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Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l'activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

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DOI :

10.3791/52419

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28 novembre 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un test colorimétrique simple et quantitatif qui mesure spécifiquement l’activité protéolytique de Granzyme B (GzmB) chez l’homme, la souris ou le rat. Ce protocole peut être facilement adapté pour déterminer l’activité protéase d’autres protéases à sérine granulaire par hydrolyse d’autres substrats peptidiques synthétiques avec une séquence de reconnaissance appropriée.

Résumé

La protéase sérine Granzyme B (GzmB) médie l’apoptose des cellules cibles lorsqu’elle est libérée par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ou les cellules tueuses naturelles (NK). GzmB est le granzyme le plus étudié chez l’homme et la souris et, par conséquent, les chercheurs ont besoin d’outils spécifiques et fiables pour étudier sa fonction et son rôle dans la physiopathologie. Cela nécessite en particulier des tests qui ne reconnaissent pas les protéases telles que les caspases ou d’autres granzymes qui sont structurellement ou fonctionnellement liées. Ici, nous appliquons la préférence de GzmB pour le clivage après des résidus d’acide aspartique dans un dosage colorimétrique utilisant le peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB est la seule protéase à sérine de mammifère capable de cliver ce substrat. Le substrat est clivé avec une efficacité similaire par le GzmB de l’homme, de la souris et du rat, une propriété qui n’est pas partagée par d’autres substrats peptidiques disponibles dans le commerce, même ceux qui sont annoncés comme étant adaptés à cet effet. Ce protocole est démontré à l’aide de lysats non fractionnés de cellules NK activées ou CTL et convient également aux protéases recombinantes générées dans une variété de systèmes procaryotes et eucaryotes, à condition que les contrôles appropriés soient utilisés. Ce test est une méthode très spécifique pour déterminer l’activité pro-apoptotique potentielle des molécules cytotoxiques dans les lymphocytes de mammifères, et de leurs homologues recombinants exprimée par diverses méthodologies.

Introduction

Granzymes sont une famille de sérine-protéases présentes dans les lysosomes sécrétoires de cellules tueuses naturelles (cellules NK) et de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) 1. Cinq granzymes différentes existent chez l'homme (A, B, H, K et M), et dix chez les souris (A - G, K, M et N) 2,3. Granzyme A et granzyme B (GZMA, GZMB) sont les plus abondants et ont été largement étudiées dans le contexte humain et de rongeur.

La fonction classique de GZMB est l'induction de l'apoptose dans des cellules cibles exécutées en conjonction avec la perforine protéine formant des pores, ce qui permet d'accéder à la granzyme cytosol de la cellule cible 4. Bien que l'expression GZMB est sans équivoque trouvée dans les lymphocytes cytotoxiques, des études récentes se sont penchés sur une variété d'autres types de cellules GZMB exprimant, y compris, mais sans s'y limiter, les kératinocytes 5, basophiles 6, les mastocytes 7, les cellules dendritiques plasmacytoïdes 8, et les cellules B 9, 10.Dans ce contexte, les fonctions de GZMB non apoptotiques ont été révélés allant de participation dans les processus inflammatoires, le remodelage des tissus et d'autres propriétés immunorégulatrices 11-14.

Étant donné qu'un rôle biologique plus large a été proposé pour GZMB qu'on ne le pensait, les chercheurs ont besoin d'outils fiables et spécifiques pour sa détection. L'avantage est de GZMB exigence spécifique pour cliver du côté carboxylique de résidus acide aspartique, une propriété unique parmi les serine proteases eucaryotes 15. Souris, humaines et GZMB de rat sont structurellement très similaires, mais la spécificité de substrat étendu de GZMB de souris diffère légèrement de celle de fois humaine et de rat 16, ce qui signifie que certains substrats génériques avec Asp à la borne (P1) peuvent être clivées efficacement par GZMB des trois espèces, alors que d'autres substrats avec des séquences plus complexes amont de P1 peuvent donner des résultats très variables. Dans le passé et li plus récenteterature, ce fait a causé de la confusion et une mauvaise interprétation de la signification biologique de certains résultats expérimentaux considérables, même si soigneusement contrôlée, des études cinétiques ont cherché à corriger la situation 17.

Dans cet article, nous avons cherché à illustrer ces points en utilisant deux substrats disponibles dans le commerce, à savoir Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl et N-acétyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide. Les deux réactifs faire générer différents groupes réactifs après le clivage (un sulfhydryle libre par rapport à un paranitroanilide gratuitement fluorescent), mais cela n'a aucun effet sur le clivage protéolytique. Le protocole décrit est une adaptation moderne d'un protocole très vieux 18, mais devrait aider les enquêteurs à utiliser les différents substrats de GZMB appropriée, tout en fournissant un cadre méthodologique pour détecter l'activité d'autres granzymes, comme GZMA et GzmH.

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Protocole

NOTE: Les rates ont été dérivées de souris (6-10 semaines d'âge) et toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices en matière d'éthique des animaux du Centre Peter MacCallum Cancer (E486).

1. Préparation des échantillons.

  1. Préparation de cellules NK activées souris.
    1. Isoler les cellules NK naïfs primaires à partir de suspensions unicellulaires des rates de souris C57BL / 6 ou B6.GrzmB - / - (GZMB gène null) souris par sélection négative en utilisant des kits disponibles dans le commerce.
    2. Suivez le protocole des fabricants. Brièvement, les cellules magnétiquement étiqueter "non-NK» tels que les cellules T et B, des cellules dendritiques, des granulocytes, des macrophages et des cellules rouges du sang en utilisant des anticorps conjugués à la biotine par rapport à leurs marqueurs de surface spécifiques. Utilisez séparation magnétique avec des perles anti-biotine à épuiser les cellules "non-NK».
    3. Culture isolée des cellules NK pendant 5-7 jours dans un milieu contenant IL-2 (1000 U / ml) à 700 000 cellules / ml dans des plaques à 24 puitsà 37   ° C.
    4. En variante, l'utilisation de 19 cellules T activées, l'antigène CTL primaire restreint OT1 de récepteur de cellule T de souris transgéniques 20, CTL générés dans des cultures mixtes de lymphocytes 21 ou de surnageants de cellules NK activées pour déterminer l'activité de GZMB 19 sécrétée.
  2. Maintien de lignée humaine de cellules NK et l'isolement des cellules NK primaires.
    1. Maintenir la leucémie humaine NK (cellules YT) dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. En variante, les cellules NK purifier primaires à partir du sang périphérique de sujets sains et de stimuler pendant 2-3 jours dans un milieu contenant IL-2 à 100 U / ml comme décrit précédemment 22.
  3. Génération de lysats cellulaires.
    1. Laver les cellules trois fois dans du PBS (pH 7,4), puis à suspendre Nonidet P-40 tampon de lyse (0,1% de NP-40, 250 mM de NaCl, 25 mM de Hepes, 2,5 mM d'EDTA). Idéalement, lyser un minimum de 5 x 10 6 cellules NK, ou 1 x 10 7 cellules T dans un tampon de 100 pi. Ne pas ajouter des inhibiteurs de protease, comme beaucoup sont des inhibiteurs irréversibles des protéases à sérine, et en particulier tels que les tryptases GZMA. Incuber sur de la glace pendant 20 min, puis sédimenter les noyaux dans une microcentrifugeuse à 15 000 xg pendant 10 min. Jeter le culot nucléaire et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  4. Déterminer la concentration en protéines des lysats.
    1. Utiliser un protocole de choix disponibles dans le commerce tels que, Bradford ou l'acide bicinchoninique (BCA) et déterminer la concentration en protéines. Assurez-vous que la concentration est ~ 2 mg / ml minimum. lysats de conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire (activité de granzyme est stable pendant plusieurs mois à -20 ° C).

2. Granzyme B Dosage de l'activité

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer un mM 10 des substrats (Boc-AAD-S-Bzl ou Ac-IEPD-PNA) dans le DMSO (~ 5 mg / ml) et stocker à -20 & #176; C. Préparer une dilution de travail fraîchement et jeter après chaque jour, que Boc-AAD-S-Bzl hydrolyse partiellement sur le stockage dans le DMSO.
    2. Préparer un mM 250 du réactif colorimétrique (5,5'-dithio-bis (acide 2-nitrobenzoïque), DTNB) dans le DMSO (0,09 g / ml) et conserver à -20 ° C. Préparer une dilution de travail frais chaque jour. Ce réactif ne est nécessaire que pour les substrats avec des groupes d'indicateurs SBzl, pas ANP.
    3. Maquillage tampon frais (0,1 M HEPES, 0,05 M de MgCl2, pH 7,3) tous les 2-3 semaines.
  2. Amener DTNB et des substrats synthétiques à température ambiante. Diluer substrats (01:16, par exemple 100 pi de 1,6 ml de tampon) et DTNB (1: 250, par exemple 10 ul dans 2,5 ml de tampon) et bien mélanger.
  3. Diluer au moins 100 pg de protéine de lysat de chaque échantillon dans un tampon à un volume final de 160 ul. En utilisant une pipette multicanaux ajouter 50 pi par puits en trois exemplaires (~ 33,3 ug / puits) dans un '' U '' vinyl fond de plaque de 96 puits.Inclure un «tampon seulement» commande (également en trois exemplaires).
  4. Ajouter 100 pi de DTNB diluée au contrôle des échantillons / tampon (omettre cette étape lorsque vous travaillez avec Ac-IEPD-pNA.
    NOTE: Le clivage de Ac-IEPD-pNA par GZMB libère directement fluorogène pNA (figure 4B).
  5. Utilisez une pipette multicanaux pour ajouter rapidement 50 pi de substrats dilué à chaque ensemble de trois exemplaires, en commençant avec le tampon, puis tous les contrôles négatifs et de finition avec des échantillons positifs attendus.
  6. Placer la plaque dans le lecteur de plaque. Mesurer l'activité Asp-ase par hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA dans un lecteur de microplaques à une DO de 405 nm. Utilisez un protocole de dosage cinétique, prendre 25 mesures, toutes les 15 secondes (environ 6 min temps de lecture total).
  7. Utilisez les lectures d'absorbance générés à chaque point de temps pour calculer manuellement le taux de clivage du substrat si le logiciel du lecteur de plaques ne peut pas générer une valeur pour Vmax.

3. Analyse de Data

REMARQUE: Les données générées est présenté comme vitesse maximale, définis comme changement de DO au fil du temps (MOD / min).

  1. Pour analyser les données, déterminer le taux maximal de clivage du substrat, qui est calculée à partir du taux de changement d'absorbance. Pour ce faire automatiquement en utilisant le logiciel de lecteur de plaque, qui a généralement cette option.
  2. Alternativement après avoir vu les parcelles cinétiques de changement d'absorbance, qui sont générées pendant l'essai cinétique sur le lecteur de plaque, sélectionner manuellement les points de données qui donnent la ligne droite plus raide. Pour la plupart des essais, le taux maximum est atteint dans les 2 premières minutes de l'essai.
  3. Soustraire la valeur de DO initiale de la lecture la plus élevée de OD sur cette ligne droite et diviser par l'intervalle de temps. Transfert des données brutes vers Microsoft Excel / Graph Pad pour l'analyse statistique et l'affichage graphique.

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Résultats

Le substrat Boc-AAD-S-Bzl est spécifique pour GZMB

Le GZMB sérine-protéase est un constituant majeur des lymphocytes cytotoxiques (cellules CTL et NK) et est principalement responsable de l'induction de la mort apoptotique rapide dans les cellules cibles, telles que des cellules infectées par des virus ou transformée. Ce est en grande partie en raison de sa préférence de substrat pour le clivage après certains résidus aspartate spécifiques en protéines sélectionnées, un ...

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Discussion

Historiquement, les granzymes ont été identifiées en tant que molécules effectrices clés de lymphocytes cytotoxiques (cellules CTL et NK) capables d'induire une mort par apoptose rapide dans les cellules cibles. Ce est principalement due à l'action de GZMB, qui clivé molécules de substrat cibles au aspartate (D) résidus et a pu activer la cascade des caspases par les deux clivage pro-caspases, ainsi que plusieurs de leurs cibles en aval ainsi. Cependant, il est maintenant reconnu que les GZMB expression ne est p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a reçu le soutien de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) par le biais de la subvention HA 6136/1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche). JAT est soutenu par des subventions de programme et de projet du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Substrat de Granzyme B (souris et humain)
Ac-IEPD-pNA  ;SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Substrat Granzyme B (uniquement humain)
N-α ;-CBZ-L-lysine-S-BzlSigma-AldrichC3647Substrat Granzyme A
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Substrat Granzyme H
5,5'-dithio-bis(acide 2-nitrobenzoïque)  ;Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman' s Réactif
Kit d’isolement de cellules NK II sourisMiltenyi Biotec GmbH130-096-892Kit de sélection négative
Kit d’isolement de cellules NK humainMiltenyi Biotec GmbH130-092-657Kit de sélection négative
Lecteur de plaquesBiorad iMarkBiorad Microplate Manager Version du logiciel MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyle 96 puitsCorning, MA, USA2797

Références

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