Préparation de Suspensions de cellules uniques pour l'analyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris

Résumé

La peau abrite un réseau complexe de cellules immunitaires. Nous décrivons une méthodologie efficace pour la digestion de la peau de souris, à partir de différentes parties du corps de l’animal, afin d’obtenir une suspension unicellulaire et d’analyser les différentes populations de leucocytes résidant dans la peau par cytométrie en flux.

Résumé

La peau est un organe barrière qui interagit avec l’environnement extérieur. Exposés en permanence à une invasion microbienne potentielle, le derme et l’épiderme abritent une variété de cellules immunitaires dans des conditions homéostatiques et inflammatoires. Les outils permettant d’obtenir la libération de cellules cutanées pour les analyses cytofluorimétriques sont donc très utiles afin d’étudier le réseau complexe de cellules immunitaires résidant dans la peau et leur réponse aux stimuli microbiens. Ici, nous décrivons une méthodologie efficace pour la digestion de la peau de souris afin d’obtenir rapidement et efficacement des suspensions unicellulaires. Ce protocole permet de maintenir une viabilité cellulaire maximale sans compromettre l’expression de l’antigène de surface. Nous décrivons également comment prélever et digérer des échantillons de peau à différents endroits anatomiques, tels que l’oreille, le tronc, la queue et le coussinet. Les suspensions obtenues sont ensuite colorées et analysées par cytométrie en flux afin de discriminer les différentes populations de leucocytes.

Introduction

La peau est l’un des plus grands organes du corps et sa grande surface est continuellement exposée à l’environnement extérieur. Par conséquent, la peau doit protéger l’organisme des menaces potentielles afin de maintenir l’homéostasie, à la fois par des moyens physiques et en fournissant une protection active contre l’entrée potentielle d’agents pathogènes. De la même manière que la muqueuse intestinale et pulmonaire, la peau abrite une variété de cellules immunitaires qui interagissent continuellement avec l’épithélium afin de maintenir la surveillance immunitaire. Ce système complexe qui implique à la fois des cellules immunitaires et non immunitaires de la peau est reconnu depuis les premiers jours de l’immunologie, lorsqu’en 1978, le terme « tissu lymphoïde associé à la peau » (SALT) ¹ a été inventé pour décrire une telle complexité.

Le grand nombre de cellules immunitaires résidant dans la peau aide l’organisme non seulement à combattre les invasions potentielles, mais aussi à orchestrer la cicatrisation des plaies et à maintenir la tolérance envers les auto-antigènes et le microbiote cutané ^2,3.

Parmi les cellules immunitaires résidentes de la peau, les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle crucial dans la formation des réponses immunitaires et le maintien de l’homéostasie ⁴. Les cellules DC dermiques et les cellules de Langerhans réagissent facilement aux invasions d’agents pathogènes et, lors de la migration vers les ganglions lymphatiques, activent les cellules T et induisent l’expression des récepteurs récepteurs de guidage de la peau sur les cellules T effectrices nouvellement générées ⁵. Les DC ont également un rôle fondamental dans la régulation de l’homéostasie cutanée. Les DC migrant du derme vers les ganglions lymphatiques dans des conditions homéostatiques transportent les antigènes cutanés séquestrés dans le but d’induire la tolérance des lymphocytes T, principalement par la différenciation des lymphocytes T régulateurs (Tregs) spécifiques des antigènes ^{cutanés 6-8}.

T les cellules représentent la population la plus abondante de cellules immunitaires dans la peau. Non seulement ils s’infiltrent dans la peau lors d’une infection, mais ils représentent également une population stable parmi les lymphocytes résidents de la peau ^9,10. Les lymphocytes T CD8⁺ et CD4⁺ à mémoire résidente (rm) résident dans la peau et, à la suite d’une infection, peuvent réagir bien avant que les lymphocytes T effecteurs ne soient recrutés dans le sang. Dans la peau, réside également une population de Tregs résidents dans les tissus capables de maintenir une tolérance envers les antigènes cutanés et l’homéostasie tissulaire. Ces cellules sont rapidement et puissamment activées après une exposition à leur antigène apparenté et ont donc été définies comme des Tregs mémoires ^11,12.

Outre les DC et les lymphocytes T, de nombreuses cellules immunitaires innées, telles que les cellules NK, les lymphocytes T gamma delta, les ILC ¹³ du groupe 2, les mastocytes et les macrophages, peuplent la peau et contribuent à la protection de l’hôte. Pour analyser un environnement aussi complexe, il est obligatoire d’obtenir des suspensions unicellulaires à partir d’échantillons de peau avec une grande efficacité tout en préservant l’expression de marqueurs de surface pour l’analyse ou le tri cytofluorimétrique en flux.

La peau murine présente une couche épidermique externe, constituée principalement de kératinocytes, de cellules de Langerhans et de lymphocytes T épidermiques dendritiques, et la couche dermique située en dessous. Le derme abrite la plupart des cellules immunitaires et est constitué d’une matrice extracellulaire dans laquelle les fibres de collagène sont les plus abondantes, en particulier le collagène-I et le collagène-IV. Contrairement à la peau humaine, la peau de souris est recouverte de fourrure et donc plus peuplée de follicules pileux. Il est également beaucoup plus mince que la peau humaine et contient une couche musculaire, le pannicule carnosus, qui aide à la cicatrisation des plaies ¹⁴. Ces caractéristiques rendent plus difficile de perturber efficacement le réseau de collagène du derme afin d’évacuer les cellules immunitaires.

Dans cet article, nous proposons une méthode appropriée pour digérer la matrice extracellulaire qui repose sur un cocktail de collagénases 1 et 2 de haute pureté et de thermolysine. De plus, étant donné que l’analyse de la peau de différentes régions nécessite différentes procédures expérimentales, nous montrerons différentes méthodes pour obtenir efficacement des échantillons de peau du coussinet plantaire, de la queue, de l’oreille et du tronc. Nous étiqueterons ensuite les échantillons afin d’évaluer la présence de cellules T DC (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺), de macrophages (CD11b⁺/F4/80⁺CD45⁺), de cellules T CD8⁺ et CD4⁺.

Protocole

l'approbation de l'étude: Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le ministère italien de la santé (Rome, Italie) selon le décret législatif 27 gennaio 1992, n. 116 "della Direttiva de attuazione n. 86/609 / CEE en materia di protezione degli animali utilizzati un fini Sperimentali o ad altri fini Scientifici."

1. Obtenir des échantillons de peau

1. Euthanize la souris par dislocation cervicale.
2. Oreille:
   1. Découpez la partie glabre des oreilles de souris.
   2. dorsale séparée et face ventrale en les tirant avec une pince. Retirez tous les cartilages restants en grattant doucement la partie intérieure des oreilles avec une pince.
3. Trunk peau:
   1. Raser l'ensemble de la peau de l'animal à la fois avec un rasoir électrique et avec une lotion dépilatoire délicate.
   2. Couper l'échantillon de peau désirée (de 2 cm ² à l'ensemble de la peau des animaux).
      1. Si coupant l'ensemble dorsale et êmela peau de la souris trale, faire une coupe verticale au milieu de la souris en arrière et puis couper le long des frontières des zones rasées autour du corps de la souris.
      2. Séparez délicatement la peau du péritoine et les muscles du dos, en gardant l'échantillon de peau encore avec la pince tout en séparant l'échantillon de peau avec les pointes à bords arrondis fermés de ciseaux chirurgicaux ou un scalpel.
   3. Préparer une plaque de culture cellulaire de 100 mm contenant 10 ml de PBS glacé.
   4. Éliminer la graisse sous-cutanée en immergeant l'échantillon de peau dans du PBS dans la plaque préparée à l'étape 1.3.3 et racler l'échantillon de peau avec des pinces.
4. Queue:
   1. Couper la queue de la souris.
   2. Faire une coupe verticale sur la queue avec des ciseaux chirurgicaux ou d'un scalpel chirurgical, à partir de la base de la queue et atteignant à la pointe de la queue.
   3. Utilisez une pince pour détacher la peau de la queue. Prenez le bord de la coupe à la base de la queue et tirez doucement vers la pointe tout en maintenant lale corps de la queue avec une pince.
   4. Retirez tout excès de graisse en grattant doucement l'échantillon de peau.
5. bandit
   1. Découpez le pied de la souris entière avec des ciseaux chirurgicaux. Éviter couper toute peau velue.
   2. Couper la peau du pied longitudinal de la cheville au début des chiffres.
   3. Tenir les os de la cheville avec une pince ou à la main tout en saisissant la peau avec une pince et tirer la peau vers les chiffres comme si le décollage d'un gant.

2. Digestion

1. Préparer le cocktail de digestion de la solution mère (préparée comme dans la liste des matériaux) avec la recette suivante: Enzyme mix (voir la liste des matériaux pour les spécifications) 300 pg / ml, DNAse1 50 U / ml. Diluer dans RPMI 5% de FBS.
2. Hacher les échantillons de peau avec des ciseaux en petits morceaux dans un plat de 35 mm de Pétri avec 2 ml de cocktail Digestion (Pour la peau du tronc: 2 ml de cocktail de Digestion tous les 2 cm ² de peau, jusqu'à 3 ml au total).
3. Incuber à 37 ° C pendant 90 min. Secouer doucement la boîte de Pétri 1-2 fois pendant l'incubation.
4. Verser les échantillons digérés de la peau sur un tamis de 70 um cellulaire dans 66 mm plat de Pétri contenant 1 ml de RPMI1640 5% de FBS.
5. Laver le filtre avec 5 ml de RPMI 1640 5% de FBS.
6. Presser l'échantillon à travers le tamis cellulaire, avec un piston de seringue.
7. plongeur Flush, boîte de Pétri et la crépine avec 20 ml de RPMI1640 5% de FBS, transférer dans 50 ml tube.

3. Anticorps et étiquetage

1. Laver la suspension obtenue deux fois avec 5 ml de PBS 1% de SFB (ou BSA).
2. L'étiquette de la suspension cellulaire obtenue avec les anticorps désirés.
   1. Remettre en suspension les échantillons dans 100 ul / échantillon d'un mélange contenant 2 pg / ml d'aCD16 / CD32 (clone 2.4G2) dilué dans du PBS 1% de FBS.
   2. Incuber pendant 15 min à 4 ° C afin de bloquer la liaison non spécifique des anticorps désirés par l'intermédiaire des récepteurs Fc.
   3. Ajouter les anticorps indiqués dans le Tableau1.
      1. Préparer un mélange en diluant les anticorps souhaités dans 100 ul / échantillon de PBS 1% de FBS à une concentration de 4 pg / ml.
      2. Ajouter 100 ul du mélange préparé à l'étape 3.2.3.1 à chaque échantillon de telle sorte que dans le tube, il y aura un volume de 200 ul d'anticorps mélange à une concentration finale de 2 pg / ml.
   4. Incuber pendant 30 min à 4 ° C et couvrir de la lumière.
3. Laver avec 1 ml de PBS 1% de FBS, centrifuger pendant 5 min à 400 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 300 pi de PBS 1% de FBS.
4. Ajouter DAPI à une concentration finale de 2 pg / ml et on incube à 4 ° C, à l'abri de la lumière pendant 10 min.
5. Analyser les échantillons obtenus par FACS.
   1. Afin d'isoler les leucocytes, utilisez la stratégie de déclenchement suivant:
      1. Tout d'abord éliminer les cellules mortes par gating sur la population de DAPI-.
      2. Sélectionnez singulets dans le FSC-A vs. FSC W parcelle tel qu'indiqué dans la Figure 1 .
      3. Porte les cellules en fonction de la taille et de la granularité typique des leucocytes d'intérêt.
      4. Sélectionnez CD45 + cellules dans le FSC Une parcelle de CD45 comme indiqué sur la figure 1.
   2. La distinction entre les différentes populations de leucocytes par l'expression de marqueurs de surface comme suit:
      1. Identifier les PED comme CD11c ⁺ cellules MHC II ^+. Ceux-ci peuvent être analysés plus tard pour l'expression de CD207 pour distinguer les cellules de Langerhans et CD207 + Dermal DC de CD207- Dermal PED.
      2. Identifier Macrophages que / 80 + cellules CD64 + F4.
      3. Identifier les cellules B que les cellules CD19 + CMHII +.
      4. Identifier les cellules T CD8 + ou les cellules CD4 +.

Résultats

Peau de l'autre région du corps a été digéré selon le protocole décrit et colorées avec les anticorps indiqués. La stratégie de déclenchement est représenté sur la figure 1. Tout d' abord sélectionner les cellules vivantes (cellules DAPI-), puis porte sur singulets (FSC-A vs. FSC-W) et sur ​​des cellules ayant une morphologie des lymphocytes (FSC-A vs SSC-A). Lorsque cela est indiqué, les cellules CD45 ⁺ d'origine hématopoïétique sont sélectionnés....

Discussion

Nous avons décrit un procédé pour la préparation de suspensions monocellulaires à partir de différentes régions de la peau de la souris. La méthode de la digestion, nous avons adopté, donne non seulement des rendements élevés mais préserve aussi l'expression de marqueurs de surface, ce qui est fondamental pour l'analyse FACS ultérieure.

L'utilisation d'un cocktail de collagénase I et II et de la thermolysine, garantit lot minimum des différences de traitement par lots dans un...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactifs
Milieu RPMI 1640 supplémenté  ;			RPMI1640 supplémenté en L-glu, pen-streptocoque sans bêta-mercapto éthanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	remettre en suspension [2,5  ; mg/ml] en dH2O ; stocker les aliquotes à -20  ; ° ; C
Dnase I	Sigma  ;	D4263-1VL	remise en suspension dans RPMI 1640 sans sérum [1 000  ; U/ml]
Materials
Ciseaux
Pinces
Scalpel
35 mm Boîtes
66 mm Boîtes
70 et micro ; m Filtres cellulaires	BD	352350
Digestion cocktail			Dilué dans RPMI 5 % FBS
LIberase TM			300 µ ; g/ml
DNAse1			50 U/ml
Antibodies
>Name	Company	Clone	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC