À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Résumé

L’imagerie intravitale stable à haute résolution des cellules immunitaires du foie est un défi. Nous proposons ici une méthode très sensible et fiable pour étudier la migration et les interactions cellule-cellule des cellules immunitaires dans le foie de souris sur de longues périodes (environ 6 heures) par microscopie à balayage laser multiphotonique intravital en combinaison avec un suivi en soins intensifs.

Résumé

inflammation du foie en tant que réponse à une blessure est un processus hautement dynamique impliquant l'infiltration des sous-types distincts de leucocytes, y compris les monocytes, les neutrophiles, les sous-ensembles de cellules T, les cellules B, les cellules tueuses naturelles (NK) et des cellules NKT. Microscopie intravitale du foie pour le suivi de la migration des cellules immunitaires est particulièrement difficile en raison des exigences élevées en ce qui concerne la préparation des échantillons et la fixation, la résolution optique et la survie des animaux à long terme. Pourtant, la dynamique des processus inflammatoires ainsi que des études d'interaction cellulaires pourraient fournir des informations cruciales pour mieux comprendre l'initiation, la progression et la régression de la maladie inflammatoire du foie. Par conséquent, une méthode très sensible et fiable a été créé pour étudier la migration et cellule-cellule-interactions de cellules immunitaires différentes dans le foie de souris sur de longues périodes (environ 6 h) par intravitale deux photons microscopie à balayage laser (TPLSM) en combinaison avec des soins intensifs surveillance. ent "> Le procédé proposé comprend une préparation douce et la fixation stable du foie avec une perturbation minimale de l'organe; imagerie intravitale à long terme en utilisant multicolore multiphotonique microscopie avec pratiquement pas de photoblanchiment ou des effets phototoxiques sur une période de temps allant jusqu'à 6 heures, ce qui permet un suivi de sous-ensembles de leucocytes spécifiques et des conditions de formation d'image stable en raison de la surveillance des paramètres vitaux extensif de souris et de stabilisation de la circulation, la température et l'échange de gaz.

Pour étudier la migration des lymphocytes à une inflammation du foie CXCR6.gfp souris knock-in ont été soumis à l'imagerie du foie intravitale dans des conditions de base et après des lésions du foie aiguë et chronique induite par injection intraperitoneale (s) de tétrachlorure de carbone (CCl _4).

CXCR6 est un récepteur de chimiokine exprimée sur les lymphocytes, principalement sur tueuses naturelles T (NKT) -, Natural Killer (NK) - et des sous-ensembles de lymphocytes T telles que les cellules T CD4 mais aussi asso muqueusesATED invariant des cellules (MAIT) T ^1. Suivant le modèle migratoire et le positionnement de CXCR6.gfp ⁺ cellules immunitaires permis un aperçu détaillé dans leur changement de comportement lors d'une lésion du foie et donc leur implication potentielle dans la progression de la maladie.

Introduction

La visualisation des cellules et des fonctions cellulaires dans des organes entiers, voire des organismes entiers a été d'un grand intérêt pour les plus de 50 ans, y compris presque toutes les parties du corps ^2. Par conséquent, certaines études antérieures déjà employés imagerie intravitale du foie ^3,4. Cependant, plusieurs limitations existent à jour concernant stable à long terme imagerie à haute résolution des tissus du foie.

En raison de la position anatomique du foie en contact étroit avec la membrane et le tractus gastro-intestinal ^5, le problème le plus commun pour l'imagerie microscopique intravitale mouvement est due à la respiration et, dans une moindre mesure, péristaltique de l'intestin ^6. En comparaison à d'autres organes solides, la chirurgie du foie est particulièrement difficile. En raison de la structure microvasculaire dense, manipulation chirurgicale peut entraîner des lésions hémorragiques massifs, troubles de la microcirculation ⁷ et également l'activation de résident immune cellules telles que des cellules de Kupffer ^8. Par conséquent, la fixation mécanique du tissu telle que publiée ailleurs ^6,9 est susceptible d'interférer avec l'imagerie par microscopie intravitale.

Dans un foie en bonne santé, de 10 à 15% du volume total de sang réside dans le système vasculaire du foie, et l'organe reçoit l'ordre de 25% de la production globale cardiaque ^10, rendant l'organe très sensible aux variations de la circulation (par exemple, les fluctuations de la pression artérielle ). Par conséquent, les perturbations dans le flux sanguin hépatique due à par exemple, contrainte de cisaillement, de déplacement, de blessure par une manipulation excessive des tissus ou la circulation centralisée seront conduire à des altérations artificielles dans leucocytes comportement migratoire, troubles de l'oxygénation du foie et donc également des dommages au foie, affecter les réponses immunitaires du foie ainsi comme conservation d'organes et de la durée de vie globale de l'animal.

Études microscopiques étaient fondés sur km à épifluorescence intravitalecroscopy, mais plusieurs contraintes techniques telles que le blanchiment photo et une faible profondeur de pénétration limiter l'utilisation de cette technique pour le long terme imagerie du foie ^4,11,12. Avec le développement de la microscopie multiphotonique dans les années 1990, les limites de la photo blanchiment ou la profondeur de pénétration ont principalement été résolus, que cette nouvelle méthode était techniquement capable d'effectuer des études d'imagerie dans pratiquement tous les organes dans des situations de la vie réelle ^{de 13 à 15.} Toutefois, les principaux défis à relever en ce qui concerne l'imagerie du foie étaient: mouvements de respiration, autofluorescence des tissus du foie, de fixation flux sanguin inchangée dans les sinusoïdes hépatiques, et l'imagerie particulièrement stable pour des périodes de plusieurs heures ¹⁶ plus longues.

Bien que plusieurs études ont abordé la fonction et la migration des différents leucocytes dans le foie, par exemple, ¹⁷ cellules NKT ^18-20, les cellules T ^21,22, les macrophages du foie ^23,24 ou ²⁵ neutrophiles, long terme multiphotonique mimagerie icroscopy ne avait pas encore été établie avec succès, une tâche encore plus difficile chez les animaux atteints de maladie hépatique aiguë ou chronique en raison des dommages existants et la susceptibilité donc supérieur à ²⁶ autres dommages. Toutefois, le suivi du comportement migratoire et la fonction cellulaire de leucocytes dans le foie en temps réel permet de nouvelles perspectives dans leur rôle particulier dans l'homéostasie du foie et la maladie ^27.

Le CXCR6 des récepteurs de chimiokines est exprimé sur plusieurs sous-ensembles de lymphocytes, y compris les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules NKT et certaines populations de cellules T ^18,28. Des études antérieures sur des souris ont indiqué que CXCR6 et son CXCL16 de ligand apparenté peuvent contrôler les patrouilles des cellules NKT sur sinusoïdes du foie lors de l'homéostasie. Par conséquent, l'utilisation de souris CXCR6.gfp (portant un knock-in de la protéine verte fluorescente [GFP] dans le locus CXCR6) a été décrite pour étudier la migration des lymphocytes dans divers organes tels que le cerveau ²⁹et aussi le foie ^18,20, montrant l'infiltration de cellules CXCR6.gfp augmenté sur l'inflammation.

Avec la méthode prévue dans cette étude, il était possible de suivre ces processus sur une longue période de temps dans des conditions stables. La procédure basée multiphotonique intravitale permis imagerie qui était très reproductible avec une perturbation minimale de l'animal et l'organe; optimisé pour la survie des animaux à long terme par une surveillance importante suivie d'un contrôle étroit de la respiration et de la circulation; et très flexible et facile à adopter aussi à d'autres organes parenchymateux tels que le rein ou de la rate.

Protocole

REMARQUE: Les expériences ont été effectuées en conformité avec la législation allemande régissant les études animales suivantes le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de (la publication NIH, 8e édition, 2011) et la directive 2010/63 / UE sur la protection des animaux utilisé à des fins scientifiques (Journal officiel de l'Union européenne, 2010). Autorisation officielle a été accordée dans le soin des animaux et l'utilisation bureau gouvernemental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Allemagne).

NOTE: Les mesures qui peuvent être omis pour l'imagerie à court terme (par exemple, des piles Snap Shots 3-D ou aussi courte durée time-lapse microscopie) sont marquées d'un astérisque (*) pour réduire le temps de préparation et de simplifier le protocole chirurgical. L'imagerie peut également être réalisée sans un contrôle étendu de surveillance et de la circulation, si nécessaire, cependant, le temps de survie sera nettement réduite.

1. Configuration de Microscope et pré-chirurgie Préparation (5-10 kmn)

1. système de commutateur (microscope, puissance Lab, laser, coussin chauffant, chambre climatique, web cam, dispositif de pompe de la seringue, un respirateur).
2. Connectez O ₂ offre à l'isoflurane vapeur et régler le niveau isoflurane à 1,5% en volume (v / v), se connecter à un petit appareil respiratoire des animaux.
   1. Pour court imagerie terme, maintenir l'anesthésie à l'isoflurane seulement après l'induction initiale de l'anesthésie ip (voir l'étape 2.2). Ensuite, utilisez 2 Vol% (v / v) isoflurane, et de garder le temps d'imagerie en dessous de 2 h pour garantir stable microcirculation du foie.
3. Réglez la respiration à 120-140 cycles / min respiratoires avec un volume de 150 à 200 pi.
4. Mettre en place l'étape d'agarose de la souris. Préparer 100 ml de 3% (p / v) d'agarose, le verser dans un plat (environ 10 cm x 15 cm base) dans un angle de 40 °.
5. Mettre en place la zone de travail chirurgical recueillir l'instrumentation nécessaire. Pour prévenir l'infection microbienne, la désinfection d'instruments en utilisant une solution à 1% du Forte Sekusept S (9,9% p / v), Glutaral 9,8% p / v, de formaldéhyde pendant 5 min avant l'expérience (figure 1A).
6. Obtenir des composants restants: désinfectant de la peau (par exemple, une solution de la povidone iodée 10%), l'étape du foie (piles et pont), une solution d'agarose (3% (p / v) dans du PBS), la pompe à seringue avec 5% (p / v) d'une solution de glucose (G-5), la pompe à seringue avec une solution anesthésique I (Kétamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, 5 pg de fentanyl / ml), des tampons de coton, le n-butyl-2-Cyanoacrylat et 1x PBS. Mettez plat stade agarose dans la chambre d'incubation pour le préchauffage.

2. trachéotomie (10-15 min)

1. Utilisez souris C57BL / 6 dans la maison de l'élevage pesant 25-28 g. Maison des souris dans des conditions exempts d'organismes pathogènes spécifiques en conformité avec les lignes directrices FELASA, dans un environnement à température et humidité contrôlées avec un / 12 h cycle d'obscurité 12 heures de lumière. Permettre aux animaux un accès gratuit à un régime standard de souris (Sniff standard rongeurs Diète) et de l'eau ad libitum.
2. Anesthésier la souris par initial intraperitoneale (ip) d'injection de 250 ul d'une solution anesthésique de kétamine II (0,1 mg / ml, xylazine 1 mg / ml, la buprénorphine 10 ug / ml).
   1. * Pour l'entretien lors de l'imagerie intravitale, administrer en continu la solution anesthésique I par injection ip continu (Kétamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, le fentanyl 5 ug / ml) en utilisant un appareil de pompage à seringue à un débit de 0,2 ml / h dans par inhalation d'isoflurane combinaison avec 0,5% en volume (v / v).
   2. Vérifiez réflexes après 5 min (par exemple pincée de coussinet plantaire avec une pince), désinfecter la peau pour la trachéotomie, commencer la préparation si la souris est en état ​​d'anesthésie chirurgicale tolérante.
   3. Appliquer une crème de protection oculaire (par exemple, Dexpanthenol 50 mg / g) pour empêcher la cornée de sécher (figure 1B).
3. Fixer la souris sur la table de préparation exposer face ventrale avec du ruban adhésif pour les extrémités; overstretch doucement le cou, fixer dans cette position, par exemple., en utilisant une bande de caoutchouc accroché to les incisives.
   1. Désinfectez la peau et de la fourrure en utilisant une solution d'iode povidone, en appliquant un désinfectant avec un coton-tige.
4. Effectuer la découpe de la peau initial (0,5 à 1 cm de longueur) directement sous le menton (figure 1C)
   1. Disséquer soigneusement le tissu conjonctif entre les glandes salivaires (figure 1D).
   2. Détachez avec soin ouverte musculaire tube entourant la trachée (figure 1E, F).
5. Placez fil chirurgical sous la trachée pour plus tard la fixation du tube de ventilation (figure 1G).
   1. Ouvrir la trachée par des micro-ciseaux entre les anneaux cartilagineux effectuant une incision en forme de T (figure 1H)
6. Placez le tube de ventilation dans la trachée à travers l'incision (~ 0,5 cm). Pour pousser le tube avant, saisir extrémité caudale avec de petites pinces anatomiques et avancer doucement le tube dans la trachée (Figure 1I)
7. Fixer tube avec fil chirurgical (par exemple, , 5-0) avec un fil placé à l'étape 2.5 un nœud autour du tube intérieur de la trachée; effectuer seconde fixation crânienne du tube à la peau pour éviter réciproquement des accidentelle (figure 1J, K).
8. coupe du joint avec de la colle de tissu (par exemple, le n-butyl-2-Cyanoacrylat) (Figure 1L).
9. Fixer le tube à la tête avec du ruban adhésif.

3. laparotomie (15-20 min)

1. Placez la souris sur coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie. Rasez abdomen, retirer délicatement les poils de la peau. Désinfectez la peau et de la fourrure rasée en utilisant une solution de povidone iode.
2. Effectuer une petite couper la peau en dessous du sternum avec des ciseaux chirurgicaux (figure 2A). Prolonger la coupe latéralement sous les côtes des deux côtés, cautériser tous les vaisseaux sanguins visibles pour prévenir les saignements.
3. Effectuer avec précaution une petite coupure à la ligne blanche en dessous du sternum, ouverture du péritoine (figure 2B). Prolonger la coupe des deux côtés utilisant cauterization pour prévenir les saignements (figure 2C, D).
4. Placez la souris dans un plat de scène agarose (figure 2E). Placez des piles de hauteur appropriée des deux côtés de la souris (en général de 12 à 14 des lamelles) (figure 2F).
5. Placez capteur de déclenchement respiratoire sous le haut du dos pour synchroniser le microscope avec la respiration. Activer unité de déclenchement (figure 2G).
6. Placez fil chirurgical (5-0) à travers le sternum se rétracter nervures (Figure 2I).
7. Découpez soigneusement ligament reliant le foie et le diaphragme (ligament falciforme) ainsi que le foie et tractus gastro-intestinal avec des ciseaux chirurgicaux courbes. Couper le ligament falciforme jusqu'à l'aorte (figure 2J).

4. Configuration de l'échantillon (10-15 min)

1. Placez la souris sur le côté droit avec un angle de 45 ° pour un accès facile à gros lobe du foie.
2. Ajouter pont en scène sous les côtes, couvrant la abdominalecavité. Fabrication d'un pont en utilisant une lamelle standard avec revêtement adhésif de bande pour couvrir les arêtes vives (Figure 2K).
3. Placez gros lobe du foie sur scène. Glisser soigneusement double roulement sonde de stylet ou une spatule rembourrée dessous du foie et tenir le haut de l'organe en utilisant un coton-tige humide ou tissu humide. Soulevez lobe sur la diapositive et appliquer glisser en douceur. Lobe peut être plié ou plié. Fournir des soins supplémentaire pour que la manipulation douce du foie (Figure 2L).
4. Placez piquets de soutien latéral, par exemple, des tas de petites lamelles (20 mm x 20 mm), d'environ la même hauteur du lobe du foie à côté de lui pour soutenir lamelle.
5. Passer grande lamelle (24 mm x 50 mm) sur le lobe du foie. Veiller à ce que lamelle est orienté aussi horizontale que possible (Figure 2M).
   NOTE: La lamelle doit être en contact avec le tissu sans presser. Vérifiez les signes visibles de la circulation sanguine avec facultés affaiblies (tissu blanc). Si MICROCIRCulation est perturbé, ajouter soutenir davantage enjeux.
6. * Placez deux cathéters intra-péritonéales indépendants (Figure 2N) pour l'anesthésie à long terme et l'application G-5. Installez cathéters latéralement dans le bas-ventre à côté des membres postérieurs.
   REMARQUE: Les cathéters intra-péritonéales peuvent être self-made en connectant 27 G aiguilles avec un tube de silicone souple (Figure 3).
7. * Aiguille Fixate avec une boucle de fil chirurgical 5-0 sur la peau pour éviter tout déplacement accidentel.
8. * Joindre pompe seringue avec une solution d'anesthésie I cathéter 1, réglage du débit à 0,2 ml / h; attacher pompe seringue avec le G-5 à cathéter 2, débit réglé à 0,1 ml / h.

5. Suivi de la souris

1. * Lieu électrodes ECG dans les extrémités avant et arrière (figure 4A).
2. * Fixer le tube d'expiration de CO ₂ capteur de niveau.
3. Ajouter capteur de température externe connecté au pad thermique (figure 4C).

6. Embedding et fixation tissulaire (5-10 min)

1. Préparer 100 ml de 3% (p / v) d'agarose dans du PBS 1X. Incorporer foie lorsque la température est à 41 ° C en utilisant une seringue de 5 ml et une aiguille 18 G (figure 5A).
2. Verser le reste d'agarose sur lamelle couvre-objet et autour de la souris (figure 5B, C). Attendez jusqu'à ce que l'agarose est complètement gélatinisé.
3. Enlever l'excès d'agarose en utilisant la spatule Heidemann, la préparation d'un Viewfield suffisamment grande pour balayer le lobe hépatique préparé (figure 5D, E).

7. Imaging

1. Transférer la souris dans la chambre climatique de microscope.
2. Ajouter 50 à 100 ml de 1 x PBS (préchauffé à 37 ° C).
3. Couvrir le plat de l'échantillon pour éviter l'évaporation (figure 5F).
4. * Diminution par inhalation d'isoflurane à 0,5% en volume (v / v).
5. * Lancer un logiciel de surveillance, l'enregistrement ECG, la fréquence cardiaque et de CO ₂ expiratoire.
6. Lancer imagerie: ouvrir laser volets, identifier les champs de vue de l'intérêt, définissent la limite supérieure et inférieure pour Z-piles, et commencer l'enregistrement laps de temps. Réajuster Z-piles si nécessaire pour corriger Z-dérive (par ex. En raison de changements dans la pression sanguine ou les fluctuations de température, Figure (5G).
   REMARQUE: Après la fin de la période de formation d'image ou si la circulation ou l'anesthésie des animaux devient instable, sacrifier les souris par dislocation cervicale (sans réveil de l'anesthésie).

Résultats

Pour valider notre approche de TPLSM intravitale, nous avons soumis ^{GFP / +} souris CXCR6 à l'imagerie intravitale TPLSM. Les souris ont été soit laissées non traitées comme témoins ou de référence soumis à une injection intraperitoneale unique de tétrachlorure de carbone (CCl ₄₎ pour induire des dommages au foie aiguë ^20.

Les séquences vidéo ont été prises sur une période de temps de 2 à 5 h, et les cellules ont été retracés au fil du temps en raison de leur ...

Discussion

Le but de notre étude était de développer une méthode très standardisé, stable et reproductible pour l'imagerie intravitale TPLSM du foie. Imagerie intravitale en général a donné de précieuses indications sur le comportement cellulaire dans des conditions réelles suivantes homing et l'interaction des différentes populations de leucocytes dans le développement, l'homéostasie et la maladie. Cependant, la position anatomique peu difficile du foie, en raison de laquelle respiratoire et le mouvement péristaltique...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anesthésiques
Buprénorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgéticum, 0,1 mg/kg
Fentanyl	Rotex Medica	charge : 30819
Système d’anesthésie Fluovac	Harvard Apparatus	34-1030
Glucose 5 %	Vaporisateur
ISOFLO (Isoflurane Vapor)	Eickemeyer	4802885
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Isotonique (0,9 %) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Ketamin 10 %	ceva	Charge : 36217/09
Xylazin 2 %	medistar	Charge : 04-03-9338/23
Consommables
20 ml Seringue	BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer	flacon Schott Duran	21 226 36
25 ml Bécher 2x	Schott Duran	50-1150
Seringue 2 ml	BD Plastipak
4-0 Vicryl suture	Ethicon	V7980
Agarose	disponible dans
Bepanthen Eye et Pommade pour le nez	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe Kit de cautérage à haute température	Fine Science Tools Inc.	18010-00
Coton-gaze éponges	Fuhrmann GmbH	32014
Cover Slip 24x50 mm	ROTH	1871
Ruban de soie Durapore	3M	1538-1
Scalpel jetable en plumes	Feather	02.001.30.011
Tube en polyéthylène à alésage fin 0,58 mm ID	Smiths medical	800/100/200
Histoacryl	Braun	1050052	5x 0,5 ml
Leukoplast	BSN Medical Inc.
Lames de microscope	ROTH	1879
Poly-alcool Haut&hellip ; farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
Aiguille stericane 18 G x 1	B. Braun	304622
Aiguille stericane 27 3/4 G x 1	B. Braun	4657705
Papier de soie	disponible dans
Instruments
Burnisher à amalgame 3PL	Gatz	0110 ?
Écarteurs Blair (4 broches (émoussées)) x2	Storz& Klein	S-01134
Pince Dumont No.7	Fine Science Tools Inc.	91197-00
Pince Graefe courbée x1	Fine Science Tools Inc.	11151-10
Pince Graefe droite x2	Fine Science Tools Inc.	11050-10
Spatule Heidemann HD2	Stoma	2030.00
Porte-aiguille Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Scissor	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Pince Semken	Fine Science Tools Inc.	11008-13
Petits ciseaux chirurgicaux courbés	Fine Science Tools Inc.	14029-10
Petits ciseaux chirurgicaux droits	Fine Science Tools Inc.	14028-10
Pince à motif standard	Fine Science Tools Inc.	11000-12
Ciseaux à ressort Vannas	Fine Science Tools Inc.	15000-08
Équipement
Unité de déclenchement ECG	Rapid Biomedical	3000003686
MICROCAPSTAR Analyseur de dioxyde de carbone en fin d’expiration	Instruments AD Minivent
Typ 845	Appareil Harvard	73-0043
Microscope multiphotonique Trimscope I	LaVision
Perfusor Compact	B. Braun
PowerLab 8/30 Enregistreur 8 canaux	AD Instruments	PL3508
Coussin chauffant à température contrôlée	Sygonix	26857617
Capteur	de température disponible
Système à température contrôlée pour microscopes -Cube& Services			d’imagerie Box Life