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Neuroscience

लंबे समय तक कैल्शियम इमेजिंग के लिए Agarose microchambers Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52742
Automatic Translation
1, 1, 1
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

Abstract

व्यवहार तंत्रिका तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है। कैल्शियम इमेजिंग Caenorhabditis विभिन्न व्यवहार दौरान न्यूरॉन्स की गतिविधियों को मापने के लिए एलिगेंस पारदर्शी निमेटोड में एक सरल तरीका है। व्यवहार के साथ तंत्रिका गतिविधि सहसंबंधी, पशु स्थिर नहीं किया जाना चाहिए, लेकिन स्थानांतरित करने के लिए सक्षम होना चाहिए। कई व्यवहार में बदलाव लंबे समय तराजू के दौरान हो और व्यवहार के कई घंटे से अधिक रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है। यह भी संस्कृति के लिए यह आवश्यक भोजन की उपस्थिति में कीड़े बनाता है। कैसे कीड़े सुसंस्कृत हो सकता है और उनके तंत्रिका गतिविधि लंबे समय पैमाने पर imaged कर सकते हैं? Agarose Microchamber इमेजिंग (एमी) ​​पहले संस्कृति विकसित करने के लिए और छोटे लार्वा का पालन और अब सी के वयस्क अवस्था तक जल्दी एल 1 से सभी के जीवन चरणों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है किया गया था एलिगेंस। एमी सी के विभिन्न चरणों के जीवन पर प्रदर्शन किया जा सकता है एलिगेंस। लंबे समय तक कैल्शियम इमेजिंग कॉम कम बाहर से चालू होने वाले जोखिम का उपयोग करके जानवरों immobilizing के बिना हासिल की हैआरोप युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा रिकॉर्डिंग गुणा एक इलेक्ट्रॉन के साथ bined। ज़ूम आउट करके या स्कैनिंग समानांतर में 40 कीड़े अप करने के लिए छवि के लिए इस विधि को पैमाने पर कर सकते हैं। इस प्रकार, एक विधि सी के सभी जीवन चरणों में लंबे समय के तराजू पर छवि व्यवहार और तंत्रिका गतिविधि के लिए वर्णन किया गया है एलिगेंस।

Protocol

1. उपकरण, संस्कृति, मीडिया, और व्यंजन

  1. ध्यान में नमूना रखने के लिए सक्षम है और कहा कि एक स्वत: मंच से सुसज्जित है कि एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। एक कस्टम बनाया ढक्कन हीटर बनाने या एक वाणिज्यिक समाधान की खरीद। कैमरे के लोगों तक पहुंचाने के निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर एक टीटीएल संकेत के माध्यम से रोशनी एलईडी चलाता है जिसमें एक एलईडी-EMCCD कैमरा प्रणाली स्थापित।
    नोट: जानकारी के लिए चर्चा देखें।
  2. Polydimethylsiloxan (PDMS) टिकटें:
    1. एक microfluidics सुविधा में PDMS टिकटों बनाना या एक वाणिज्यिक फाउंड्री द्वारा उत्पादित PDMS टिकटों की है। एक वाणिज्यिक फाउंड्री का उपयोग करने के लिए, डिवाइस के (उदाहरण के लिए 15 माइक्रोन) गहराई कंपनी के लिए एक AutoCAD फाइल भेजने और निर्दिष्ट करें। फाउंड्री से प्रसव के बाद, एक स्केलपेल का उपयोग अपने 16 डाक टिकटों में PDMS चिप काटा।
    2. हवा प्लाज्मा का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति के टिकट बांड। संबंधों के लिए, PDMS स्टांप और एक के लिए हवा प्लाज्मा के लिए गिलास स्लाइड दोनों का पर्दाफाशमुक्केबाज़ी 1 मिनट (0.5 एम्बार पर उच्चतम प्लाज्मा सेटिंग्स का उपयोग)। संबंधों के लिए सतहों प्लाज्मा उपचार के दौरान ऊपर की ओर का सामना करना सुनिश्चित करें। फिर, गिलास स्लाइड पर PDMS स्टांप जगह है।
  3. एक 3.5 सेमी नीचे पकवान ले लो और एक ऊर्ध्वाधर मिलिंग मशीन और तेज रोटरी कटर का उपयोग पकवान के नीचे के केंद्र से 18 x 18 मिमी के एक वर्ग क्षेत्र में कटौती। घर्षण द्वारा उत्पादित गर्मी की वजह से पिघलने से प्लास्टिक को रोकने के लिए कटर और धीमी गति से खिलाने की कम घूर्णन गति का प्रयोग करें। एक बार में कई व्यंजन तैयार करते हैं।
    नोट: नीचे पकवान प्रयोग के बाद कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है कि यह शुद्ध इथेनॉल हे / एन में भिगोने के बाद साफ किया जाता है।
  4. Agarose:
    1. 100 मिलीलीटर में 3 जी उच्च गलनांक agarose भंग एस बेसल (5.85 छ NaCl, 1 ग्राम कश्मीर 2 HPO 4, 6 ग्राम के.एच. 2 पीओ 4 इथेनॉल में, 1 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल (5 मिलीग्राम / एमएल), एच 2 ओ के लिए 1 एल, उबलते द्वारा) autoclaving द्वारा बाँझ। 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब और stor में agarose भंग की aliquots बनाओई। इसके अलावा, उच्च गलनांक agarose के रूप में ठीक उसी तरह कम पिघलने बिंदु agarose के एक बैच तैयार करते हैं।
    2. 98 डिग्री सेल्सियस - उपयोग agarose 95 पर एक हीटिंग ब्लॉक पर उच्च गलनांक के 3 aliquots के स्थान के लिए पहले। 35 डिग्री सेल्सियस - यह 30 पर एक हीटिंग ब्लॉक पर तो पिघल गया है और जब तक 98 डिग्री सेल्सियस - 95 में से agarose एक हीटिंग ब्लॉक पर, का उपयोग कम पिघलने बिंदु से एक विभाज्य स्थान के लिए पहले।

पशु 2. चुनाव

  1. पशुओं को साफ प्राप्त करने के लिए वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेटों पर एक कम घनत्व में कीड़े हो जाओ। भोजन और केवल कुछ जानवरों के बहुत प्लेट पर है कि वहाँ सुनिश्चित करें।
  2. इमेजिंग एल 1 लार्वा के लिए, एक ताजा वरीयता प्राप्त एन जी एम थाली पर एक प्रकार की रोटी चरण में भ्रूण युक्त बारे में 30 अंडे हस्तांतरण। बाद में लार्वा चरणों या वयस्क सी स्थानांतरित करने के लिए एलिगेंस, एक ताजा वरीयता प्राप्त एन जी एम थाली पर के बारे में 30 कीड़े हस्तांतरण।

Agarose microchambers 3. तैयारी

  1. पकवान की तैयारी:
    1. तल पर 18 x 18 मिमी के एक वर्ग खोलने के साथ एक प्लास्टिक पकवान ले लो और उल्टा ऊपर की ओर का सामना करना पड़ खोलने के साथ यह जगह। उद्घाटन पर 20 x 20 मिमी की दो तरफा चिपचिपा टेप का एक टुकड़ा रखकर उद्घाटन बंद करें। चिपचिपा टेप तल पर इतना है कि पकवान चारों ओर मुड़ें और एक कठिन सतह पर पकवान जगह है। नि: शुल्क एक स्केलपेल का उपयोग खोलने में कटौती।
    2. एक P1000 विंदुक का प्रयोग, पकवान में एस बेसल में 3% उच्च गलनांक agarose के 2 मिलीलीटर भरें। उद्घाटन के चारों ओर उस क्षेत्र पर agarose प्लेस और जमना। Agarose ठोस है जब तक प्रतीक्षा करें।
    3. डिश चारों ओर मुड़ें और चिपचिपा साइड डिश पर रहेगा और उजागर किया जाएगा तो यह है कि दो तरफा चिपचिपा टेप को शामिल किया गया है कि सुरक्षात्मक फिल्म छील।
      नोट: नतीजतन, चिपचिपा टेप का एक अच्छा अंगूठी उद्घाटन के बाहर चारों ओर जाएगा। agarose बाद में नमूना चारों ओर जाएगा कि एक नमी जलाशय के रूप में कार्य करता है।
  2. Microchambers की कास्टिंग:
    1. वें बेनकाब60 सेकंड - 20 के लिए हवा प्लाज्मा के साथ ढलाई के लिए ई PDMS सतह।
      नोट: यह प्लाज्मा उपचार हवा के बुलबुले के फँसाने से बचाता है और तेज प्रिंट पैदा करता है, जो PDMS हाइड्रोफिलिक सतह प्रदान करता है।
    2. 9 गिलास स्लाइड - 5 stacking द्वारा बराबर ऊंचाई की दो spacers का निर्माण। प्लेस, अपने लंबे पक्षों ने पहले स्पेसर हो चुकी है, तो एक गिलास स्लाइड, तो फिर एक स्पेसर स्टैक करने के लिए समानांतर में। स्पेसर्स भर orthogonally PDMS स्टांप होता है कि गिलास स्लाइड रखें। PDMS स्टांप की ढलाई की सतह और एक गिलास स्लाइड के बीच के बारे में 1.5 मिमी की जगह नहीं है तो यह है कि spacers के ऊंचाई समायोजित करें।
    3. PDMS तरल agarose में खड़ी स्टांप स्लाइड जल्दी PDMS स्टांप के पास एक गिलास स्लाइड पर गर्म तरल उच्च गलनांक agarose की एक बूंद प्लेस और। Agarose जमना। यह आमतौर पर के बारे में 2 मिनट लगते हैं जो एक अपारदर्शी उपस्थिति, हो जाता है कि जाँच करें। एक कदम के साथ खड़ी स्टाम्प बंद खींचो।
      नोट: यह जीएल के लिए सुविधाजनक हैUE स्पेसर दो तरफा चिपचिपा टेप के साथ एक साथ स्लाइड। स्टाम्प आंदोलन खड़ी agarose में फंस जाने से हवाई बुलबुले को रोकता है।
  3. एक ठीक प्लैटिनम तार पिकअप का उपयोग करने के agarose पर OP50 बैक्टीरिया के साथ मिलकर अंडे या कीड़े हस्तांतरण। एक बरौनी का उपयोग कर भोजन के साथ एक साथ एक अंडा या चैम्बर के प्रति एक कीड़ा बांटो। एक agarose पैड पर लगभग 30 अंडे भरें।
  4. यह पकवान के उद्घाटन में अच्छी तरह से फिट बैठता है, ताकि लगभग 15 x 15 मिमी के एक वर्ग में भर microchambers युक्त agarose के स्लैब में कटौती। संदंश के साथ वर्ग के agarose स्लैब उठाओ और 20 x 20 मिमी का एक गिलास coverslip पर यह उल्टा जगह है। एक बार गिरा, फिर इसे उठा या इस बैक्टीरिया और कीड़े उनके कक्षों के बाहर धक्का दे दिया जाने का कारण बन सकता है क्योंकि यह चारों ओर स्लाइड नहीं है।
  5. पकवान के विधानसभा:
    1. प्लास्टिक पकवान के उद्घाटन के अवसर पर कांच coverslip रखें। धीरे दो तरफा चिपचिपा टेप से बना अंगूठी पर कांच coverslip नीचे दबाएँ।कांच तोड़ने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    2. उल्टा पकवान मुड़ें और के बारे में 30 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा microchambers युक्त अगर स्लैब और तरल कम पिघलने बिंदु agarose साथ agarose जलाशय के बीच की खाई को भरने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें। Agarose जम गया है जब तक प्रतीक्षा करें।
    3. एक ढक्कन के साथ पकवान सील। औंधा माइक्रोस्कोप के लिए एक गर्म ढक्कन का उपयोग करें। ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए एक सामान्य ढक्कन का उपयोग और parafilm के साथ पकवान सील।
  6. Microchambers की तैयारी खत्म करने के बाद, एक stereomicroscope के तहत उन्हें जाँच करें। सही भरने के लिए महत्वपूर्ण है। विवरण के लिए चर्चा देखें।

4. कैल्शियम इमेजिंग

  1. ऐसे HBR16 27 ([pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: UNC-54-3'UTR, UNC-119 (+)] goeIs5) के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसर व्यक्त ट्रांसजेनिक उपभेदों का प्रयोग करें।
  2. व्यापक क्षेत्र epifluorescence के लिए सुसज्जित एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें। करने के लिए EMCCD कैमरे की टीटीएल उत्पादन कनेक्टकैमरे नमूना प्रबुद्ध किया जाएगा एक फ्रेम कि रिकॉर्ड हर बार इतनी एलईडी के टीटीएल इनपुट,। के बारे में 5 मिसे के एक जोखिम समय का उपयोग करें। 50-300 की सीमा में ईएम लाभ का उपयोग करें।
  3. हर 15 imaged किया जा रहा प्रत्येक कीड़ा के साथ 24 घंटे के लिए एक फट फिल्म चल निर्दिष्ट - तो पहले 30 मिनट डीआईसी के साथ 20 सेकंड के लिए, GCaMP रिकॉर्ड, और फिर mKate2 संकेत के अंतिम छवि लेने के लिए एक GFP प्रतिदीप्ति के साथ 20 सेकंड के लिए ले जाया जाता है अभिव्यक्ति के स्तर के लिए नियंत्रण। प्रत्येक फट के दौरान 2 / सेकंड के एक फ्रेम दर का प्रयोग करें।
  4. दृश्य डेटा निरीक्षण के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता में छोटे परिवर्तन की दृश्यता को बढ़ाने के लिए एक झूठी रंग नक्शे का उपयोग करें। एफ प्रतिदीप्ति की औसत आधारभूत मूल्य जा रहा है के साथ ΔF / एफ के रूप में प्लॉट फ्लोरोसेंट डेटा। कैल्शियम डेटा विश्लेषण का एक विस्तृत वर्णन साहित्य 20 में पाया जा सकता है।

एकाधिक कीड़े 5. समानांतर एमी

  1. खुर्दबीन पर microchambers युक्त पकवान प्लेस नमूना पर ध्यान केंद्रित करने और autofo संलग्नग्राहकों। कैमरा कीड़ा प्रति 1,920 फ्रेम, डेटा का एक उचित मात्रा में परिणाम होगा जो 24 घंटा, के लिए 20 सेकंड में हर आधे घंटे 40 छवि फ्रेम के एक फट प्राप्त कर लेता है तो यह है कि एक सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल सेट करें। यह मंच का उपयोग कर प्रत्येक कीड़ा का दौरा किया तो यह है कि स्कैन सेट करें। एक समय में लगभग 30 कीड़े फिल्म करने के लिए निशाना लगाओ।
  2. एक कम बढ़ाई उपयोग करते हुए, यानी, बाहर zooming द्वारा छवि कई कीड़े। कैमरा चिप के साथ कई microchambers को कवर किया और एक साथ कई आसन्न microchambers फिल्म के लिए एक कम बढ़ाई प्रयोग करें। छवि अधिग्रहण के अंत के बाद, एक जानवर को कवर ब्याज की एक क्षेत्र फसल से प्रत्येक व्यक्ति के चैम्बर के लिए डेटा अलग।
  3. जल्दी गतिशीलता डेटा का आकलन करने के लिए, फ्रेम घटाव 28-32 का उपयोग करें।

सी 6. इमेजिंग अलग जीवन चरणों एलिगेंस

  1. सी के सभी जीवन चरणों के लिए agarose microchambers का प्रयोग करें एलिगेंस एल 1 से वयस्क और सहित dauers करने के लिए। अलग के लिए उपयुक्त कक्ष आयामों का प्रयोग करेंतालिका 1 में दिखाया जाता है कि अलग जीवन चरणों।
जीवन की अवस्था चैंबर आकार चैंबर गहराई ठेठ रिकॉर्डिंग समय बढ़ाई
एल 1 190 X 190 माइक्रोन 10 - 15 माइक्रोन अंडा - मध्य एल 2 400X
एल 2 370 X 370 माइक्रोन 15 माइक्रोन अंडा - L3 200X
Dauer लार्वा 370 X 370 माइक्रोन 25 माइक्रोन चार दिन 200X
L3 700 X 700 माइक्रोन 45 माइक्रोन एल 2 - L4 200X
L4 700 X 700 माइक्रोन 45 माइक्रोन युवा L4 - युवा वयस्क 100X
युवा वयस्क 700 X 700 माइक्रोन 45 माइक्रोन 12-24 घंटा 100X

अलग जीवन चरणों के लिए तालिका 1. चैंबर आकार। दिखाए जाते हैं एक 8 x 8 मिमी कैमरा चिप के लिए अनुकूलित विभिन्न चरणों के लिए उपयोगी होते हैं कि चैम्बर आयामों और आवर्धन।

Representative Results

Agarose microchambers सी के किसी भी जीवन स्तर के लिए लागू किया जा सकता है एलिगेंस। चित्रा 1 ए में देखा जा सकता है, एल 1 lethargus दौरान लार्वा विकास और नींद व्यवहार देखा जा सकता है। गहरी 190 X 190 माइक्रोन, 10 माइक्रोन हैं कि चैम्बर आकार रहे हैं दिखाया गया है। लंबे समय के तराजू आवश्यक हैं, बड़े कक्षों में इस्तेमाल किया जा सकता है। बड़ा आयाम (370 X 370 माइक्रोन, 25 माइक्रोन गहरी) के साथ एक कक्ष का उपयोग, चित्रा 1 बी में देखा जा सकता है सी के विकास की अनुमति देता है एलिगेंस अंडे से वयस्क होने तक। चित्रा 1C वयस्क तक अंडे से एक कक्ष में उगाई जाने वाली एक कीड़ा के फ्रेम घटाव का उपयोग कर व्यवहार में लंबी अवधि के परिवर्तन के एक विश्लेषण से पता चलता है। जगा और lethargus के दौरान चयनित फटने के लिए फ्रेम घटाव के बाद मतलब तीव्रता दिखाए जाते हैं। कीड़ा की गतिशीलता कम, फ्रेम घटाव मूल्यों के बाद मतलब तीव्रता कम है। दिखाए गए एक मद्देनजर हालत और लार्वा चरण के प्रति एक lethargus हालत से फट निशान चयन कर रहे हैं।विकास के दौरान मतलब तीव्रता में मनाया वृद्धि जानवर की वृद्धि हुई इसके विपरीत है और आकार के कारण ज्यादातर है। चित्रा -1 एक Dauer लार्वा, पर्यावरण पर प्रतिकूल स्थितियों 33 के दौरान लगी हुई है कि एक विकल्प के जीवन स्तर को दर्शाता है। चैंबर आकार 370 X 370 माइक्रोन, 15 माइक्रोन गहरा है। Dauer लार्वा चरण से बाहर निकलने का कारण होता है, जो Dauer लार्वा बैक्टीरियल बिना भोजन कक्ष में रखा गया था कि ध्यान दें। चित्रा 1E पहले से ही चेंबर में कई अंडे रखी है कि एक वयस्क कृमि से पता चलता है। वयस्क के लिए इस्तेमाल किया चैंबर आयाम गहरी 700 X 700 माइक्रोन, 45 माइक्रोन थे। अंत में, चित्रा 1F एक वयस्क उभयलिंगी और एक वयस्क के कक्ष के अंदर एक पुरुष संभोग से पता चलता है।

गतिशील कीड़े में कैल्शियम इमेजिंग। GCaMP कैल्शियम सेंसर के साथ संभव है 2A, एक L1 लार्वा 27 के लिए आदेश interneuron AVA बी शो कैल्शियम इमेजिंग आंकड़े। -2 सी SA के लिए कैल्शियम सक्रियता दिखाई डी, आंकड़ेएक वयस्क जानवर में न्यूरॉन की मुझे प्रकार।

लंबी अवधि के इमेजिंग स्केलिंग स्कैनिंग द्वारा और बाहर zooming द्वारा ही संभव है। 3 ए 5 मेगापिक्सल कैमरे के साथ एक कैमरा चिप पर 30 कीड़े के साथ इमेजिंग की छवि गुणवत्ता को दर्शाता है। 3B चित्रा एक साथ imaged 4 कीड़े कैल्शियम की छवि गुणवत्ता से पता चलता है।

चित्र 1
सी के सभी जीवन चरणों के लिए एमी 1. अनुकूलन चित्रा 190 X 190 माइक्रोन कक्षों में जल्दी एल 2 चरण तक जल्दी एल 1 से imaged एलिगेंस। (ए) के लार्वा। एक 370 X 370 माइक्रोन कक्ष में वयस्क तक अंडे से (बी) के विकास। एक कीड़ा (सी) गतिशीलता फ्रेम घटाव का उपयोग कर का आकलन किया। प्रत्येक लार्वा स्टेशन के लिए एक चयनित फट फिल्म के लिए फ्रेम घटाव के बाद छवि के सभी चित्रों का मतलब तीव्रता दिखाया गया हैजगा और lethargus व्यवहार के लिए जीई। एक 370 X 370 माइक्रोन कक्ष में भोजन के अभाव में (घ) एक Dauer लार्वा। एक 700 X 700 माइक्रोन कक्ष में रखी कई अंडे के साथ (ई) वयस्क द्विलिंग। (एफ) एक पुरुष के संभोग और एक 700 X 700 माइक्रोन कक्ष के अंदर एक द्विलिंग। हां युवा वयस्क मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एमी के साथ चित्रा 2. कैल्शियम इमेजिंग। AVA एनएमआर-1 प्रमोटर का उपयोग कर एल 1 लार्वा की कमान interneuron में GCaMP3 साथ (ए) कैल्शियम इमेजिंग। दो झूठे रंग चित्र दिखाए जाते हैं। बाएं छवि में, AVA की गतिविधि कम है और कीड़ा एक पीछे की ओर आंदोलन नहीं कर रही है। सही छवि में Ava की गतिविधि है उच्च, और कीड़ा पीछे की ओर बढ़ रहा है। एक L1 कृमि के लिए समय के साथ (बी) कैल्शियम यात्रियों। (सी, डी) एक वयस्क जानवर में कैल्शियम यात्रियों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
बाहर zooming द्वारा समानांतर में चित्रा 3. इमेजिंग कई कीड़े। (ए) एक साथ 190 x 190 माइक्रोन कक्षों का उपयोग कर फ्रेम प्रति 30 एल 1 कीड़े की इमेजिंग और एक 100X बढ़ाई (एक 10x उद्देश्य का उपयोग) और एक 16.6 x 14 मिमी कैमरा चिप। (बी) 370 X 370 माइक्रोन कक्षों और 100X बढ़ाई और एक 16.6 x 14 मिमी कैमरा चिप के ब्याज की एक क्षेत्र का उपयोग कर फ्रेम प्रति चार L3 के कीड़े के साथ इमेजिंग।एट = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हार्डवेयर

एक माइक्रोस्कोप का फोकस आम तौर पर लंबी अवधि छवि अधिग्रहण के दौरान बहाव जाएगा। यौगिक सूक्ष्मदर्शी के लिए, ध्यान केंद्रित रखते हुए सिस्टम प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माताओं से खरीदा जा सकता है। ध्यान नियंत्रण के साथ एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी भी pricy है मामले में, एक सरल विकल्प एक stereomicroscope का उपयोग करने के लिए किया जाएगा। यौगिक सूक्ष्मदर्शी उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ उद्देश्यों के उपयोग की अनुमति है और आसानी से स्वचालित किया जा सकता है। 40X तेल उद्देश्यों को अच्छी तरह से उपयुक्त हैं। पानी विसर्जन लेंस क्योंकि लंबी अवधि के इमेजिंग के दौरान वाष्पीकरण के आदर्श नहीं हैं। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) रूपात्मक और व्यवहार में बदलाव का पालन करने में मदद करता है कि एक अच्छा इसके विपरीत उत्पन्न करता है, लेकिन सरल उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। डीआईसी या उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के लिए, माइक्रोस्कोप के व्यास-रोशनी पथ में एक लाल बत्ती फिल्टर रखकर लाल बत्ती का उपयोग करें। कई microchambers की स्कैनिंग के लिए एक स्वचालित चरण के लिए आवश्यक है। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन एसी हैएक मंच अरेखीय त्वरण और मंदी है और स्कैनिंग के दौरान जानवरों को परेशान करने से रोकने के लिए कम गति स्कैन करने के लिए सेट किया जा सकता है कि प्रयोग किया जाता है जब hieved। हम कृमि के mechanosensitive प्रणाली को सक्रिय नहीं कर रहा है कि वास्तव में धीमी गति से स्कैनिंग का सुझाव व्यवहार प्रतिक्रियाओं या स्कैनिंग के दौरान mechanosensitive न्यूरॉन्स (एएलएम और पीएलएम) में कैल्शियम वृद्धि हुई है, देखा नहीं है (डेटा) नहीं दिखाया। वाणिज्यिक एलईडी प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है। कई कंपनियों ने अलग अलग तरंग दैर्ध्य में एल ई डी भी शामिल है कि तैयार करने के लिए उपयोग समाधान प्रदान करते हैं। एलईडी बाहर से एक टीटीएल संकेत के साथ एलईडी ट्रिगर का विकल्प होना चाहिए। एक बेहद संवेदनशील कैमरे जानवरों हिलाने की कैल्शियम इमेजिंग के लिए आवश्यक है। EMCCD कैमरों के बाजार पर सबसे संवेदनशील कैमरों रहे हैं। कैमरे के प्रदर्शन के दौरान एक टीटीएल उत्पादन (भी बुलाया "आग" उत्पादन) की जरूरत है। एक ढक्कन हीटर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग अगर ढक्कन पर संक्षेपण को रोकने के लिए आवश्यक है। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर, पकवान रखा जाएगा तो यह है कि ढक्कन वाईतल पर हो सकता है और करूँगा इस प्रकार संक्षेपण को रोका जाता है और कोई ढक्कन हीटिंग की आवश्यकता है। ढक्कन लंबी अवधि इमेजिंग के दौरान पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पकवान को बंद कसकर चाहिए।

PDMS टिकटें

agarose ढलाई के लिए संरचना में शामिल है कि PDMS स्टांप की सतह दूर PDMS स्टांप का समर्थन करता है जो गिलास स्लाइड से सामना किया है। कस्टम microfluidic चिप्स का प्रस्ताव है कि कंपनियों के साथ एक सूची विकिपीडिया पर (पाया जा सकता है http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies )।

उनके कक्षों में नेमाटोड भरना

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है और निम्नलिखित बातों पर विचार किया जाना चाहिए: ए) agarose की नमी कीड़े स्थानांतरित करने के लिए और इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। Agarose यानी, भी नम है, तो एक तरल cov नहीं हैकई microchambers के एक क्षेत्र ering, यह तरल बैक्टीरिया दूर प्रवाह कर देगा क्योंकि एक नियंत्रित तरीके से बैक्टीरिया का भोजन और कीड़े वितरित करने के लिए संभव नहीं होगा। Agarose भी सूखा है तो बैक्टीरिया और कीड़े वृद्धि हुई बल आसानी से agarose करने के लिए नुकसान का कारण बनता है, जो कीड़े और बैक्टीरिया ड्रॉप करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है जिसका मतलब है कि आसानी से ले बंद नहीं मिल सकता है। कीड़े का एक बहुत में भरने जब agarose सूख सकता है। सबसे खराब स्थिति में agarose कक्षों गिर जाएगा कि अंत में तो सूखी हो जाएगा। Agarose भी सूखा है, तो यह कोई कीड़े रहे हैं जहां चिप के किनारे पर एक छोटी सी बूंद एस बेसल के (लगभग 2 μl) रखकर rehydrated जा सकता है। फिर तरल में लेने प्लैटिनम तार डुबकी और भी कक्षों कीड़े से भर रहे हैं जहां क्षेत्र में तरल में से कुछ खींच। बी) भोजन की राशि लंबी अवधि के सफल इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। पर्याप्त भोजन नहीं है, तो, कीड़े इसे से बाहर चला सकते हैं। अत्यधिक भोजन कक्ष के गुहा अगर वहाँएक तरल की तरह बल्कि एक ठोस की तरह व्यवहार नहीं किया जाएगा और कीड़े बैक्टीरिया से दूर धकेलने के द्वारा चैम्बर से बचने के लिए अनुमति देगा। पूरे चैम्बर भरता है कि एक जीवाणु निलंबन प्राप्त करने के लिए निशाना लगाओ। कीड़े प्रयोग के दौरान उनकी लंबाई से भी ज्यादातर साथ अगर और कांच की सतह के साथ लगातार शारीरिक संपर्क में हैं और रेंगने व्यवहार तरल में ताड़ना के लिए एक थाली पर आंदोलन करने के लिए इसी तरह की और भिन्न प्रतीत होता है। प्रयोग को बर्बाद कर सकता agarose के हानिकारक सी) यांत्रिक। एक ठीक लेने के लिए आवश्यक है। यह तेज कोनों नहीं होना चाहिए। एक pipet टिप से जुड़ी एक नरम बरौनी एक प्लेटिनम लेने का उपयोग करने के बजाय कक्षों में बैक्टीरिया या कीड़े स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, हालांकि, overdried agarose क्षति का कारण है। लेने या बरौनी, आदर्श, केवल मात्र कीड़े और बैक्टीरिया से दूर खींच चाहिए agarose सतह पर agarose ही है, और पानी की फिल्म छूना चाहिए। कक्षों को सील करते हैं, फिर से, agarose की नमी आवश्यक है। वहाँ नहीं करना चाहिएइस सीलिंग के दौरान बैक्टीरिया और कीड़े को धो सकता है क्योंकि agarose सतह पर किसी भी मुक्त तरल हो। बड़े बुलबुले धीरे अगर स्लैब के एक कोने उठाने के द्वारा हटाया जा सकता है। अक्सर कक्षों के अंदर फंस कक्ष की तुलना में छोटे होते हैं कि छोटे बुलबुले। ये बुलबुले एक समस्या नहीं हैं और अवशोषण से गायब हो जाएगा। डिश कोडांतरण के बाद, agarose भी सूखा या गीला भी नहीं है कि फिर से जाँच करें। कक्षों अच्छी तरह से बंद किया जाना चाहिए और कक्षों के बीच तरल के किसी भी प्रवाह नहीं होना चाहिए। Agarose भी गीला है, कक्षों ठीक से सील नहीं किया जाएगा। कीड़े से बच सकता है या उनके भोजन धुल किया जाएगा। नमूना भी नम है, तो साधारण ढक्कन खोलने के लिए और एक या दो मिनट के लिए agarose सूखा। Agarose भी सूखा है, तो कक्षों गिर सकता है और कीड़े से बच जाएगा।

ज़ूम आउट करने से स्केलिंग

प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, बाहर zooming कम आवर्धन पर प्राप्त प्रकाश की कम मात्रा से सीमित है। इसके अलावा, ईMCCD कैमरों संवेदनशीलता के लिए अनुकूलित है और अक्सर एक अपेक्षाकृत कम संकल्प किया जाता है। हालांकि, इमेजिंग चार गुना तक स्केलिंग अच्छी तरह से संभव है। 140X (एक 20x उद्देश्य और एक 0.7X कैमरा माउंट का उपयोग करके प्राप्त) बढ़ाई और एक 512 x 512 पिक्सेल, 8 x 8 मिमी कैमरे का उपयोग करते समय उदाहरण के लिए, 190 माइक्रोन X 190 माइक्रोन के चार कक्षों एक फ्रेम पर फिट कर सकते हैं। (जैसे sCMOS कैमरा, 16.6 मिमी x 14 मिमी चिप, 2560 X 2560 पिक्सल = 5.5 मेगापिक्सेल) के रूप में एक बड़ी चिप के साथ एक उच्च संकल्प कैमरा डीआईसी और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के ऊपर स्केलिंग का अनुकूलन। एक 100x बढ़ाई का उपयोग करते समय उदाहरण के लिए, 190 माइक्रोन में 30 एल 1 कीड़े अप करने के लिए एक्स 190 माइक्रोन कक्षों (चित्रा 3 देखें) इस कैमरे के हर फ्रेम पर फिट कर सकते हैं। सिद्धांत रूप में, बाहर zooming और स्कैनिंग भी पशुओं के भी अधिक से अधिक संख्या प्राप्त करने के लिए जोड़ा जा सकता है। केवल एक ही फोकल हवाई जहाज़ imaged किए जाने की जरूरत है, ताकि अधिकांश न्यूरॉन्स, ध्यान केंद्रित करने में काफी अच्छी तरह से रहते हैं। न्यूरॉन्स एक piezo ड्राइव का उपयोग स्कैन AZ, ध्यान से बाहर ले जाने के लिए पाए जाते हैं, तो हर बार पी में लिया जा सकता हैoint।

अलग व्यवहार के लिए अनुकूलन

इस प्रोटोकॉल लंबे समय के तराजू भर में व्यवहार का एक अच्छा विचार देता है। जाहिर है, फटने के समय अलग व्यवहार और जीवन चरणों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

तकनीक की सीमाएं

कई कारकों इमेजिंग की अवधि सीमा। सबसे महत्वपूर्ण भोजन की राशि है। भोजन का सेवन किया है एक बार, लार्वा के विकास को रोकने के। इस प्रकार, छोटे कक्षों में (190 X 190 माइक्रोन) कीड़े L3 के स्तर तक विकसित करने और फिर गिरफ्तार। अब इमेजिंग समय की आवश्यकता है, बड़ा कक्षों का इस्तेमाल किया जाना है। 3 दिन - लंबी अवधि के इमेजिंग की अधिकतम अवधि में 2.5 की सीमा में है। अब इमेजिंग की आवश्यकता है, कीड़े बरामद किया है और नए कक्षों में रखा जाना चाहिए। वयस्क कीड़े जब इमेजिंग, एक और सीमा ये कीड़े की संतानों के कारण होता है। वयस्क कीड़े जो लार्वा पक्षियों के बच्चे से अंडे देते हैं। ये लार्वा भी कक्ष के अंदर रहना होगा, भोजन का उपभोग, और छवि विश्लेषण को परेशान कर सकते हैं। संतानों एक समस्या है, तो एक समाधान बाँझ वयस्कों उपयोग करने के लिए या तो या ताजा कक्षों में कीड़े बार-बार जगह है। कीड़े को ठीक करने के लिए, कक्ष युक्त agarose स्लैब एक स्केलपेल के साथ नि: शुल्क काट रहा है, coverslip के बंद खींच लिया है, और कीड़े बरामद किया जा सकता है, जिसमें से एक एन जी एम थाली पर रखा गया है। एक और सीमा अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्रों में कीड़े का प्रतिबंध नहीं है। लंबी दूरी के आंदोलन का विश्लेषण करने की जरूरत है, तो यह एक समस्या हो सकती है। कक्षों में पशुओं यंत्रवत् और optogenetically 21,27,34,35 प्रेरित किया जा सकता है, चैंबर के सील प्रकृति यह मुश्किल घुलनशील या अस्थिर उत्तेजक लागू करने के लिए कर देगा। ऐसे ऑक्सीजन या कार्बन डाइऑक्साइड के रूप में biologically महत्वपूर्ण गैसों अगर में स्वतंत्र रूप से फैलाना कर सकते हैं। डिश में बड़े हवाई जलाशय प्रयोगों के लिए आवश्यक समय के साथ लगातार कक्षों में गैस की सांद्रता रखना चाहिए। हालांकि, यह मन है कि स्थानीय ऑक्सीजन concentratio में रखा जाना चाहिएएन चैम्बर में अधिक प्लेट पर संस्कृति की तुलना में तरल संस्कृति में पाया स्थितियों के सदृश हो सकता है।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

Microfluidic उपकरणों की बहुत सी में अध्ययन व्यवहार और विकास उन्नत है एलिगेंस। अक्सर, microfluidic संरचनाओं PDMS 12 के बने होते हैं। यहाँ हम agarose से बनाया microfluidic संस्कृति कक्षों पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। इस तकनीक की ताकत उच्च गुणवत्ता इमेजिंग, शारीरिक माप, लंबी अवधि के इमेजिंग, और एक हद तक उच्च throughput के साथ व्यवहार के संबंध का संयोजन है। उच्च छवि गुणवत्ता उच्च एनए उद्देश्यों का उपयोग गिलास coverslip के माध्यम से इमेजिंग द्वारा हासिल की है। नतीजतन, जैसे कैल्शियम इमेजिंग और subcellular संरचनाओं की confocal इमेजिंग के रूप में प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन किया जा सकता है। जानवरों के अन्य प्रणालियों में की तरह स्थिर नहीं कर रहे हैं, क्योंकि यह शारीरिक माप के साथ व्यवहार का एक संबंध की अनुमति देता है। Because जानवरों पर्याप्त भोजन है, वे लंबी अवधि के इमेजिंग की अनुमति के विकास जारी है। इस प्रणाली के जानवरों को उनके परिभाषित कक्षों के लिए एक समय में छवि कई कीड़े प्रतिबंधित कर रहे हैं कर सकते हैं। इस प्रकार, इस विधि को आसानी से 9,27,34-36 को बढ़ाया जा सकता है।

भविष्य अनुप्रयोगों

अब तक, इस प्रणाली सी में नींद व्यवहार का अध्ययन करने के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है एलिगेंस एल 1 लार्वा। हालांकि, सभी चरणों के लिए अनुकूलन के लिए यह संभव भी dauers और वयस्कों में व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए कर देगा। व्यवहार का एक विस्तृत सरणी संभोग से अंडे बिछाने को लेकर इस तकनीक के साथ अध्ययन किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

मैक्स प्लैंक सोसायटी और एचबी करने के लिए एक गौटिंगेन ग्रेजुएट स्कूल जूनियर ग्रुप वजीफा इस काम से वित्त पोषित।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High melting point agarose Fisher Bioreagents BP(E)164-1000
Top Vision low melting point agarose Thermo Scientific R0801
LED system CoolLED pE-2
Compound microscope Nikon TiE
Stereomicroscope Leica M5
EMCCD camera Andor iXon 897 now sold as iXon Ultra 897
sCMOS camera Andor Neo
Plasma cleaner Harrick PDC-23G2
Lid heater MPI workshop custom made
Plastic dish Falcon 08-757-100A
Z-stage for the microscope Prior Nano Scan Z
X-Y stage for the microscope Prior Proscan III
PDMS stamp Abbott Laboratories custom made
Red light filter Chroma ET660/50m
35 mm Petri dish Falcon Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning
Double sided sticky tape Sellotape/Henkel double sided 25 mm x 33 m alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.

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तंत्रिका विज्ञान अंक 100, मॉडल जीव तंत्रिका जीव विज्ञान microfluidics कैल्शियम इमेजिंग व्यवहार
लंबे समय तक कैल्शियम इमेजिंग के लिए Agarose microchambers<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em
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Turek, M., Besseling, J., Bringmann, … More

Turek, M., Besseling, J., Bringmann, H. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (100), e52742, doi:10.3791/52742 (2015).

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