Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

Summary

Nous présentons un protocole pour capturer la dynamique de la régénération de la nageoire caudale des larves de poisson-zèbre à l’échelle de l’ensemble du tissu à l’aide de la stéréomicroscopie basée sur le fond clair. Cette technique permet de capturer la dynamique de régénération avec une résolution de cellule unique. Cette méthodologie peut être adaptée à tout stéréomicroscope équipé d’une caméra CCD et d’un logiciel de time-lapse.

Abstract

La nageoire caudale larvaire du poisson-zèbre est idéale pour étudier la régénération tissulaire en raison de l’architecture simple du pli de la nageoire larvaire, qui comprend deux couches de peau qui renferment un mésenchyme indifférencié, et parce que la nageoire caudale larvaire se régénère rapidement en 2-3 jours. À l’aide de ce système, nous démontrons une méthode pour capturer la dynamique de réparation de la nageoire caudale amputée avec une stéréomicroscopie vidéo en fond clair. Nous démontrons que l’amputation de l’aileron déclenche une contraction de la plaie d’amputation et l’extrusion de cellules autour du bord de la plaie, conduisant à leur élimination ultérieure. La régénération des nageoires se fait de la direction proximale à la direction distale après un court délai. De plus, la croissance développementale de la larve peut être observée à tous les stades. La méthode présentée offre la possibilité d’observer et d’analyser des comportements à l’échelle d’un tissu entier, tels que le développement et la croissance des nageoires, dans un simple réglage de microscope, qui est facilement adaptable à tout stéréomicroscope doté de capacités de time-lapse.

Introduction

La capacité d’un organisme à orchestrer les processus de réparation des tissus après une blessure est cruciale pour sa survie ¹. Bien que tous les animaux aient la capacité de guérir leurs blessures, le degré de régénération des tissus diffère considérablement d’une espèce à l’autre. Les espèces de vertébrés telles que les poissons-zèbres, les salamandres et les têtards de grenouilles ont la capacité remarquable de régénérer les tissus perdus, y compris leurs appendices, des parties de leurs yeux, leur cœur et leur système nerveux central ^2-4. Les espèces de mammifères, telles que la souris épineuse africaine et les lapins, sont capables de régénérer des trous dans leurs pennes ^{5 à 7}, et les humains et les souris régénèrent des parties de leur foie ainsi que l’extrémité de leurs doigts au cours des stades fœtaux et juvéniles ^{8 à 12}. Bien que l’on ne comprenne pas encore bien pourquoi et comment certaines espèces régénèrent les tissus plus efficacement que d’autres, la présence de voies génétiques similaires suggère que ces mécanismes peuvent rester dormants chez des espèces sans grand potentiel de régénération ^13,14. Ainsi, l’élucidation des mécanismes de réparation et de régénération des tissus chez les espèces avec des résultats de régénération satisfaisants bénéficiera à la régénération chez l’homme.

Nous avons choisi la nageoire caudale larvaire du poisson-zèbre comme paradigme pour démontrer sa régénération par stéréomicroscopie à fond clair en accéléré. La nageoire caudale larvaire du poisson-zèbre est anatomiquement simple par rapport aux structures adultes plus complexes, composées d’un épithélium replié à deux couches avec des axones somatosensoriels innervant la peau qui entoure les cellules mésenchymateuses situées médialement ¹⁵. Malgré les différences anatomiques, la régénération de la nageoire caudale larvaire est quelque peu comparable à la régénération de la nageoire adulte en termes de signatures moléculaires et de réponses de croissance ^16,17. Par rapport à la nageoire adulte, l’imagerie de la régénération de la nageoire caudale larvaire présente cependant plusieurs avantages : 1) la régénération de la nageoire larvaire est terminée en seulement 2 à 3 jours ¹⁶, 2) les larves peuvent être montées dans de l’agarose à bas point de fusion, et 3) les larves n’ont pas besoin de se nourrir jusqu’à ~ 5 jours après la fécondation (dpf) en raison de la présence du sac vitellin. Cela rend les larves de poisson-zèbre idéales pour observer la dynamique de réparation des tissus in vivo.

La méthode présentée permet de capturer la dynamique détaillée sous-jacente aux premiers processus de régénération des nageoires. De nombreuses études ont utilisé la microscopie confocale basée sur la fluorescence pour étudier les processus biologiques cellulaires et subcellulaires chez les embryonnaires et les larves de poissons-zèbres. Cependant, les configurations d’imagerie confocale sophistiquées ne sont souvent pas accessibles à tout le monde et sont très coûteuses par rapport à d’autres techniques d’imagerie. En revanche, la méthodologie présentée utilise un stéréomicroscope Discovery V12 équipé du logiciel Axiovision et d’un module time-lapse, offrant ainsi une alternative plus abordable à l’équipement d’imagerie coûteux pour examiner les comportements tissulaires. Nous démontrons que cette méthode peut être utilisée pour l’imagerie de la régénération tissulaire avec une résolution temporelle élevée à un coût minimal. Les implications de cette méthode pourraient s’étendre au-delà de la biologie fondamentale pour faire progresser les études sur la régénération des mammifères à l’aide de cultures d’organes, pour le développement thérapeutique par le biais de criblages pharmacologiques et génétiques, et elle peut servir d’outil pédagogique dans une salle de classe.

Protocol

Poisson zèbre (souche de nacre) ont été élevés et a grandi selon des protocoles établis. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance, en utilisant mM Tricaine 0,4 pour l'anesthésie et 1 mM Tricaine pour l'euthanasie. Embryons de poisson zèbre et de larves ont été traitées en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l'animal tel qu'approuvé par la commission compétente (Laboratoire de biologie animale de base MDI IACUC numéro 13-20). Cette étude a été approuvée par l'Institut de recherche sur le génome humain soin et l'utilisation des animaux Comité national, MDIBL institutionnelle Assurance # A-3562-01 sous le protocole # 14-09.

Remarque: La procédure d'imagerie qui capture la régénération des nageoires chez le poisson zèbre larvaire est résumée dans les étapes suivantes:

1. Résurrection de poisson zèbre pour les stades larvaires

1. Ramasser les oeufs et placez environ 50 oeufs dans un plat 100 x 25 mm de Pétri contenant 0,03% de sel de l'océan instantanée dans l'eau déminéralisée complété par 0,00004% de bleu de méthylène. Incuber O / N dans un incubateur à 28,5 °.
2. Le lendemain matin, retirer les embryons morts avec une pipette en verre et rincer les œufs dans une passoire avec 0,03% de sel de l'océan instantanée dans l'eau déminéralisée (milieu de l'embryon appelé).
   Note: Medium comme Ringers ^18, Hanks ^{18, 19} E2, E3 ²⁰ et Danieau ²¹ peut être préféré.
3. sup> Ajouter moyen d'embryons frais à l'antenne. Si l'on utilise des souches pigmentées, éventuellement ajouter 0,2 mM de 1-phényl-2-thiourée (PTU), comme PTU mélanogénèse et empêchera ainsi la pigmentation des larves. Laissez les embryons se développent plus loin dans l'incubateur jusqu'à deux jours après la fécondation ou tout autre stade larvaire souhaitée.

2. Préparation de la chambre d'imagerie

1. Méthode 1: Imagerie chambres fabriqués à partir de PVC ou de tuyau en Teflon (Figure 1)
   Note: Cette méthode est similaire à Concha et Adams (1998) ^22.
   1. Acquérir plastique de qualité de l'eau potable ou les tubes en téflon d'un magasin de matériel avec un un externe de 25 mmda 20 mm de diamètre intérieur. Couper le tube à faire des bagues d'environ 10 mm d'épaisseur avec une surface plane de chaque côté. Utilisez> 200 papier de verre grain pour lisser les bords.
   2. Nettoyez les anneaux avec de l'eau chaude et 70% d'éthanol et les laisser sécher à l'air.
   3. Avec une pointe de pipette, appliquer de la graisse de silicium à la moitié d'un anneau et fixez l'anneau à un 75 mm x 25 mm couvercle en verre glissement. Vous pouvez également utiliser une seringue de 3 ml rempli avec de la graisse de silicium au lieu d'une pointe de pipette.
      Remarque: Comme il est difficile d'insérer la graisse de silicone dans la seringue de 3 ml, ajouter la graisse de silicone à une seringue de 30 ml et en utilisant ce premier remplissage de la seringue de 3 ml.
2. Méthode 2: Préparation d'une boîte de Petri comme une chambre d'imagerie.
   1. Acquérir 35 ou 60 mm de diamètre des boîtes de Pétri avec une lamelle de verre fixée au couvercle (figure 2A). En variante, comme le montre la figure 3 de Distel & Koester (2007) ^23, percer une ouverture assez petit pour hune lamelle couvre-vieux dans le couvercle d'une petite boîte de Pétri et appliquer de la graisse de silicium vers l'extérieur avec une seringue de 3 ml. En utilisant une pointe de pipette propre, fixez attentivement une forme ronde ou carrée lamelle d'épaisseur désirée à l'extérieur (figure 2B).
3. Pour se assurer que l'agarose utilisé pour des séjours fermement attachés au cours de la procédure d'imagerie de montage, fixez un maillage de plastique fin intérieur de l'anneau. Premièrement, couper la maille en écran de la fenêtre obtenue à partir d'un magasin de matériel, à la taille du diamètre de la bague intérieure à l'aide de ciseaux fins avec un angle. Ensuite, couper un petit rectangle> deux fois la taille de la larve dans le milieu de la maille (figure 1, 2).
4. Appliquer quatre petits points de graisse silicone non-toxique pour l'interface entre la lamelle et l'anneau de chambre (figure 1A).
5. Utilisez une pince pour fixer le treillis fermement au fond de la lamelle de verre.

3. Montage et imagerie de la pré-injme- Larve (cette étape est facultative)

Remarque: Cette étape se prête aux comparaisons entre la longueur nageoire amputée et régénéré, que le plan de l'amputation après la régénération des nageoires est pas identifiable dans larves de poisson zèbre.

1. Préparer une solution d'agarose de 0,5 à 1,2% faible point de fusion dans le milieu de l'embryon pour l'immobilisation de l'échantillon.
2. Chauffer l'agarose dans un four micro-ondes et de transférer le liquide d'agarose dans 1,5 ml tubes qui sont pré-chauffé à 42 ° C dans un bloc chauffant.
3. Laissez l'agarose chaude refroidir à 42 ° C, qui peut être maintenu pendant plusieurs semaines à cette température. Essayez d'éviter le pipetage larves dans agarose supérieure à 42 ° C, comme ce sera au détriment des animaux.
4. Anesthésier plusieurs larves en utilisant 10 ml de 0,4 mM tricaïne (pH 7) dans le milieu de l'embryon dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm. Préparer la tricaïne Selon le livre Recettes de poisson-zèbre ^18.
   1. Vous pouvez également utiliser 10 ml d'une dilution de 1: 1000 99% 2-phénoxyéthanol dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm. Poke les larves avec une pointe de pipette microloader plafonné pour évaluer leur réponse au toucher avant de continuer. Utilisez uniquement les larves non recevable.
5. Transférer une larve dans la solution de gélose à 42 C ° à l'aide d'une pipette Pasteur en verre. Ne pas transférer le liquide excessive dans l'agarose, sinon l'agarose sera trop dilué et non solidifier.
6. Jeter le liquide restant de la pipette et transférer la larve avec une goutte d'agarose dans une petite boîte de Petri (35 ou 60 mm de diamètre). Placez la larve de son côté pour l'imagerie de la nageoire caudale.
7. Laisser la gélose se solidifier. Évaluer l'agarose avec une pointe de pipette en plastique; la pointe se immerger dans l'agarose si elle est trop liquide. Une fois que l'agarose est solidifié, une petite indentation sera visible en touchant avec une pointe de pipette. Après solidification, ajouter la solution de tricaïne et passer à la loupe binoculaire qui sera utilisé plus tard pour imagerie time-lapse.
   Remarque: Cette étape peut également être réalisée en plaçant la larve anesthésié sur une boîte de Petri revêtue de 1,5% d'agarose dans du milieu d'embryon.
8. Utilisez un stéréomicroscope avec le logiciel time-lapse. Sélectionnez un objectif et grossissement approprié, qui sera utilisé plus tard pour l'imagerie time-lapse. Ici, utiliser un 3,5 x 16 mm, distance de travail objectif sur un stéréomicroscope. Comme souhaité, utiliser les microscopes et autres lentilles de l'objectif, mais choisir un grossissement appropriée pour tenir compte de xy-dérive et la croissance de la nageoire potentiel durant la procédure d'imagerie.
9. Sélectionnez le mode de détection de la caméra sur le microscope.
10. Dans le logiciel, sélectionnez le mode 'live' pour voir la larve à l'écran.
11. Ouvrez la fenêtre «Propriétés» pour détecter automatiquement la luminosité.
12. Régler manuellement le contraste au microscope de base trans-illumination.
13. Déplacez la larve sur le champ de vision et de sélectionner la fonction de correction d'ombrage pour minimiser fond pasISE.
14. Placez la larve de nouveau dans le champ de vision et prendre un instantané. Enregistrez l'image.
15. Retirer l'agarose de la larve d'abord gratter l'agarose de la tête. De cette façon, la larve peut être glissé hors de l'agarose en tirant doucement la tête loin de l'agarose restant avec une pointe de pipette microloader plafonné ou d'une goupille d'insectes.
16. Avec une pipette Pasteur en verre transférer la larve dans la solution de tricaïne frais.

4. Amputation Assay

1. Préparer une solution agarose à 1,5% en utilisant le milieu de l'embryon et versez une couche mince dans une boîte de Pétri. Laissez l'agarose solidifier.
2. Sous un stéréomicroscope, placez le latéral de larve sur le agarose solidifié et amputer la nageoire caudale avec une aiguille 23 G de la seringue avec une légère pression (figure 3A).

5. Montage de la Larve pour imagerie time-lapse

1. Procédez comme décrit dans les étapes 3.1 à 3.5 (figure 3B).
2. Transfert une baisse de 0,5 à 1,2% d'agarose liquide à 42 ° C contenant la larve dans l'anneau de chambre de l'imagerie (étape 2.1), orienter la larve et laissez l'agarose solidifier. Remplissez la bague avec une solution de tricaïne. Alternativement, si la chambre de boîte de Pétri (étape 2.2) est utilisé, la larve monter sur la lamelle de couvercle et remplir le couvercle avec une solution de tricaïne.
3. Pour permettre une bonne cicatrisation ou la régénération des tissus de se produire, soigneusement gratter la gélose entourant la queue distale fin en utilisant une pointe de pipette microloader plafonné ou d'une goupille d'insectes. Essayez de ne pas nuire à la nageoire de façon répétée (figure 3C).
4. Décanter la solution contenant le Tricaine retiré agarose et remplir l'anneau de chambre avec une solution de tricaïne frais.
5. Appliquer de la graisse de silicium en haut de l'anneau de chambre et fixer une lame de verre de 25 mm x 75 mm. Essayez d'éviter les poches d'air dans la chambre, car ils vont interférer avec l'imagerie de fond clair et dessécher la larve au fil du temps.
6. Si l'on utilise une boîte de Petri queune chambre de formation d'image, appliquer de la graisse de silicone sur le rebord supérieur du fond de chambre et remplir la chambre du bas avec une solution de tricaïne. Décanter avec soin la solution Tricaine dans le couvercle et retourner le couvercle d'immerger la larve dans la solution de tricaïne de la chambre inférieure à un léger angle pour éviter les poches d'air. La chambre sera scellé en raison de la graisse de silicium.

6. imagerie time-lapse

1. Assembler une chambre d'incubation chauffée comme décrit dans ^23,24 (Figure 4) .Positionner la chambre d'incubation dans le microscope et tourner sur la chaleur. Ajuster la température à 28 ° C pendant environ 10 à 20 min ou jusqu'à ce que la température se est stabilisée.
2. Ouvrir l'avant de la chambre d'incubation chauffée et placer la chambre de formation d'image sur le support de microscope avec le couvre-face vers le haut vers l'objectif.
3. Positionner l'ailette larvaire de manière à 2/3 du champ de vision reste inoccupé. Ceci assure la prise de lala croissance et la régénération de l'ailette au cours de la procédure d'imagerie sans avoir à repositionner la larve.
   1. Ajustez la larve montée à 28 ° C pendant ~ 30 min avant de commencer l'enregistrement time-lapse pour éviter les changements de l'intensité de fond clair ou des changements potentiels de l'agarose. Sinon, utiliser un tampon préchauffée à commencer imagerie après la réduction du temps de réglage.
4. Pour configurer l'enregistrement time-lapse, ouvrir la fenêtre 6D multidimensionnelle Acquisition dans le logiciel de Axiovision et sélectionnez l'option z-stack et time-lapse.
5. Facultatif) Dans l'onglet z-pile et mode Slice, sélectionnez l'épaisseur de la tranche et puis sélectionnez le mode Start / Stop.
6. Définir la position supérieure et inférieure de la pile.
7. Dans l'onglet time-lapse, sélectionnez l'intervalle et la durée du film et puis commencer le film en appuyant sur le bouton de démarrage. Nous avons constaté que des intervalles de 30 min sont suffisantes et cet intervalle ne génère pas de données excessive; Toutefois Shorteintervalles r peuvent être utilisés.
8. Vérifiez la position et z-stack dimensions au cours de la première heure si la larve n'a pas été pré-réglée. Si nécessaire, repositionner la larve nouveau après une journée, que la larve a peut-être changé.
9. Enregistrez le fichier à la fin de l'enregistrement time-lapse et procéder à la post-traitement et quantifications disponibles en utilisant le logiciel d'analyse d'image, tels que Imaris ²⁵ ou l'open source des logiciels Image J ²⁶ et ²⁷ Fidji.

7. Analyse des données

1. La détermination de la longueur de dérive.
   1. Ouvrez le film accéléré dans le logiciel d'imagerie et enregistrer les fichiers dans le format de fichier propriétaire pour améliorer les performances du logiciel.
   2. Sélectionnez la vue orthogonale à afficher différentes sections que les piles prévues. Pour la correction de la dérive, dans le menu Fidji, sélectionnez Plugins, puis l'enregistrement, et «la dérive 3D correcte '. Cela va ouvrir une fenêtre Fidji et effectuer les corrections de dérive. Correctla dérive de rotation dans la fonction Spots Imaris. Sinon, installer les plugins StackReg et TurboReg dans Image J et importer aux Fidji. Choisissez l'algorithme de transformation souhaitée dans le plugin StackReg.
   3. Pour mesurer les distances (par exemple, diamètre blesser ou longueur fin), sélectionnez l'option «ajouter de nouveaux points de mesure» dans la barre d'outils en haut à gauche.
      1. Sous «liste Configurer des Statistiques visibles valeurs 'dans le menu en bas à gauche, sélectionnez les valeurs statistiques à afficher.
      2. Dans le 'Mode Ligne »sous l'onglet Paramètres, sélectionnez« Paires (AB, CD ...) ».
      3. Dans 'étiquettes Propriétés de sélectionner «Nom» et «Distance», pour afficher la distance entre les points A et B à côté de la ligne de mesure.
      4. Passez en mode 'Edition' et maintenez la touche Shift pour sélectionner le premier point à la fin de la notochorde. Ensuite, utilisez la même configuration pour sélectionner le deuxième point à la marge distale fin.
      5. Sous l'onglet «Statistiques», sélectionnez le bouton de disque (Exporter tous) en bas à droite pour afficher et exporter la distance dans l'image.
      6. Répéter les mesures à des moments sélectionnés en déplaçant le curseur sous l'image vers la droite. Au lieu de créer de nouveaux points de mesure, les précédents peuvent être repositionnés en sélectionnant d'abord le point avec le bouton gauche de la souris, puis en appuyant simultanément sur le décalage et le bouton gauche de la souris à la nouvelle position.
   4. Alternativement à l'option des points de mesure, utiliser le spectateur de tranche pour mesurer les distances. Dans le mode d'affichage de la tranche, faites défiler jusqu'à une position désirée et cliquez sur la première et la deuxième position avec le bouton gauche de la souris. La distance est affichée. Toutefois, cette option ne permet pas pour l'exportation de données.
2. Déterminer la longueur des nageoires et zone dans ImageJ.
   1. Ouvrez le film time-lapse dans ImageJ utilisant un plugin qui reconnaît le format de fichier .zvi. Sinon, charger dans un QuickTime fichier ou une séquence de tiff.
      Remarque: Si vous utilisez un format de fichier TIFF non compressé, les dimensions de l'image ne ont pas besoin d'être spécifié.
   2. Si l'ouverture d'un format de fichier différent sans les informations de fichier, sélectionnez 'échelle Set' dans le menu 'Analyser' abord définir la distance d'image et l'unité. Dans le menu 'échelle Set', tapez le 'Distance en pixels », ci-dessous genre dans la distance connue' pour la valeur de pixel (ce qui peut être obtenu en mesurant le nombre de pixels sur une barre d'échelle qui a été ajoutée à l'image , puis cliquez sur Mesurer pour obtenir le résultat), et le «Unité de longueur" (typiquement «um»). Puis cliquez sur OK.
   3. Pour les mesures de la nageoire sélectionnez l'outil "Sélection Freehand 'dans la barre d'outils et décrivent les ailettes en maintenant le bouton gauche de la souris tout en tirant le long du contour de la nageoire. Pour les mesures de longueur de nageoire, sélectionnez l'outil en ligne «droite» et de tracer une ligne entre les points désirés êtremesuré.
   4. Cliquez sur l'option 'Mesure' sous 'Analyser' pour afficher la zone et de la longueur de la nageoire. Répétez cette étape aussi souvent que nécessaire pour les points de temps multiples du film.
3. Utilisation de logiciel de statistiques, les données peuvent être représentées graphiquement.

Results

La technique présentée est appropriée pour élucider la dynamique de la réparation des tissus, en réponse à l'amputation. Le film montre que l'amputation de la nageoire déclenche d'abord un cordon de bourse effet, caractérisé par des contractions par des câbles d'actine-myosine qui sont présents dans l'ailette ²⁸ fois (figure 5 A, B). Parallèlement, les cellules sont extrudées de la plaie (voir vidéo). La contraction peut donc être un moyen pour expulser les cellules qui sont susceptibles destinées à subir la mort cellulaire. Nos résultats montrent en outre que la croissance du développement de la larve se produit indépendamment de la régénération (film), alors que la régénération des nageoires ne lance pas jusqu'à environ 14 heures après l'amputation, telle que mesurée par la longueur des nageoires et la zone au cours de temps de 36 heures suite de l'amputation (Figure 5C , D). La croissance ailette de régénération total après 1,5 jours était d'environ 60% de la longueur initiale ailette (figure 5E). Pris ensemble, ces résultats démontrent que l'amputation tr Iggers contraction ailette, l'extrusion de cellules provenant de la plaie, et une réponse régénérative temporellement retardé. Alors que les cellules sont probablement extrudées destinées à subir la mort cellulaire, la nature de ces cellules doit encore être clarifiée.

Figure 1. Imagerie ensemble d'anneau de chambre

(A) représenté est un anneau en plastique qui est fixée à une lamelle couvre-objet avec de la graisse de silicone. Une maille en plastique est fixé à l'intérieur de la chambre avec quatre petits points de la graisse au silicone. (B) la chambre contenant la larve monté est rempli avec une solution de tricaïne et une lame de verre est fixé à la partie supérieure. (C) Un monté deux jours-larve (flèche) est représentée à plus fort grossissement pour dépeindre sa taille par rapport à la maille."_blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. chambre Imaging assemblage réalisé à partir des boîtes de Pétri. (A) Montré est un verre commerciale supérieure à fond de verre boîte de Pétri avec un filet de plastique attaché à la lamelle de verre. (B) montré est une chambre de boîte de Pétri pour elle-même avec un trou percé dans le couvercle et une lamelle couvre-joint de l'extérieur avec de la graisse de silicone. Le maillage et les larves sont montés à l'intérieur de la chambre contenant une solution de tricaïne. Pour sceller la chambre, de la graisse de silicium est appliqué à la, jante extérieure supérieure de la chambre inférieure et le couvercle supérieur fixé. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Schéma de l'amputation et de montage d'une larve pour l'imagerie. (A) Pour l'amputation, placer une larve anesthésiés sur une boîte de Pétri agarose-couché et amputer la nageoire caudale avec une aiguille de seringue. (B) Pour le montage, transférer la chenille avec une pipette de transfert dans un tube de 1,5 ml remplie de 42 ° C agarose liquide et pipeter une goutte contenant la larve dans la chambre d'imagerie, orienter le poisson et couvrent la solidification de l'agarose avec du milieu d'embryon. (C) Grattez l'agarose de la nageoire caudale à l'aide d'une pipette de microloader plafonné ou un outil similaire et remplacer moyen d'embryons avec du milieu frais. (D) image la nageoire caudale sous un stéréomicroscope. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. chambre d'incubation chauffée auto-construit. (AC) Montré est une chambre d'incubation chauffée en carton, du papier bulle et Velcro. Un chauffe-dôme filaire (à l'origine conçu pour l'incubation des oeufs de poulet) est attaché à la chambre à l'aide de ruban d'aluminium. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. dynamique de régénération Fin. (A) Schéma de la méthode de dosage de l'amputation et la quantification fin de queue utilisé pour déterminer la longueur de nageoire (flèche rouge) et de la zone (cadre rouge de la fin). (B) Tail amputation fin déclenche d'abord la contraction de la nageoire, suivie par regenerative excroissance tissulaire. L'ailette subit également la croissance du développement, comme le montre l'augmentation de la taille latérale. (C) indiquée est la longueur ailette en fonction du temps, indiquant un départ de la croissance linéaire de régénération à ~ 14 hpa. (D) La quantification de la zone ailette révèle une baisse initialement de taille, qui peut être attribuée à la contraction de l'ailette. Après ~ 14 h, les ailettes taille augmente à un rythme linéaire. (E) Comparaison de la longueur de nageoire avant l'amputation et après 36 h montre ~ 60% de reprise. Barre d'échelle: 100 um abréviations: pré-ampli, pré-amputation; heures après l'amputation, hpa; regen, la régénération; Ampère, l'amputation Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film . Fin régénération au cours de temps de 36h. Montré est une nageoire caudale d'une larve de 2,5 jours au cours de la régénération. À partir croissance régénérative 30 min après amputation est imagé par intervalles de 30 min sur un stéréomicroscope utilisant un objectif 3.5x.

Discussion

La méthode présentée permet d'observer la cicatrisation et la régénération des tissus à vivre larves de poisson zèbre avec l'imagerie in vivo time-lapse sur un stéréomicroscope fond clair, en utilisant un relativement simple set-up. Cette procédure nécessite certains aspects importants que nous avons testés, qui permettront d'optimiser le résultat: 1) De faibles concentrations d'agarose (~ 0,5%) permettra de minimiser les obstacles du poisson zèbre larves sans cesse croissante de croissance, 2) Suppression de la gélose autour de la nageoire est important de ne pas à masquer le processus de guérison, 3) de piégeage de l'agarose dans un maillage plastique retient l'agarose et de l'animal dans une position stable pendant toute la procédure, et 4) un environnement contrôlé en température correcte, ce qui est essentiel pour la viabilité des larves. Nous avons adapté une étuve d'incubation ^23,24, qui utilise le film à bulles qui est enregistré sur un carton, et un élément chauffant en forme de dôme filaire pour contrôler la température et la circulation de l'air avec des fluctuations minimales au cours de laprocédure d'imagerie. Cette chambre simple et rentable peut être préparé pour se adapter à ne importe quel microscope. Une chambre d'incubation chauffée similaire a été également utilisé pour les souris d'imagerie et le développement du poussin ^24,29.

Nous suggérons que les larves pré-amputée sont montés pour une image pré-amputation, amputation démonté, et remonté pour l'imagerie time-lapse. Bien qu'il soit possible d'effectuer ces étapes en une seule étape dans la chambre de formation d'image finale, d'après notre expérience, nous avons trouvé que amputer la nageoire caudale sur une lamelle de verre ne est pas optimale, car elle déchire le tissu et ne entraîne pas une coupe nette. La méthode d'amputation à base d'agarose en utilisant une aiguille de seringue a été initialement décrit par Kawakami et ses collègues (2004) ¹⁶ et est également, dans notre expérience, idéal pour effectuer les amputations. Ainsi, la série assez compliquée d'étapes que nous avons présenté est bien justifiée et garantit un résultat optimal de régénération.

Nous avons montré que larval poisson zèbre au 2 dpf peut être imagée jusqu'à 1,5 jours en agarose et la solution de tricaïne. Nous avons utilisé de tricaïne (pH 7) solution de pH optimisé préparé avec du sel de Instant Ocean, qui ne interfère pas avec la santé de l'échantillon pour la période d'imagerie présenté. Nous avons déjà cependant aussi démontré que l'utilisation de tricaïne en milieu Danieau permet imagerie time-lapse de 2,5 dpf poisson zèbre larvaire sur un microscope confocal pour au moins deux jours ^30. Ainsi, les conditions optimales de tampon peuvent se étendre santé larvaire et la longueur de formation d'image. Alternativement, des concentrations plus faibles de tricaïne peuvent être utilisés pour l'anesthésie, ou 2-phénoxyéthanol, que nous avons trouvé est bien toléré pendant les stades larvaires et les adultes à 28 ° C pendant au moins 60 h.

Pour éviter les défauts dans la régénération des nageoires, nous avons supprimé l'agarose de la nageoire caudale avant l'imagerie. Nos données montrent que moins de 1,5 jours, la nageoire est régénéré à environ 60%. Ce taux de régénération est compatible avec une étude antérieure définissant un 3 jourss un temps moyen pour nageoire caudale régénération larves de poisson zèbre jusqu'à 6 dpf ^16. Méthodes alternatives à l'agarose pourraient toutefois être utilisés pour monter le poisson pour l'imagerie. Par exemple, le plasma mince coagule ³¹ ou éthylène-propylène fluoré (FEP) tubes revêtus de la méthylcellulose et remplis avec des concentrations très faibles agarose (0,1%) ont été recommandées pour la microscopie nappe de lumière ³² et peut convenir pour notre méthode présentée. Cependant, nous ne recommandons pas la méthylcellulose et 0,1% d'agarose, comme ils exigent que l'échantillon sont montés au fond de la chambre en raison de l'absence de solidification de ces médias. Des concentrations très élevées de méthylcellulose seront en outre générer des poches d'air sur la base de notre expérience, et ceux-ci peuvent interférer avec la procédure d'imagerie. Si ces moyens sont préférés à l'aide de la chambre de fond, il est important qu'une distance de travail approprié entre la lentille d'objectif et l'échantillon est présent. Il convient de noter que méthylcellulose comme un milieu de montage ne ​​est recommandé que pour un maximum de 1 jour, car il peut interférer avec la santé des larves ^32.

Montage du spécimen dans le couvercle peut entraîner une tendance à la baisse lente gravitationnelle. Il est donc recommandé d'images multiples sections à chaque point de temps, qui peut être projeté dans un seul plan ou seulement les images qui sont dans le plan focal peut être extraite pour assembler le film final. Imagerie l'échantillon à la chambre inférieure pourrait être une autre méthode pour éviter la dérive vers le bas potentiel. caillots de plasma pourraient être utiles pour éviter la dérive, que le plasma se en tiendra à la couche externe enveloppante (EVL, périderme) ³¹ et peuvent donc stabiliser l'échantillon. Cela doit néanmoins être testée, ainsi que combien de temps le poisson zèbre larves peut être maintenue dans la formation de caillots de plasma sans interférer avec la santé des larves ou la régénération des nageoires.

Notre film a été assemblé en utilisant des sections individuelles (26 um)d'une pile z-enregistré, qui couvre toute l'épaisseur de l'ailette (~ 10 um) et qui représente la dérive de potentiel z de l'ailette au cours de la procédure d'imagerie. Afin de conserver l'information en 3-D, il est également possible de projeter z piles en images uniques. Parce que cela peut entraîner dans le flou de l'image, fond clair déconvolution peut être souhaitable. Logiciel, tel que Deconvolve ou X3 Autoquant pourrait être utilisé à cette fin. Alternativement, des algorithmes mathématiques (décrites dans Tadrous ³³⁾ peuvent être appliqués pour obtenir une fonction d'étalement de point de rapport signal sur bruit (SNR). Obtention d'un SNR élevé représente l'un des principaux obstacles à fond clair déconvolution. Bien que cette méthode nécessite un contraste élevé et l'épaisseur de l'échantillon mince, il serait approprié pour l'imagerie de la nageoire caudale en raison de sa largeur réduite.

Un net avantage de la méthode de formation d'image présentée est qu'elle est rapidement adaptable à tout stéréomicroscope équipé d'une une caméra CCDd logiciels time-lapse et offre une alternative à faible coût à plus coûteux systèmes d'imagerie confocale. Bien que cette méthode ne utilise pas de fluorescence pour la détection de cellules, il peut être étendu pour des applications en utilisant un système automatisé pour le contrôle de l'obturateur et de post-imagerie logiciel de déconvolution ^34. Cela permettrait aux utilisateurs d'observer davantage les processus de réparation et de régénération de la plaie avec une seule cellule ou une résolution subcellulaire sur des périodes de temps plus longues.

La clarté optique et la facilité avec laquelle des larves de poisson zèbre embryonnaire et peuvent être manipulés, et la capacité d'adaptation de cette méthode à toute stéréomicroscope le rend approprié pour l'enseignement de la biologie des vertébrés de base dans une salle de classe. Cette méthode peut fournir aux étudiants une meilleure compréhension des processus biologiques fondamentaux qui sous-tendent la réparation des tissus et la régénération. D'autres processus biologiques qui ont été capturées avec une méthode similaire sont le développement embryonnaire du poisson zèbre ^23,34 et cardiaquefonction (non publié). Cette méthode offre également la possibilité pour la réparation des plaies et la régénération de surveillance des larves qui ont été génétiquement manipulées et pharmacologiquement.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs
Bullseye Agarose	MidSci	BE-GCA500
Agarose à bas point de fusion	Fisher BioReagents	BP1360-100
1-phényl-2-thiourée	Alfa Aesar	L06690
Instant Ocean Aquarium Sel Animalerie	Bleu
méthylène (solution à 0,1 %)	Sigma	M9140
Tricaïne (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma-Aldrich	E10505
2-phénoxyéthanol	Sigma-Aldrich	77699
Boîte de Pétri 35 x 15 mm	BD Falcon	351008
Boîte de Pétri 60 x 15 mm	BD Falcon	351007
Boîte de Pétri 100 x 25 mm	BD Falcon	351013
Pipettes en verre boroschillate de 5,75 pouces	Fisher
35 mm Dessus en verre Plat inférieur en verre (Verre : 0,085-0,115 mm)	MatTek Corporation	D35-20-0-TOP
Lames de microscope Superfrost/Plus	Fisherbrand	12-550-15
Lamelles en verre	Services de microscopie électronique	72191-75
Plaques de protection en verre	Warner Instruments	CS-18R15
Phifer Phiferglass Moustiquaire Charbon de bois - 48"	Home Depot
Graisse sous vide poussé	Dow Corning
Microloader pointes de pipette 20 µ ; l	Eppendorf	930001007
Ciseaux fins -	Outils scientifiques fins	14037-10
3 ml Seringue jetable Luer-Lok&trade  ;	BD	309657
Seringue jetable Luer-Lok&trade ; 60 ml	BD	309653
aiguilles pour seringue 23 G	BD	305145
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath	MidSci
Discovery.V12 microscope composé  ;	Zeiss
Plan Apo S 3.5X	Zeiss
AxioCam MRm  ;	Zeiss
Axiovision, version 4.8.2SP1 (12-2011)	Zeiss