	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est une pince à motif standard FST 13 cm avec pointe incurvée de 2,8 x 1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x ciseaux d’iridectomie	Fine Science Tools (FST)	15000-08	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est des ciseaux à ressort FST Vannas - Tranchant de 2,5 mm, droits. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16  ;
1 x pince à pointe dentelée droite	Outils de science fine (FST)	11650-10	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple est le FST Graefe 10 cm droit avec une pointe dentelée de 1 x 0,99 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x pince à pointe fine, lisse, tranchante, droite	Fine Science Tools (FST)	11251-10	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est la pince FST Dumont #5 droite 11cm avec pointe de 0,08 x 0,04mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Pince avec pince lisse et incurvée	Fine Science Tools (FST)	11063-07	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est la pince délicate FST 9 cm avec pointe lisse de 0,4 x 0,3 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats	Fine Science Tools (FST)	13010-12	N’importe quelle marque peut être utilisée. Tous les opérateurs n’utilisent pas les hémostatiques. L’exemple est le micro-moustique hémostatique FST de 12 cm avec 20 mm de longueur x 1,3 mm de largeur, dentelé, à pointe droite. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x porte-aiguille de suture	Fine Science Tools (FST)	12001-13	N’importe quelle marque peut être utilisée. Par exemple, il s’agit d’un porte-aiguille Hasley FST de 13 cm avec une pointe de 16 mm de longueur x 1,9 mm de largeur. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x pince artérielle	Fine Science Tools (FST)	18050-28	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est le FST Bulldog Serrefines droit, 28 mm de long, 9x1,6 mm de dimension de mâchoire avec une presse à pince moyenne. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Acide oléique	Sigma Aldrich	O1008	Si nécessaire, n’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est l’acide oléique pur à 99 %. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU
d’acide 14C-oléique	Perkin  ;	NEC317050UC	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est l’acide oléique, [1-14C]-, 50µ ; Ci (1,85 Moq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Taurocholate de sodium	Sigma Aldrich	T4009	N’importe quelle marque peut être utilisée. L’exemple ici est l’acide taurocholique sodium sel hydrater &ge ; 95 % (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU
Halofantrine	Glaxo Smith Kline		Halofantrine a été aimablement offert en cadeau par Glaxo Smith Kline
Phosphate de sodium monobasique	Sigma Aldrich	71507	N’importe quelle marque peut être utilisée. C’est le cas, par exemple, du phosphate monobasique monohydraté de sodium, BioXtra, pour la biologie moléculaire >99,5 %. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU
Phosphate de sodium dibasique	Sigma Aldrich	71643	N’importe quelle marque peut être utilisée. C’est le cas, par exemple, du phosphate de sodium dibasique dihydraté, BioUltra, pour la biologie moléculaire, >99 %. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU