3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Résumé

L’étude in vitro des cellules épithéliales thymiques médullaires a été largement infructueuse, car les systèmes de culture 2D actuels n’imitent pas le scénario in vivo. Le système de culture 3D décrit ici - un modèle de culture organotypique de peau modifié - s’est avéré supérieur pour récapituler la prolifération des mTEC, la différenciation et le maintien de l’expression des gènes de promiscuité.

Résumé

Le développement des cellules T intra-thymique nécessite un maillage tridimensionnel complexe composé de diverses cellules stromales, à savoir, les cellules non-T. Thymocytes traversent cette échafaudage dans un ordre temporel et spatial très coordonnée en passant séquentiellement points de contrôle obligatoires, à savoir, l'engagement de la lignée de cellules T, suivie par récepteur des cellules T génération et la sélection du répertoire avant leur exportation vers la périphérie. Les deux types de cellules résident principaux formant ce échafaudage sont des cellules épithéliales thymiques corticales (CTEC) et médullaires (mTECs). Une caractéristique clé de mTECs est l'expression que l'on appelle la promiscuité de nombreux antigènes tissulaires restreint. Ces antigènes de tissus soumis à des restrictions sont présentés pour les thymocytes immatures directement ou indirectement par mTECs thymiques ou les cellules dendritiques, ce qui entraîne respectivement à une auto-tolérance.

Appropriés modèles in vitro imitant les voies de développement et les fonctions du CTEC et mTECs sont actuellement lacroi. Ce manque de modèles expérimentaux adéquats a entravé par exemple l'analyse de l'expression génique promiscuité, qui est encore mal comprise au niveau cellulaire et moléculaire. Nous avons adapté un modèle organotypique 3D co-culture à la culture ex vivo mTECs isolés. Ce modèle a été conçu à l'origine pour cultiver des kératinocytes de manière à produire un équivalent de peau in vitro. Le modèle 3D conservé des caractéristiques fonctionnelles clés de mTEC biologie: (i) la prolifération et la différenciation terminale des CD80 ^lo, Aire-négatif en CD80 ^salut, Aire-positif mTECs, (ii) la réactivité de RANKL, et (iii) l'expression soutenue de Foxn1, Aire et les gènes de tissus restreinte dans CD80 mTECs ^hi.

Introduction

Thymocytes en voie de développement représentent environ 98% du thymus, tandis que les 2% restants se compose d'une variété de cellules qui composent collectivement le stroma thymique (c.-à cellules epitheliales, les cellules dendritiques, les macrophages, les cellules B, les fibroblastes, cellules endothéliales). Les cellules épithéliales corticales extérieures (CTEC) procurent immigration de cellules pro-T de la moelle osseuse, T lignée cellulaire induction dans les cellules multipotentes pré-T et la sélection positive de soi-CMH limités thymocytes immatures. Les cellules médullaires thymiques épithéliales internes (mTECs) sont impliqués dans l'induction de tolérance de ces thymocytes avec une haute affinité pour les complexes TCR auto-peptide / CMH soit par induction sélection négative ou leur déviation dans la lignée de cellules T régulatrices. Dans le cadre de la tolérance centrale induction, mTECs sont uniques en ce qu'ils expriment un large spectre des auto-antigènes tissulaires restreint (EMR) reflétant ainsi l'auto périphérique. Ce phénomène est appelé l'expression du gène de promiscuité (PGE)^1,2.

La plupart des études actuelles sur ce type de cellule fascinante comptent sur ​​ex vivo des cellules isolées, que divers systèmes de culture 2D à court terme invariablement entraîné la perte de PGE et des molécules régulatrices clés comme le CMH de classe II, Foxn1 et Aire dans les 2 premiers jours ^3-6 . Il restait toutefois incertaine, les composants et caractéristiques de la maillage 3D intacte du thymus particuliers étaient manquantes dans les modèles 2D. La culture d'organe thymique ré-agrégation (RTOC) a été jusqu'à présent le seul système 3D qui permet l'étude du développement des lymphocytes T, d'une part, et de la biologie des cellules stromales, d'autre part, dans un microenvironnement thymique intacte ^7. Cependant, RTOCs ont certaines limites, à savoir, ils contiennent déjà un mélange complexe de cellules, exiger l'entrée de cellules stromales fœtales et supporter une période de culture maximal de 5 à 10 jours.

Le manque de réductionniste dans les systèmes de culture in vitro a entravé l'étude deplusieurs aspects du développement des cellules T et thymique organogenèse pas moins la régulation moléculaire de pGE et sa relation à la biologie du développement de mTECs.

En raison de la proximité-apparentement de l'organisation structurée des cellules épithéliales de la peau et du thymus, nous avons opté pour un système 3D culture organotypique (OTC) qui avait été développé à l'origine pour émuler la différenciation des kératinocytes in vitro et donc de créer un équivalent dermique. Le système se compose d'un OTC matrice inerte recouvert d'échafaudage avec des fibroblastes dermiques qui sont piégés dans un gel de fibrine, sur lequel les kératinocytes sont ensemencés ^8,9. Ici, nous avons remplacé les kératinocytes avec mTECs purifiés. Tout en gardant les caractéristiques de base de ce modèle, nous avons optimisé certains paramètres.

Dans le modèle de gré à gré adoptée mTECs proliféré, a subi une différenciation terminale et maintenu identité mTEC et PGE, imitant ainsi étroitement vivo développement des mTECs dans ^{10. Cette note technique fournit un protocole détaillé permettant la mise en place progressive d'OTC thymus.}

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de la Regierungspräsidium Karlsruhe. Tous les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques du Centre de recherche allemand sur le cancer (DKFZ). Pour tous les petits expériences de culture de souris allant de 1 à 7 jours d'âge ont été utilisés.

1. Isolement de mTECs de Thymus

REMARQUE: Les étapes de digestion suivantes ont été réalisées comme décrit précédemment ¹ dans des conditions stériles avec quelques modifications comme suit.

1. Décapiter les souriceaux et retirer le thymus. Placez le thymus sur de la glace dans une boîte de Pétri contenant du milieu RPMI 1640 (contenant 5% de FCS).
2. Couper le thymus en fines, de petits morceaux et les mettre dans un tube à fond rond avec ~ 5-30 ml du milieu RPMI et remuer doucement en utilisant un aimant pendant 10 min à température ambiante.
3. Par la suite, décanter le surnageant contenant principalement thymocytes et digérer séquentiellement de tissu restant avec un tour de Collagenasoi de type IV (0,2 mg / ml et 57 U / ml concentartion finale) pendant 15 minutes chacun à 37 ° C, suivi par de la collagénase / dispase (0,2 mg / ml et la concentration finale de 1,2 U / ml) pendant 25 minutes chaque à 37 ° C dans un bain d'eau sous agitation magnétique jusqu'à ce que le thymus est complètement digéré. Utilisez 1 ml enzyme par deux à trois thymus.
4. Agiter le tissu une fois tous les 7 à 10 min avec une pipette Pasteur. Réunir les fractions de la collagénase / dispase et filtrer à travers une gaze de 70 um.
5. Enrichir les mTECs par la cellule tri magnétique (MACS). Effectuer la purification de mTECs par tri cellulaire magnétique ¹¹ tel que décrit précédemment, et représenté sur la figure 1.
   NOTE: Pour tri magnétique des mTECs nous avons utilisé les anticorps suivants: anti-CD80-PE (16-10A1, utilisation à dilution 1: 100) et anti-EpCAM-bio (G8.8, l'utilisation à dilution 1: 100) ^12. MTECs immatures et matures utilisant MACS ont été définies comme suit: CD45 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- et CD45 ^- CD80 ⁺ respectivEly.
6. Après MACS purification (pureté de mTECs immatures = 83,1 ± 6,3% et mTECs matures = 79,23 ± 3,42%), ensemencer les mTECs sur les cultures organotypiques comme décrit ci-dessous (section 2.3).
7. Alternativement, tri mTECs par FACS (en utilisant 100 buse de um) après CD45 MACS appauvrissement utilisant les anticorps suivants: anti-CD45-PerCP (30-F11, l'utilisation à dilution 1: 100), anti-Ly51-FITC (6C3, utiliser au 1 : 100 dilution), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, l'utilisation à dilution 1: 500) et l'utilisation anti-CD80-PE (16-10A1, au dilution 1: 100). Exclure les cellules mortes en utilisant l'iodure de propidium (1: 5000) (Jour 4). MTECs immatures et matures utilisant FACS ont été définies comme suit: PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- et PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^+, respectivement.

2. 3D organotypiques Co-cultures (OTSC)

NOTE: Les constructions 3D-cutanée pour la culture organotypique de keratinocytes ont été préparés comme décrit ci-dessus ^9,13. A toutes les étapes cellules ont été incubées à 37 ° C et 5% de CO _2. Les médicaments en vente libre en utilisant mTECs ont été préparés avec de légères modifications comme suit.

1. Préparation des fibroblastes humains
   REMARQUE: Les fibroblastes dermiques humains ont été obtenus à partir de cultures d'explants de dé-épidermisé derme comme décrit précédemment ^neuf.
   1. En bref, couper des bandes de peau humaine (~ 5 cm de longueur) et traiter avec la thermolysine (0,5 mg / ml dans une solution saline avec 10 mM Hepes pH 7,4) O / N à 4 ° C.
   2. Par la suite, séparer l'épiderme du derme à l'aide de forceps.
   3. Coupez finement le derme en petits morceaux, dans une plaque de 10 cm de Pétri et laisser sécher pendant 1-2 heures sous flux d'air stérile. Compléter les explants régulièrement avec DMEM contenant 20% de FBS.
   4. Diviser les fibroblastes sur plus quand confluentes (généralement autour de 3 semaines) en utilisant 0,1% de trypsine faire en sorte que les explants continuent à adhérer à la plaque pour plus contours consécutifs de l'excroissance.
   5. Développer les fibroblastes provenant de la même explants pour un maximum de trois fois dans du DMEM avec 10% de FBS et cryo-préservation eux ^14. Utiliser le même lot de fibroblastes pour chaque série expérimentale.
      NOTE: Les fibroblastes ont pas été irradiées pendant le set-up des équivalents de derme.
2. Préparation de la Échafaudages
   1. Couper les 0,4-0,6 mm d'épaisseur de viscose, matériau fibreux non tissé (des détails du produit à soutenir feuille Excel) dans les cercles bien délimitées en utilisant une forte 11 mm de diamètre perforateur métallique pour correspondre exactement en 12 inserts bien-filtre. Ensuite, placer dans le puits 12 insert de filtre (polyester membrane capillaire des pores, 3 um de taille de pores) comme échafaudage. Placez la configuration complète de filtre dans une plaque de 12 puits stérile.
   2. Préparer le gel de fibrine en utilisant un kit de colle de fibrine pour la chirurgie constitué d'une combinaison de fibrinogène et de thrombine. Pré-diluer le fibrinogène et la thrombine en tant que composants du kit à 8 mg / ml et 10unités / ml, respectivement. Pour un seul puits d'une plaque de 12 puits, procéder comme suit.
      1. Diluer 100 ul de fibrinogène (8 mg / ml) avec 100 ul de phosphate saline tamponnée (PBS) sans _Ca2 ⁺ et _Mg2 ^+, pH 7,0. Diluer 100 ul de thrombine (10 unités / ml) avec 100 ul de FCS contenant 270.000 fibroblastes.
      2. Distribuer 200 pl de la thrombine contenant des fibroblastes de cellules se mélangent sur l'échafaudage, ce qui ajoute à 200 ul de fibrinogène (mélange 1: 1), ce qui entraîne une concentration finale de fibrinogène de 2 mg / ml de thrombine et de 2,5 unités / ml. Mélangez bien et répartir uniformément sur toute la surface de l'échafaudage par pipetage doux (jour 1).
         Remarque: Au bout de 30 min à 37 ° C renfermant un caillot les fibroblastes se sera formée, remplissant complètement les espaces internes de l'échafaudage et en formant une surface supérieure lisse.
3. Co-culture avec mTECs
   1. Pour pré-culture, plonger les cultures d'organes enDMEM avec 10% de FBS, 50 ng / ml d'acide L-ascorbique et de 1 ng / ml de TGF-β1 avec un changement de milieu tous les deux jours pendant 4-5 jours.
   2. Le jour de l'ensemencement mTEC, remplacer le milieu par du milieu FRDA (1: 1 de DMEM + DMEM / F12) avec 10% de FBS, 10 ^-10 M toxine du choléra, 0,4 mg / ml d'hydrocortisone, 50 pg / ml d'acide L-ascorbique, RANK ligand (0,1 pg / ml) et 500 unités / ml d'aprotinine, empêchant ainsi la fibrinolyse précoce par des serine proteases sécrétées par les fibroblastes.
   3. 7-8 heures plus tard, les co-cultures mis en place par l'ensemencement 250.000 mTECs (soit mTECs complets, ou CD80 ^lo et ^hi CD80 sous-ensembles), dans un volume de 100 l par puits sur le dessus de l'échafaudage des fibroblastes. Compter les cellules en utilisant un Neubauer (Jour 4).
      NOTE: En tout temps les cultures organotypiques 3D thymus sont immergés dans les médias, contrairement OTC de la peau qui sont air-levée.
   4. Après 24 heures d'incubation, fournir les cultures avec un milieu (de change moyen total) comme mentionné ci-dessus (étape 2.3.2) maintenant containing réduit les montants de l'aprotinine, 250 unités / ml (Jour 5).
   5. Afin d'évaluer l'activité proliférative des mTECs, ajouter EdU (6,7 uM / ml, soit 10 uM / puits) de médicaments en vente libre pendant 4 heures avant la fin des cultures. Effectuer la coloration de gré à gré cryo-sections comme décrit dans le Kit EdU imagerie combinée avec le co-coloration de la kératine 14. Déterminer les indices de prolifération de mTECs, soit par les cellules de la K14 ⁺ Edu ⁺ comptage dans deux sections de chaque spécimen de culture ou de débit cytométrie (EdU cytométrie de flux, la section 1.7, mais au lieu de Ly51-FITC utilisent CDR1-PB ¹⁵ à une dilution de 1: 100 et 2.3.6.4).
   6. Après 4-7 jours de co-culture, de résilier les OTC et le processus d'isolement de l'ARN, cryo-sectionnement ou analyse FACS (jour 8-11).
      1. Mettre fin à la culture à l'aide d'une pince, en séparant l'équivalent échafaudage / dermique à partir du filtre de l'insert de puits.
      2. Pour cryo-sectionnement, intégrer l'ensemble de gré à gré dans le composé PTOM et geler en livapeur d'azote quid avant cryo-sectionnement. Préparer 5-7 sections um d'épaisseur de gré à gré en utilisant un cryostat et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. Pour immuno-histochimie des OTC de cryo-coupe utiliser anti-kératine 14 (AF64, l'utilisation au 1: 1000 dilution), et anti-vimentine (gp53, l'utilisation au 1: 100 dilution) anticorps. Effectuer la coloration immuno-histochimie indirecte utilisant des anticorps secondaires respectifs.
      3. Pour l'isolement de l'ARN, ajouter 1 ml de solution (contenant du phénol et de guanidinium thiocyanate) dans un bouchon à vis d'un tube 2 ml sans RNase de dénaturation. Couper l'ensemble de gré à gré en morceaux avec un scalpel et ajouter dans le tube contenant la solution de dénaturation. Mécaniquement déchiqueter les médicaments en vente libre avec l'instrument FastPrep deux fois pendant 30 secondes à une vitesse de 6,0, se placent entre sur la glace pendant 2 min (l'échantillon peut être conservé à -80 ° C après ce point). Si congelé à -80 ° C, dégel sur la glace. Centrifuger les tubes à 11,500-13,000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube frais, incuber pendant 5 minutes à température ambiante et fprotocoles d'isolement d'ARN en utilisant l'acide uivez guanidinium thiocyanate-extraction au phénol-chloroforme comme décrit par le fabricant.
      4. Pour l'analyse FACS, retirez l'échafaud et séparer la membrane de la / des fibroblastes gel de fibrine / mTEC. Finement coupé le gel avec un scalpel et digérer dans un tube FACS pour ~ 20 minutes, ou jusqu'à complètement digéré avec 2 ml de collagénase / dispase à 37 ° C dans un bain d'eau sous agitation magnétique. Agiter la solution d'enzyme avec une pipette Pasteur, une fois toutes les 5 min. Après digestion complète, on filtre la suspension de cellules à travers un filtre de 70 um; tacher la suspension de cellules individuelles en utilisant les anticorps tels que décrits en 1.7 et analysent par cytométrie de flux.

Résultats

Nous avons adopté une organotypique modèle de co-culture 3D (3D OTC) qui avait été développé à l'origine pour une longue terme de culture in vitro de kératinocytes ^9. MTECs MACS-enrichis (voir MACS enrichissement régime Figure 1) ont été ensemencées sur un échafaudage comprenant un gel de fibrine et de fibroblastes piégées. Les fibroblastes fournissent la matrice extracellulaire essentiel (ECM) supportant mTECs in vitro. MTECs ont été cultivées dans OTC pour 4-14 jours e...

Discussion

Parallèlement RTOCs, l'OTC 3D ont été de loin supérieur en termes de différenciation des TEC et pGE entretien / induction (tableau 1) par rapport aux autres (i) «cultures 3D simplifiées 'aide - fibroblastes seul, sans l'échafaud; (Ii) les systèmes 2D utilisant - cellules fibroblastes / nourricier co-cultivées avec les TEC ^10, (iii) les cellules 3T3-J2 dans laquelle clones TEC développent, mais pGE est perdu, (iv) matrigel ou (v) les composants de l'ECM (données non publiées). ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris C57BL/6 enceintes	Charles River WIGA
LS colonnes	Miltenyi Biotec	130-042-401
Colonnes MS	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microbilles de souris	Miltenyi Biotec	130-052-301
Microbilles anti-PE	Miltenyi Biotec	130-048-801
Microbilles de streptavidine	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 et -biotine)	Réf. 12
Anticorps CD80-PE	BD Pharmingen	553769 Anticorps
CD45-PerCP	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC Anticorps	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific Blue	Ref. 15
Anticorps Keratin 14	Covance	PRB-155P
Vimentin antibody	Progen	GP58
Cy3-conjugué AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch  ;	111-165-003
Alexa 488-conjugué AffiniPure F(ab')2 Fragment de chèvre anti-cobaye IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch  ;	106-546-003
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) de chèvre, sondes moléculaires conjuguées Alexa Fluor 488	(Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytométrie Assay	Kit Invitrogen	C10425
Inserts filtrants 12 puits (thincerts)	Greiner bio-one
plaque 12 puits	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogène TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS Serva		47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049  ;
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinine (Trasylol)	Bayer	4032037
Toxine cholérique	Biomol	G117
Hydrocortisone	Seromed (Biochrom)	K3520
Acide L-ascorbique	Sigma	A4034
TGF-ß ; 1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R& D systems	462-TR-010
Thermolysin	Sigma Aldrich	; T-7902
OCT Compound	TissueTek	4583
Trizol (alias. Solution dénaturante - Extraction acide au guanidinium, au thiocyanate-phénol-chloroforme)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collagenase Type IV  ;	CellSystems	LS004189	0,2 mg/ml et 57U/ml conc.
Protéase neutre (Dispase)	CellSystems	LS002104	0,2 mg/ml et 1,2U/ml conc.
DNase I  ;	Roche	11 284 932 001	25 & micro ; g/ml conc.

657631 final