Abstract
Les récents progrès dans l'application des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMMSC) pour le traitement des tendons et des ligaments blessures chez le cheval suggèrent une amélioration des mesures de résultats dans les deux études expérimentales et cliniques. Bien que le BMMSC sont implantés dans la lésion du tendon en grand nombre (généralement 10 - 20 millions de cellules), seul un nombre relativement faible de survivre (<10%), bien que ceux-ci peuvent persister jusqu'à 5 mois après l'implantation. Cela semble être une observation commune dans d'autres espèces où BMMSC ont été implantés dans d'autres tissus et il est important de comprendre quand cette perte se produit, combien survivre au processus d'implantation initiale et si les cellules sont effacés dans d'autres organes. Le suivi le devenir des cellules peut être réalisée par marquage radioactif de la BMMSC avant l'implantation qui permet non invasive de l'imagerie in vivo d'emplacement de cellule et quantification du nombre de cellules.
Ce protocole décrit une labeli cellulaireng procédure qui utilise le technétium 99m (Tc-99m), et le suivi de ces cellules après implantation dans tendons fléchisseurs blessés chez les chevaux. Tc-99m est un (t 1/2 de 6,01 hr) isotope de courte durée qui émet des rayons gamma et peut être internalisé par les cellules en présence du composé d'oxime hexamethylpropyleneamine lipophile (HMPAO). Ces propriétés, il est idéal pour une utilisation dans les cliniques de médecine nucléaire pour le diagnostic de nombreuses maladies différentes. Le sort des cellules marquées peut être suivi à court terme (jusqu'à 36 h) par scintigraphie gamma de quantifier à la fois le nombre de cellules retenues dans la lésion et la distribution des cellules dans les poumons, la thyroïde et d'autres organes. Cette technique est adaptée de l'étiquetage des leucocytes du sang et pourrait être utilisé pour l'image implanté BMMSC dans d'autres organes.
Introduction
Stratégies de régénération pour la réparation des tissus malades ou endommagés sont basées sur des cellules souches multipotentes dérivées d'une variété de tissus et implantés dans la zone touchée. Les récents progrès dans l'application des autologue BMMSC pour le traitement de tendon et les lésions ligamentaires chez le cheval ont montré l'amélioration des mesures de résultats à la fois expérimentale 1-5 et 6 études cliniques. Le cheval est un modèle particulièrement intéressant pour évaluer l'efficacité des cellules souches traitements liés, car il souffre d'âge et surmenage des blessures liées à des tendons de la patte antérieure distale, il est un animal athlétique, et il est un grand faciliter la récupération, de la moelle osseuse et implantation précise. Tendon blessures guérissent naturellement avec la fibrose, mais le tendon guéri est fonctionnellement inférieure 7 et présente un risque élevé d'une nouvelle blessure 8. Le tendon fléchisseur superficiel du doigt (SDFT) est le plus souvent affecté tel qu'il a évolué à agir comme une énergie élastiquemagasin et expériences chargement élevé souligne pour atteindre l'efficacité énergétique et de la locomotion à grande vitesse. Fonction Restauration après une blessure est donc essentiel. Ces blessures sont similaires à ceux touchant le tendon d'Achille chez l'homme qui remplit une fonction similaire 9. Il n'y a pas de bonnes options de traitement pour traiter ou atteindre bon état pour de telles blessures, les stratégies de régénération à base de cellules offrent donc une opportunité intéressante pour améliorer les résultats et de réduire une nouvelle blessure.
Dans la plupart des études 5-20000000 BMMSC autologue sont injectés directement dans la lésion qui se produit habituellement dans le noyau du corps de tendon qui agit donc comme un réceptacle pour les cellules. Le sort des cellules une fois injectées ne sont pas des méthodes de marquage des cellules claires et différents pour suivre les cellules ont été récemment décrites. Les cellules marquées avec une étiquette de fluorescence ont été montrés à survivre que dans un nombre relativement faible (<10%) 10,11. Des marqueurs de fluorescence nécessitentextraction de tissu et la coupe pour l'analyse histologique qui prend du temps et ne facilitent aisément analyse temporelle dans un grand modèle animal ou dans des cas cliniques. Dans des travaux plus récents, nous avons utilisé le radio-isotope 99m Tc pour marquer les cellules et suivez leur sort par scintigraphie gamma 1. Cette méthode permet des comparaisons rapides à faire entre les différentes voies d'administration de cellules, y compris intralésionnelle, par voie intraveineuse par la veine jugulaire 1 ou perfusion régionale via intra-artérielle ou intraveineuse 1,12 12 injections. La persistance et la distribution des cellules peuvent ensuite être visualisés par scintigraphie gamma de divers organes. Cela a démontré que seulement 24% des cellules injectées intralesionally resté dans la lésion de 24 h 1, ce qui est pris en charge par une autre étude utilisant des lésions expérimentalement créés et en utilisant le même radioactif 5. En outre, les cellules présentent une capacité limitée à l'accueil dans les lésions tendineuses lors delivereD par perfusion intraveineuse, mais régional ou sont dispersés dans les poumons par les derniers itinéraires 4.
BMMSC étiquetés avec nanoparticules de fer est une méthode alternative pour suivre les cellules implantées dans les tendons des membres antérieurs 13. Bien que les cellules marquées de nanoparticules de fer permettent le suivi des cellules in vivo par IRM, des études temporelles dans un animal de grande taille sont limitées par le nombre de fois où l'anesthésie peuvent être administrés à chaque point de temps pour effectuer les IRM. En outre, les nanoparticules de fer sont hypo-intense sur l'IRM qui limite les informations sur la migration des cellules marquées dans le corps du tendon. D'autres radio-isotopes qui peuvent être utilisés comprennent l'indium-111, mais ce souffre de l'inconvénient d'une demi-vie plus longue que Tc-99m (2,8 jours vs 6,0 h) et supérieur énergie d'émission de rayons gamma. En outre, la viabilité des cellules a été rapportée pour être réduite lorsque marqué à l'indium-111 14. Tc-99m, d'autre part, est couramment utilisée dans les deux équine et humaine nucléairemédicament pour marquer les cellules mononucléaires de sang périphérique et de suivre leur distribution in vivo par scintigraphie. Elle peut être relativement facilement absorbé par les cellules à l'aide de HMPAO comme une molécule de liaison pour lier le technétium, comme Tc-99m-HMPAO, à des cellules. Tc-99m-HMPAO étiqueté BMMSC montrer une bonne viabilité et peut proliférer in vitro 4. Ce protocole détaille l'étiquetage et le suivi des BMMSC autologue équine implanté dans les lésions d'origine naturelle dans le SDFT des membres antérieurs.
Il est important de noter que le protocole est destiné à être utilisé seulement comme outil de recherche. Son utilisation comme une modalité thérapeutique clinique est déconseillée car l'effet de la radioactivité sur le phénotype cellulaire n'a pas été complètement élucidé.
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Protocol
Les cas décrits ici ont été effectuées après la permission éthique accordée par le Comité de l'éthique animale et du bien-être du Colegio de Veterinarios de Malaga, en Espagne, et la Royal Veterinary College, North Mymms, Royaume-Uni Les procédures utilisées sur les chevaux sont basées sur les protocoles approuvés qui sont utilisé dans la clinique sur des chevaux recevant des thérapies à base de cellules souches, qui comprend la sédation, l'aspiration de la moelle osseuse, l'injection intra-tendineux, perfusion régionale, l'injection intraveineuse, la gestion du traitement et de la douleur post-opératoire et le suivi après l'implantation.
1. Des dispositions clés à fait à l'avance
- Cherchez l'éthique institutionnels et l'approbation de bien-être animal et de respecter les exigences légales locales avant de commencer à travailler.
- Obtenir l'approbation institutionnelle de travailler avec les rayonnements ionisants comme dicté par les réglementations locales et juridiques, y compris le niveau approprié de protection du personnel et de l'environnement et l'élimination des CONTAMdéchets inés.
- Utiliser les critères d'inclusion suivants: les chevaux présents avec une blessure de surmenage non-traumatique (tendinopathie ou Desmopathie) au tendon du fléchisseur superficiel du membre antérieur et des lésions résultant en un défaut dans le tendon et le défaut est entouré de tendon et / ou paratendon intacte .
Note: L'examen et le diagnostic de ces blessures et la préparation clinique des chevaux pour l'implantation des cellules a été détaillée ailleurs 6,15.
Remarque: L'isolement et l'expansion de la culture de BMMSC dérivé de la moelle osseuse des chevaux a été détaillé précédemment 6,16. Le protocole actuel pour injecter BMMSC pour blessures SDFT chez le cheval utilise 10 millions de cellules par ml de surnageant 4 de la moelle osseuse autologue (BMS) 16. - Utilisation des cellules qui ont subi pas plus de 4 passages pour l'implantation in vivo afin d'éviter phénotype cellulaire potentiel ou des altérations génétiques associées à nombre élevé passage caunes.
- Remettre le nombre requis de cellules dans le BMS (dans les 24 heures dans une boîte de refroidissement à 4-8 ° C) à la clinique vétérinaire où l'implantation des cellules doit être effectuée.
Note: L'utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses dans le surnageant de moelle osseuse est une procédure brevetée détenue par ReCellerate Inc (USA) et son utilisation peuvent nécessiter une autorisation.
Remarque: Tc-99m est un émetteur gamma (140 keV) avec une demi-vie relativement courte (6,0058 h, donc près de 94% de celui-ci se désintègre à sa forme stable de 99 Tc en 24 h). L'énergie gamma rend approprié pour la détection par des caméras gamma (scintigraphie) et les résultats courte demi-vie dans le temps très limité à la fois le cheval et le personnel de manutention des animaux exposition aux rayonnements. Ce protocole décrit le marquage in situ des cellules en utilisant le Tc-99m-HMPAO [HMPAO marqué avec Tc-99m (sous forme de pertechnétate de sodium)]. - Commandez le Tc-99m frais du fournisseur tel qu'il est livré et utilisé pour étiqueter les cellules d'esprithin 2 h d'élution du générateur de Tc-99m. Assurez-vous que le Tc-99m est fourni en 1 GBq dans (tampon standard du fournisseur) 1 ml de solution.
- Utilisez tous les tampons à la température ambiante. Effectuez la procédure d'étiquetage, l'implantation des cellules et de l'imagerie (scintigraphie gamma) dans une chambre de confinement d'isotopes avec tout l'équipement nettoyé avec de l'alcool lingettes avant le début des travaux.
2. Préparation du Cheval et de l'échographie forelimb Tendon
- Échographies d'enregistrement à la première admission pour blessures (lorsque la moelle osseuse est aspiré) puis au point de temps lorsque les cellules sont injectées radiomarqués.
- Effectuer l'échographie et l'implantation des cellules avec le cheval portant le poids uniformément dans une stalle et sous sédation debout (plutôt que l'anesthésie générale). Administrer une sédation à l'aide d'un mélange de chlorhydrate de détomidine et le tartrate de butorphanol, chacun à raison de 0,01 à 0,02 mg / kg IV.
Remarque: La récupération est rapide et post-traitement chirurgical ne nécessite pasconsidérations spéciales. - Après anesthésie périneurale est appliquée (étape 2.6) dans le membre affecté, garder le cheval à la station sous sédation pour réduire le mouvement du cheval pendant le traitement. Contrôler visuellement le niveau approprié de sédation jugé à partir de la position de la tête baissée et le comportement du cheval et que le cheval est à l'aise lors de l'injection des cellules et les mouvements de la caméra gamma lors de l'acquisition des images scintigraphiques.
Remarque: Il est pas nécessaire d'appliquer vétérinaire pommade sur les yeux (pour prévenir la sécheresse), car sous sédation clignotant est pas affectée et le cheval est capable de maintenir l'hydratation des yeux. Le suivi après l'implantation des cellules est non-invasive (échographie et scintigraphie gamma). - Clip de près les cheveux recouvrant le tendon (avec une tondeuse de crin de cheval) puis nettoyer la zone rasée en utilisant une combinaison d'un lavage chirurgical de chlorhexidine et enfin l'alcool.
- Appliquer le gel de couplage acoustique dans la région etbalayer méthodiquement pour enregistrer les scans de la région complète métacarpien palmaire, des niveaux marqués successivement 1 - 7 17, avec un transducteur linéaire (12 MHz ou similaire) pour obtenir série transversale sur-incidence et images longitudinales. Stocker les images numériques de sorte que la surface de section transversale et la zone de lésion maximale 4 peuvent être obtenus à l'aide du logiciel d'analyse d'image.
- Préparer la zone recouvrant les nerfs palmaire immédiatement en aval de la carpe aseptique pour injection d'un anesthésique local pour assurer une désensibilisation complète de la peau recouvrant le tendon et le tendon fléchisseur digital superficiel du. Injecter 2 ml de mepivicaine voie sous-cutanée à la fois et de façon adjacente aux nerfs palmaire (dans leur emplacement de sous-aponévrotique) entre les tendons fléchisseurs et le ligament suspenseur immédiatement en aval de la carpe des deux côtés de la branche.
- Une fois l'analyse préliminaire a été effectuée préparer le site d'implantation en frottant la surface avec un chlorhexidine s chirurgicalesCRUB solution pendant au moins 5 min, et enfin avec de la gaze imbibée d'alcool. Effectuez toutes les étapes ultérieures de façon aseptique.
3. Tc-99m-étiquetage des mésenchymateuses Hippique cellules souches
Remarque: Les étapes d'étiquetage de cellules peuvent être effectuées pendant l'échographie de la patte antérieure, ce qui réduira la désintégration des isotopes entre l'étiquetage de la cellule et l'implantation de cellules marquées dans le tendon.
- Retirer le BMS à partir des cellules car elle interfère avec l'absorption de l'isotope. Pour ce faire, récupérer le flacon de BMMSC (10 millions de cellules dans 1 ml de BMS) dans la zone de refroidissement et de sédimenter les cellules dans une microcentrifugeuse à 350 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer délicatement le surnageant avec une aiguille 18G ou 19G (attachée à une seringue de 2 ml), laissant une petite goutte (≤ 0,1 ml) dans le tube pour faciliter la remise en suspension de cellules. Enregistrez le surnageant (BMS) dans un tube à centrifuger stérile et garder sur la glace pour une réutilisation ultérieure.
- Resuspendre les cellules dans le surnageant résiduel de gouttelette par flIcking doucement le tube avec les doigts (plutôt que vortex) et de laisser le tube dans un rack à température ambiante. Assurer que les cellules sont remises en suspension complètement et qu'il n'y a pas visibles amas cellulaires.
- Préparer le Tc-99m comme suit. Transférer 1 ml de pertechnétate de technétium dans un flacon de HMPAO aide d'une seringue de 1 ml et une aiguille. Mélanger doucement mais soigneusement et laisser reposer 5 min derrière le blindage de plomb. Remarque: Cette étape peut être fait alors que les cellules tournent à l'étape 2.1.
- Ajouter la totalité du mélange Tc-99m-HMPAO aide d'une seringue de 1 ml et une aiguille pour les cellules et mélanger doucement. Incuber pendant 30 min à température ambiante derrière le blindage de plomb.
- Pour les prochaines étapes, utilisez une pince (ou un morceau de papier de soie) pour ouvrir le couvercle du tube à centrifuger pour minimiser la contamination des isotopes de l'(gantée) pouce et ultérieurement d'autres équipements. Utiliser une seringue de 2 ml et 21 aiguille G pour ajouter ou supprimer un tampon de lavage.
Note: L'utilisation d'un moniteur domaine des isotopes est encouragé à surveiller la contamination des surfaces et des équipements. Ajouter 1 ml de PBS au mélange Tc-99m-HMPAO-cellulaire, fermer le couvercle, mélanger délicatement et de spin pour sédimenter les cellules comme dans l'étape 3.1. - Retirez délicatement la PBS pour un nouveau tube (enregistrer cette derrière le blindage de plomb et l'étiquette que W1). Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS frais. Centrifuger le tube et retirer le surnageant comme ci-dessus (enregistrer cette étiquette et W2).
- Calculer le rendement de marquage par la mesure des chiffres dans des tubes W1 et W2 et dans le culot cellulaire. Pour ce faire, en plaçant chaque tubes dans une dose d'isotope instrument de calibrateur de puits et l'enregistrement de la radioactivité en coups par minute (CPM). Calculer l'efficacité d'étiquetage (radioactivité des cellules CPM) / (radioactivité des cellules + surnageant) x 100.
- Remettre les cellules à fond dans le PBS résiduelle, puis ajouter le BMS sauvé de l'étape 3.1. Les cellules sont prêtes pour l'implantation intralésionnel.
4. implantation de cellules Tc-99m-HMPAO marquées
- Implantation intralésionneldans le tendon sous guidage échographique
- Introduire lentement un pouce 1,5 ou 2 (50 mm) 20 d'aiguille G dans la zone de lésion maximale de la lésion dans une orientation longitudinale avec le transducteur à ultrasons, recouverte d'un drap stérile, en ligne avec l'aiguille de sorte que la longueur de l'aiguille peut être identifiés à l'échographie et la pointe si l'aiguille se trouve précisément dans le centre de la lésion.
- Utilisation de blindage approprié, recueillir les cellules dans une seringue de 2 ml (Luer-lock, afin de minimiser le risque de contamination externe et dans une couverture de la seringue plomb-blindé) à l'aide d'une aiguille 20 G. Jetez l'aiguille en faisant attention de ne pas perdre de fluide. Maintenant, fixer la seringue avec les cellules marquées sur l'aiguille pré-situé dans le tendon.
- Placer la sonde à ultrasons sous l'aiguille de sorte que le tube d'aiguille dans le tissu est clairement visible. Injecter les cellules à un rythme lent mais régulier dans la lésion. Assurez-vous qu'il n'y a pas de résistance à l'injection. Si cela est rencontréerepositionner soigneusement l'aiguille sous guidage échographique. Vérifiez que le éjection de fluide dans la lésion est visible sur l'image ultrasonore en tant que fluide anéchoïque contenant des bulles d'air hyperéchogènes.
- Retirer l'aiguille et placer immédiatement la pression sur le trou d'aiguille pour éviter la perte des cellules injectées et pour minimiser la propagation de l'isotope sur la surface externe de la branche. Habiller immédiatement le membre d'une couche de pansement auto-adhésif. Le cheval est maintenant prêt pour la scintigraphie gamma. Effectuez cette immédiatement.
Remarque: Après l'injection des cellules dans le tendon, d'acquérir un nombre de la seringue vide et l'aiguille pour évaluer une éventuelle perte directe de cellules qui peuvent rester dans la seringue.
- Perfusion régionale des cellules Tc-99m-HMPAO marquées
- Suivez l'étape 2.4.
- Appliquer un 100 mm garrot en caoutchouc bandage sur le métacarpe proximal avec deux 100 mm rouleau de coton gaze positionné dedans et en dehors.
- Préparer de façon aseptique ee peau sur la veine numérique palmaire latérale au niveau de l'os sésamoïde latéral proximal en frottant la surface avec une solution de lavage chirurgical de chlorhexidine pendant au moins 5 min, et enfin avec de la gaze imbibé d'alcool. Effectuez toutes les étapes ultérieures de façon aseptique.
- Préparer une extension de 100 mm fixé avec un 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) de l'aiguille de papillon pour ponction veineuse en complétant avec une solution saline stérile héparine, puis d'introduire l'aiguille dans la veine numérique palmaire latérale. Une fois que le sang de la veine est entré remplira partiellement le kit d'extension. Au connecteur luer lock attacher un loquet capuchon en caoutchouc Luer pour faciliter l'injection ultérieure de cellules marquées.
- Diluer les cellules souches mésenchymateuses dans 19 ml de PBS en recueillant les cellules dans une seringue de 20 ml avec du PBS préchargé. Appliquer les cellules par l'intermédiaire de la coupe de caoutchouc à l'aide de 18 g (1,2 x 40 mm) d'aiguille hypodermique à un rythme lent mais régulier (30 - 40 sec). Rincer le cathéter avec 1 ml de PBS dans une seringue préchargéee.
- Retirer l'aiguille et appliquer immédiatement pression à la peau sur le trou de l'aiguille d'une couche de cinq 4 x 4 toiles de coton. Ensuite, placez un bandage léger avec colle élastique sur la zone de sésamoïde proximale et laisser le garrot en place pendant 30 minutes après l'injection.
- Relâchez le garrot après 30 min. Le cheval est maintenant prêt pour la scintigraphie gamma.
Remarque: Après l'injection des cellules, d'acquérir un nombre de la seringue vide et l'aiguille pour évaluer une éventuelle perte directe de cellules qui peuvent rester dans la seringue.
5. scintigraphie gamma
- Images scintigraphiques
- Acquérir les images de scintigraphie planaire avec une caméra gamma (fixé à 140 keV pic photoélectrique utilisant une fenêtre symétrique de 20%) équipé d'une faible énergie, parallèlement trou collimateur.
- Obtenir toutes les images après l'heure 0 sur des chevaux sous sédation comme dans l'étape 2.2 debout. Après le temps 0 scintigraphie, remplacer le bandage lumière sur le SI d'implantationTE avec un bandage rembourré. Retirer ce bandage avant chaque examen de scintigraphie.
- Acquérir des images statiques pendant 60 secondes chacun (256 256 par matrice) en utilisant le logiciel de traitement avec le «acquérir» - «sélection de l'étude" - "os" statiques options. Il est essentiel que le cheval ne se déplace pas au cours de la période d'acquisition d'image parce que l'option de mode statique ne possède pas un module de correction de mouvement.
- Pour l'injection intralésionnelle, obtenir des images latérales de la zone de lésion de la carpe à l'extrémité distale, la surface équivalente de la branche controlatérale, le champ de poumon gauche et de la gauche de la thyroïde. Lors de l'acquisition des images des membres antérieurs, positionner un écran de plomb entre les jambes pour éviter l'imagerie de la controlatéral du membre. Acquérir les images à 5 min après l'injection (temps 0), puis à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h.
- Pour perfusion régionale, obtenir des images latérales et dorsales gamma que pour les 5.1.1.3. Obtenir des images 5 min after garrot libération. Ce sera le temps 0. Il peut être utile à l'image de la branche immédiatement après l'injection des cellules d'évaluer les chiffres antérieurs à tourniquet de presse. Obtenir des images gamma à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h après l'administration des cellules.
- Après les images ont été acquises, traiter les images manuellement en utilisant l'option "traitement" du logiciel avec les options choisies pour la couleur "Sokoloff" et la couleur "Inverser". Sélectionnez ensuite la "zone d'intérêt" (ROI) et «ellipse» car cela permet refonte du masque de sélection et de mouvement sur la zone de la lésion. Procurez-vous les chiffres plus le retour sur investissement en choisissant l'option "ajouter les statistiques". Veiller à ce que les régions de taille identique d'intérêt (ROI) sont enregistrés pour chaque animal dans les différents points de temps.
- Ensuite, corriger les chiffres correspondant à la décroissance prévue du technétium à chaque point de temps. Utilisez l'équation suivante pour corriger la décroissance:A = A o e - (0.693t / T 1/2), où A o représente l'activité initiale de l'isotope, A est la désintégration corrigé radioactivité au temps zéro, t est le temps écoulé et T 1/2 est la demi -life de l'isotope. Puis exprimer les chiffres corrigés à chaque point de temps comme un pourcentage de la ROI au temps 0 à travailler sur le pourcentage de cellules restantes, en utilisant la formule suivante:
- Acquérir les images de scintigraphie planaire avec une caméra gamma (fixé à 140 keV pic photoélectrique utilisant une fenêtre symétrique de 20%) équipé d'une faible énergie, parallèlement trou collimateur.
% de cellules restant (t) = 100 - {[(décroissance estimée (t) - décroissance (t)) / décroissance prédit (t)]} x 100
décroissance (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
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Representative Results
Tc-99m-HMPAO incorporation dans BMMSs ne nuisent pas à leur capacité à adhérer à la culture de tissus en plastique et tandis qu'ils montrent la capacité de prolifération pour former des monocouches (Figure 1), nous avons pas entièrement déterminé si les taux de prolifération ou d'autres phénotypes cellulaires sont affectées. Leur morphologie est similaire à cellules non marquées avec une forme typique de la broche. L'efficacité du marquage cellulaire (par exemple., L'absorption de l'étiquette) varie typiquement d'environ 1,5% à 25%. La principale raison de l'efficacité de l'étiquetage bas était liée à du retard dans la livraison du 99m Tc à la clinique de l'endroit où le générateur de Mo-99 / Tc-99m a été élue. Les retards de plus de 2 heures se traduisent par une baisse importante de marquage des cellules. Cependant, suffisant isotope est incorporé dans les cellules pour effectuer la scintigraphie gamma pour un maximum de 36 heures (figure 2). Les facteurs qui peuvent améliorer l'efficacité de l'étiquetage sont détaillés dans la discussion.
1 (directement dans la lésion) ou par perfusion régionale via un convertisseur numérique veine ou une artère 1 12. Implantation intralésionnelle est possible lorsque la lésion est dans le noyau du tendon et entourée par du tissu tendineux intact qui agit comme un réceptacle pour les cellules. Perfusion régionale est une voie plus facile à administrer les cellules où ils sont injectés dans un vaisseau sanguin, mais la méthode repose sur l'espoir que les cellules souches mésenchymateuses sont capables de "home-in" de la lésion du tendon. Il ya peu de preuves que les CSM peuvent spécifiquement la maison dans les sites de lésions tendineuses, mais cette méthode fournit une approche expérimentale utiles pour développer des applications qui peuvent augmenter la capacité de ralliement des CSM.
Avec l'itinéraire de livraison intralésionnel, les cellules seront considérées comme un domaine d'intervention du signal qui reste relativement localisée avec IE de temps. Il est s limitéespread ou la migration des cellules dans le tissu environnant tendon. Par contre, il y aura une réduction progressive du signal avec le temps au niveau du site d'injection lorsque les cellules sont administrées par perfusion par la veine région palmaire numérique (figure 2). Il est commun avec l'injection intralésionnelle pour les champs pulmonaires d'être négatif, mais dans certains cas, à des points de temps très précoces du poumon peuvent montrer signal d'isotopes qui peut être focale, puis devient plus généralisée (Figure 3). La thyroïde reste négative avec cette voie d'administration. Perfusion régionale similaire peut montrer le signal focal dans les poumons, ce qui devient alors plus diffus mais le signal est nettement plus intense par rapport à celle observée avec la voie intralésionnelle. La thyroïde peut souvent montrer également le signal focal.
Le nombre de radio-isotope total initial des cellules (temps 0, pré-injection) et les chiffres de la scintigraphie gamma initiale à la région d'intérêt (temps 0, après i-njection) sont notés et utilisé pour calculer le pourcentage de diminution de la numération à chaque point de temps. Il est utilisé pour comparer à la décroissance prévue du Tc-99m à partir des comptages initiaux (Figure 4). La courbe calculée suivra la courbe prédit. Cependant, après la prise de la décroissance prédite en compte, la persistance de cellules restantes dans le site d'injection après l'administration intralésionnelle est d'environ 32% (à 12 h) et 24% (à 24 h) (Figure 4).
Figure 1. Cellule étiquetage, injection et la scintigraphie gamma (A) Transfert de BMMSC dans une centrifugeuse avant marquage avec Tc-99m-HMPAO derrière plombée blindage (écran et de support de seringue) et le moniteur de rayonnement et centrifuger. (B) une aliquote de cellules marquées Tc-99m-HMPAO ensemencées dans une culture de tissu plat bon spectacle morphology, la viabilité et la prolifération; (C) l'injection de cellules Tc-99m-HMPAO étiquetés sous échoguidage dans le site de la lésion de la patte avant droite SDFT de; (D) de la scintigraphie gamma de la patte antérieure. La gamma caméra est positionné de manière précise en utilisant un bras hydraulique maniable et tout potentiel étiquetés cellules dans la branche controlatérale sont éliminés par un blindage de plomb maintenu entre les jambes. La gamma-caméra est positionnée de façon similaire à la poitrine pour surveiller le domaine du poumon ou au cou pour surveiller le domaine de la thyroïde. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. ultrasons et Gamma scintigraphies de la SDFT. Échographes typiques de la patte antérieure à la région mi-métacarpienne dans (A (B) section. La lésion dans le SDFT est clairement visible comme une zone hypoéchogène (vers le haut du balayage) par rapport à l'intégrité indemne (normal) des tissus du tendon fléchisseur profond numérique (DDFT) adjacente à et en dessous du SDFT. La zone de la lésion et les positions relatives des tendons sont représentés dans le schéma ci-dessous. Scintigraphs gamma effectués à 3, 6 et 12 heures après l'injection de cellules radiomarquées sont présentés pour les cellules injectées (C) dans la lésion ou (D) par perfusion intraveineuse régionale via la veine palmaire numérique. Dans le cas représenté, il y a absorption de cellules radiomarquées dans le site de lésion dans le SDFT (flèches pleines). Persistance de l'absorption par la veine numérique palmaire est désigné par la flèche en pointillés. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les images scintigraphiques gamma du poumon et de la thyroïde. Balayages typiques à partir de points de temps précoces sont présentés à la fois pour l'injection intralésionnelle et la perfusion régionale de cellules marquées. Notez la focale et le signal diffuse dans les champs pulmonaires et de la thyroïde. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Decay de la radioactivité enregistrée à partir du régions d'intérêt après l'injection intralésionnelle. Dans ce cheval, chiffres ont été mesurés à partir de la scintigraphie gamma de la SDFT plus de 36 heures après l'injection dans la lésion. Panneau de gauche: la radioactivité à chaque point de temps a été calculé par rapport à la valeur temps 0. Alorsatural décroissance de la radioactivité de 99m Tc est montré pour la comparaison. Panneau de droite: le pourcentage estimé de cellules restantes. Il est calculé par rapport au niveau des régions d'intérêt de la radioactivité. Dans ce cas, le pourcentage restant de cellules à 24 heures est d'environ 24%. Nous avons effectué ce protocole (étiquetage des MSC et implantation) sur 21 chevaux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En plus de la moelle osseuse, les cellules souches isolées à partir de sources telles que le tissu adipeux sont adaptés pour le marquage avec ce protocole. En outre, les cellules de l'état congelé peuvent être repris et développés en culture pour les chiffres désirés pour les études de marquage 12.
Un facteur critique qui détermine l'efficacité de marquage de l'BMMSC est le temps entre l'élution de la Tc-99m provenant du générateur de molybdène à la radiopharmacie, la préparation de Tc-99m-HMPAO et l'utilisation du produit radiopharmaceutique dans la clinique. Il existe une relation inverse entre l'efficacité et le temps étiquetage après Tc-99m élution du générateur de telle sorte que les retards au-delà de cette période peuvent altérer de manière significative l'efficacité de l'étiquetage de la cellule. Par conséquent, une coordination étroite est nécessaire entre la livraison des cellules du laboratoire et de la livraison du Tc-99m à la clinique le jour que les cellules seront radiomarqué et implanté. Le temps de transport à l'Clinic est donc un facteur important. La fiche de données du fournisseur précise que la décroissance du Tc-99m réduit la pureté du radiochimique après 2 h post-élution qui peut interférer avec la liaison de la HMPAO au Tc-99m et ensuite la quantité de Tc-99m-HMPAO prise par les cellules. Nous avons également noté que l'étiquetage des cellules cultivées dans un environnement de laboratoire a donné étiquetage plus efficace que dans la clinique. Cela a également signalé par une autre étude chez les chevaux 5 où les cellules ont été marquées dans un environnement de laboratoire. En outre, d'après notre expérience, l'étiquette est repris par les cellules de façon plus efficace qui sont étiquetés immédiatement après la préparation des échantillons de sang ou de tissus par rapport aux cellules préparées à partir de la culture. Cependant, même avec une faible efficacité de l'étiquetage, il est suffisant étiquette liée aux cellules pour effectuer la scintigraphie plus de 36 h.
L'efficacité de l'étiquetage des 40% - 80% peuvent être réalisées pour les leucocytes si le Tc-99m est utilisé à partir d'unéluat de générateur fraîche dans les 30 minutes et la réaction réalisée dans un petit volume (1 - 0,5 ml) 18. L'efficacité de l'étiquetage des 47% - 71% ont été atteints pour les chevaux MSC 19 démontre qu'il est possible d'augmenter l'efficacité de l'étiquetage des CSM dans des conditions idéales.
On implante en routine 20 millions de cellules pour le traitement des lésions de base SDFT bien que jusqu'à 40 millions de cellules ont été implantées pour les plus grandes lésions. Un nombre similaire de cellules pourrait être implanté par perfusion régionale bien que cette méthode est peu utilisée en raison de la procédure plus complexe. Cependant, il peut être utile pour les lésions qui se prolongent à la périphérie de la surface du tendon dans l'espoir que suffisamment de cellules maison dans la lésion. Suivi des cellules par scintigraphie gamma peut fournir des informations utiles sur le mouvement des cellules administrées par des voies différentes. Dans ce protocole, les cellules implantées par voie intralésionnelle sont Möstly retenu au niveau du site d'injection par voie intralésionnelle. Signal de radio-isotopes peut être observée dans les champs pulmonaires dans certains cas, mais il semble en général qu'il ya peu de migration des cellules loin du site de la lésion. Livraison de BMMSC par perfusion régionale suggère qu'il peut y avoir rétention des cellules au site de la lésion, mais quand livré par injection intraveineuse 4 on n'a pas observé homing des cellules. L'étiquette Tc-99m-HMPAO ne modifie pas la capacité de migration des cellules 20 et, le Tc-99m-HMPAO est internalisé par les cellules et retenue dans le cytoplasme, il est peu probable d'interférer avec des propriétés d'adhérence.
Le calcul du signal à partir des régions d'intérêt est peut-être sous-estimé, il est possible que qu'il peut y avoir de dissociation significative de l'étiquette à partir de cellules (libéré par les cellules mortes ou d'autres mécanismes de la libération de cellules vivantes). La thyroïde capte isotope libre (Tc-99m) libéré par les cellules mortes ou mourantes, et TC-99m-HMPAO peut être éliminé par le rein et l'intestin. Ces tissus peuvent être surveillés par scintigraphie gamma pour évaluer la perte potentielle de l'étiquette.
La procédure de marquage cellulaire peut être adapté pour tester la rétention de cellulaire et l'absorption à différents sites (les organes et les blessures) en utilisant différentes voies d'administration. La nature focale du signal dans les poumons peut être le signe d'agrégats de cellules qui brisent sans doute avec le temps ou entrent lyse cellulaire. La thyroïde, qui capte isotope libre, montre vraisemblablement une augmentation de l'absorption suivant la perfusion régionale parce que les cellules injectées et les débris résultant de cellules mortes ont un itinéraire plus accessible à la thyroïde par la circulation. Bien que seulement environ 24% des cellules restent après 24 h, la route intralésionnel dans le tendon est la voie de livraison plus efficace que la plupart des cas ne présentaient aucun Tc-99m libre dans la thyroïde. L'information tirée de l'utilisation de ces protocoles peut guider l'élaboration et le développement futur des applications de cellules souches pour more thérapies cliniques efficaces.
Le protocole de marquage des cellules a été adaptée pour une utilisation dans le cheval de marquage au Tc-99m-HMPAO de leucocytes humains dans des applications médicales. Son utilisation dans ce protocole démontre applicabilité dans un grand animal dans lequel la maladie du tendon se produit spontanément des enquêtes sur les thérapies à base de cellules. Le recrutement des cas cliniques peut aider à compenser les coûts plus élevés associés à travailler avec un plus grand animal. La procédure d'étiquetage pour l'utilisation comme une modalité d'imagerie a été décrit dans de petits modèles animaux 21 et nous croyons que le protocole peut être utilisé de manière similaire dans de plus grands animaux tels que les moutons pour les enquêtes d'autres maladies des tendons.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
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