Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Stereotaksisk Infusjon av Oligomeric amyloid-beta i musen Hippocampus

Published: June 17, 2015 doi: 10.3791/52805
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, 2The Taub Institute for Research on Alzheimer's Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, 3Department of Neurology, Columbia University Medical Center

Abstract

Alzheimers sykdom er en nevrodegenerativ sykdom som påvirker den aldrende befolkning. En nøkkel nevropatologiske trekk ved sykdommen er overproduksjon av amyloid-beta og avsetning av amyloid-beta plakk i hjernen regioner av de berørte individer. Gjennom årene har forskere generert mange Alzheimers sykdom musemodeller som forsøker å gjenskape amyloid-beta patologi. Dessverre, de musemodeller bare selektivt ligne sykdommen funksjoner. Neuronal død, en fremtredende effekt i hjernen til Alzheimers sykdom pasienter, er merkbart mangler i disse musene. Derfor har vi og andre ansatt en metode for direkte infusjonen løselige oligomeriske arter av amyloid-beta - former amyloid-beta som har vist seg å være mest giftig for nervecellene - stereotaksikalt inn i hjernen. I denne rapporten benytter vi mannlige C57BL / 6J mus for å dokumentere dette kirurgisk teknikk for å øke amyloid-beta nivåer i en utvalgt hjernen regionen. Deninfusjon målet er dentate gyrus av hippocampus, fordi denne hjerne struktur, sammen med den basale forhjerne som er forbundet med det kolinerge kretsen, representerer en av de områdene av degenerasjon i sykdommen. Resultatene av å heve amyloid-beta i gyrus dentatus via stereotaksisk tilførsel avsløre økning i tap av nevroner i gyrus dentatus innen en uke, mens det er en samtidig økning i celle-død og cholinergisk neuron tap i den vertikale gren av den diagonale bånd av Broca av den basale forhjerne. Disse effektene er observert opptil to uker. Våre data tyder på at dagens amyloid-beta infusjon modellen gir en alternativ musemodell for å løse region bestemt nevron død i en kortsiktig basis. Fordelen med denne metoden er at amyloid-beta kan heves i et romlig og tidsmessig måte.

Introduction

Amyloid plakk innskudd, som er sammensatt av amyloid-beta (Ap 1-42), er en viktig funksjon i patologi av Alzheimers sykdom (AD). Tallrike studier har vist at høye eller giftige nivåer av rekombinant oligomert Ap 1-42 framprovosere neuronal død, synaptisk dystrofi, tap og dysfunksjon; samt lærings- og hukommelsessvikt 1-4. Hjerneområder berøres er blant annet hippocampus, cortex og subkortikale strukturer som basal forhjerne og amygdala 5,6. Til dags dato er det flere transgene musemodeller som forsøker å simulere Ap 1-42 patologi AD. Avhengig av belastningen disse dyrene vise seg å være nyttig i behandlingen enkelte patologiske trekk ved AD. Dessverre, med unntak av to transgene linjer, APP23 og 5XFAD, disse musene aldri helt replikere neuronal tap, en sentral del av AD. Selv med nevronale tap observert i APP23 og 5XFAD, den neuronal død dialektikkenVed var subtile, aldersavhengig, og isolert til noen få utvalgte regioner 7,8.

Den direkte tilførsel av oligomere Ap 1-42 inn i villtype-mus hjernen gir en utmerket in vivo-modell som replikerer neuronal død aspekt av amyloidopathy 1,9,10. I motsetning til vanlig benyttes transgene musemodeller oligomert Ap 1-42 infusjon modellen er ideell for akutt heve Ap 1-42 nivåer i en romlig og tidsmessig måte. Fordelen med å bruke villtype mus for denne modellen unngår potensielle erstatnings eller bivirkninger fra mutasjoner introdusert i transgene mus linjer. Tidligere studier har vist at infusjonen giftige nivåer av Ap 1-42 inn i hippocampus utløser neuron død i nærheten av injeksjonsstedet i løpet av en uke en. Dessuten, i overensstemmelse med den observasjon at Ap 1-42 er giftig for kolinerge neuroner 11 den basale forhjernekolinerg neuron (BFCN) populasjonen som rager til hippocampus er redusert 20-50% i løpet av 7-14 dager etter beta-amyloid infusjon 1,10 i mus, effektivt slik at for undersøkelser av isolerte neuronal kretser i hjernen. Siden BFCN prosjekt ipsilateralt til dentate gyrus av hippocampus 12, for det meste kontroll / kjøretøyet og oligomere Ap 1-42 oppløsninger kan sprøytes på hver side av hjernen slik at sammenligningene gjøres mellom venstre og høyre hjernehalvdel 1.

I denne rapporten vil vi gi en detaljert kirurgisk og injeksjon metode for voksne villtype C57BL / 6J mus. Denne musestamme er valgt på grunn av sin brede anvendelse i forskning. Teknisk sett kan en hvilken som helst hjerneregionen være målrettet for infusjon, men her vil vi bruke dentate gyrus av hippocampus som mål å illustrere teknikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: For alle dyreforsøk, ble Institusjonelle og Nasjonale retningslinjer for behandling og bruk av forsøksdyr fulgt.

1. Forbered kirurgiske instrumenter og løsninger for kirurgi

  1. Autoklav alle rustfritt stål kirurgiske instrumenter.
  2. Forbered 70% etanol ved å fortynne 200 proof absolutt etanol med sterilt molekylær grade avionisert destillert vann.
  3. Fest 29 G nål til Hamilton sprøyte. Rengjør innsiden av Hamilton sprøyten ved å trekke opp og ta ut nanorent vann gjentatte ganger i 1 min. Gjenta denne prosedyren med 70% etanol.
    1. Fjern stempelet og nålen fra Hamilton sprøyte. Air tørke delene i en laminær hette O / N.
    2. Bestråle nål og sprøyte med ultrafiolett lys i 30 minutter før bruk.
  4. Forbered saltløsning ved å oppløse NaCl i molekylær klasse vann til en sluttvekt på volumkonsentrasjon på 0,9%. SteriliseringZe løsningen ved filtrering gjennom 0,2 um pore-filter.

2. Forbered Oligomeric Ap 1-42

  1. Monomerize og resuspender rekombinant humant Ap 1-42 i DMSO til 5 mM nøyaktig som beskrevet i publikasjonen av Fa "og andre 13.
  2. Fortynn 5 mM Ap 1-42 med sterilt (1x) PBS til 100 um på dagen før operasjonen.
  3. Bland løsningen godt ved gniing.
  4. Inkuber Ap 1-42-løsning i 12 timer ved 4 ° C.
    Note: Kontroll løsninger som fortynne DMSO i PBS eller kryptert / reversere Ap 1-42 peptid bør være forberedt på samme måte som Ap 1-42.

3. Bestem injeksjons Koordinater

  1. Bruk voksen musehjerne atlas for å bestemme den eksakte anterior-posterior (AP), medial-lateral (ML), og dorsal-ventral (DV) koordinater for hjernen regionen av interesse 14.
    Neite: For å illustrere teknikken vi plukket dentate gyrus av hippocampus som målet med følgende koordinater fra bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. Den negative tegn i forkant av AP verdien indikerer at det er 2,00 mm posterior av bregma. Den ± tegn forut for ML verdien angir venstre og høyre retning fra sentrum. Til slutt, det negative tegn foregående DV indikerer at den beveger seg ventralt fra overflaten av hjernen.

4. stereotaksisk Ramme oppsett

  1. Bruk en kirurgisk munnbind, rene laboratoriefrakk, og sterile kirurgiske hansker.
  2. Tørk stereotaksisk instrument og mus adapter med 70% etanol.
  3. Legg ned sterile operasjonslaken på telleren.
  4. Plasser stereotaxic instrument med musen adapter på toppen av sterile operasjonslakenet.
  5. Tørk musevarmeputen med 70% etanol. Plasser varmeputen over stereotaxic ramme seng. Bruk generelle formål laboratory merking tape å tape ned varmeputen over muse adapter sengen.
    1. Fest varmeputen til det varme vannet recirculator pumpen i henhold til produsentens anvisninger.
    2. Slå på det varme vannet recirculator pumpen og sett temperaturen til 37 ° C, og deretter vente til den når temperaturen.
  6. Fest 50 ul Hamilton sprøyte med en 29 G nål på stereotaxic rammen ved å skru den på motoriserte vertikal sprøyte aksel henhold til produsentens anvisninger.
  7. Slå på perle sterilisator og vente til den når produsentens forhåndsinnstilt temperatur.
    Merk: Dette brukes for å sterilisere instrumenter av rustfritt stål mellom dyr. Det tar instrumentene 20 sekunder i kontakt med kulene for sterilisering.
  8. Slå på kokeplate og sett den til 42 ° C og legg et rent tomt bur oppå.
  9. Mens Hamilton sprøyte er fast på stereotaxic rammen bruke motoriserte stereotaxic jegnjector å utarbeide Ap 1-42 løsningen.
    Merk: Tegn opp mer enn 4 mL av oppløsningen inn i sprøyten og deretter bruke stereotaxic injektor for å sette sprøytevolum. Operere injektoren i henhold til produsentens instruksjoner.

5. Animal Forberedelse

  1. Bestem vekten av mus ved bruk av veier skalaen.
  2. Bedøve mus med ketamin / xylazin cocktail ved 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin ved injeksjon intraperitonealt (IP). Overvåke anestesidybden ved tap av tå klype refleks.
  3. Etter at musen er bedøvet ta hårklipperen og barbere hodet for å eksponere huden over skallen.
  4. Plasser musen på toppen av varmepute på toppen av stereotaxic sengen.
  5. Bruk slikkepott til å åpne munnen og plassere fortennene inni tennene vakt. Sikre revolveren over ansiktet av musen. Klemme det ned forsiktig og ikke for stramt.
  6. Posisjon de bilaterale øre sprosser i øregang å sikre hodet. Flytte hver tverrliggeren inn til den treffer skallen, og deretter skru skruen for å låse den.
    1. Å sørge for at hodet er sikret bruke pekefingeren til å forsiktig presse ned på hodet. Hvis hodet er riktig sikret det ikke vil gi ut eller flytte når den trykkes.
  7. Påfør en dråpe øyekrem eller øyedråper til øynene for å holde dem fuktig. Sørg for at øynene er fuktig hele den kirurgiske prosedyren.
  8. Å desinfisere operasjonsstedet brukes sterile vattpinner til å søke Betadine løsning på huden over skallen, etterfulgt av 70% etanol. Utfør alternerende Betadine og 70% etanol renhold to ganger til.

6. Kirurgi og Infusion

  1. Bruk en skalpell til å lage et 2-3 mm snitt i midtlinjen av hodebunnen, og deretter bruke en rett fin saks for å forlenge snittet linje til 1,0-1,5 cm for å avsløre sagittal sutur, bregma, og lambda av skallen, landemerkes hvilke stereotaksiske koordinater er basert på. Bruk mikroklemmer for å holde huden fra hverandre.
    Merk: bregma og lambda stillinger er forklart i musehjerne atlas "The Mouse Brain i stereo Koordinater" 14.
  2. Ta en bomullspinne, suge den i sterilt saltvann, og bruke den til å rense skallen. Deretter bruker du en ren, tørr bomullspinne til å tørke skallen.
  3. Bruk en steril fin spiss penn for å markere en prikk på bregma. Bruk stereotaxic micromanipulator å posisjonere Hamilton sprøyte slik at spissen av nålen bare berører prikken på bregma.
    1. Spill DV koordinere.
    2. For å sjekke om AP aksen av skallen er nivået flytte Hamilton sprøyte baktil slik at spissen av nålen berører lambda punktet.
    3. Spill DV posisjon. Kontroller at DV-koordinatene for bregma og lambda er innenfor 0,5 mm.
      Merk: Målet er å minimalisere DV forskjellen mellom bregma og lambda.
  4. Bruk micromanipulator å returnere Hamilton sprøyte nålespissen tilbake til bregma dot.
  5. Spill start AP posisjon.
  6. Beregn slutter AP posisjon ved å trekke 2,00 mm fra start AP koordinere.
  7. Bruk mikromanipluatoren å reposisjonere Hamilton sprøytespissen til finalen AP koordinere.
  8. Spill dagens ML koordinere.
  9. Beregn venstre og høyre slutter ML-koordinater ved å legge til eller trekke fra 1,3 mm fra start ML koordinere.
  10. Bruk mikromanipluatoren å flytte Hamilton sprøytespissen til enten slutter ML koordinere.
    1. Trykk på nålespissen til overflaten av skallen på begge ender ML koordinater og registrere DV koordinatene og sørge for at verdiene er innenfor 0,5 mm.
      Merk: Målet er å minimalisere DV forskjellen mellom de to ender ML-koordinater.
    2. Mens på en avslutning koordinere trekk nålen opp 0,5-1 cm over skallen. Ta en steril fin spiss penn for å markere en prikk på the overflate av skallen. Gjenta dette trinnet for motsatt side av hodeskallen.
  11. Sving Hamilton sprøyte klart ut av veien.
  12. Fest 0,8 mm drill hodet til drillen. Ta drill med begge hender, setter albuene på overflaten av tabellen for stabilitet, og posisjonere borehodet litt over sharpie prikk på enten høyre eller venstre ML koordinere. Aktiver drill, senke borespissen på skalleoverflaten for å innføre et hull i skallen. Gjenta dette trinnet for motsatt side.
    Merk: Noen blødning kan oppstå fra den nylig introduserte hull. Hvis det er blødning deretter bruke en ren, tørr bomullspinne til DAB blodet.
  13. Flytt Hamilton sprøyten tilbake på plass over en av de nylig introduserte ML hull. Senk Hamilton nålen bare forbi skallen. På dette punktet være forsiktig for ikke å punktere hjernen. Å sørge for at nålen har passert skull ta pekefingeren og skyv nålen mot skallen til å gjøre sure nålen ikke kommer ut av hullet.
  14. Spill start DV koordinere.
  15. Beregn slutter DV koordinere ved å trekke 2.2 mm fra start DV koordinere.
  16. Senk nålen ned til slutt DV koordinere.
  17. Aktiver stereotaksisk injektorpumpen å pumpe 4 mL av Ap 1-42 i gyrus dentatus med en hastighet på 0,5 ul / min.
  18. Når infusjon la nålen holdes på plass i ytterligere 1 min for å redusere tilbakestrømning av oppløsning fra injeksjonsstedet.
  19. Flytte nålen til den andre siden av hjernen og gjenta trinn 06.13 til 06.18.

7. Animal Fjerning og Postoperativ Care

  1. Skru øret barer og ansikt / nese vakt. Fjern mus fra apparatet.
  2. Bruk en student standard mønster pinsett til å dra lukke hodebunnen og deretter forsegle såret med sutur.
  3. Injiser 1 ml sterilt saltvann i musen via IP for hydrering.
  4. Isjektet buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant å lindre smerte.
  5. Opprettholde mus i ren tomt bur satt på toppen av 42 ° C varm plate før den våkner, deretter returnere til sin bolig bur med god mat og vann.
  6. Administrere buprenorfin via subkutan injeksjon hver 12. time i 3 dager for smertelindring.

8. Sutur fjerning

  1. Anesthetize mus med ketamin / xylazin cocktail på 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xlyazine av IP. Merk: Dette gjøres 7-10 dager etter operasjonen.
  2. Bruk en student standard mønster tang og rette gode saks for å fjerne sutur.
  3. Injiser 1 ml sterilt saltvann i musen via IP for hydrering.
  4. Opprettholde mus i en ren tomt bur satt på toppen av 42 ° C varm plate før den våkner, og deretter returnere til sin bolig bur med god mat og vann.

9. Animal Sacrifice og Tissue Processing

  1. Anesthetize mus og perfuse det med 4% paraformaldehyde 15, ta av hjernen, og behandle den for cryosectioning 16.
    Merk: Tidspunktet for dyreoffer avhenger av eksperimentator. Men for våre studier vi valgte 7 og 14 dager etter operasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den foreliggende fremgangsmåte for fremstilling av humane rekombinante oligomere Ap 1-42 gir oppløselige oligomere arter bestående av monomerer, dimerer, trimerer og tetramerer (figur 1A). Disse lavmolekylært Ap 1-42 arter, men ikke fibriller og plaketter, har blitt vist i en rekke innstillinger for å være mest giftig for nerveceller 1,4,9,17-19. For å avgjøre hvorvidt oligomert Ap 1-42 induserer nevron død i musen hjernen Ap 1-42 (4 mL av 100 mikrometer stamløsning) ble tilført i DG av hippocampus i en halvkule av ni måneder gamle villtype C57BL / 6J mus. Vekten av en hippocampus for C57BL / 6J er beregnet til å være rundt 0,018 g, og derfor levering av Ap 1-42 ble ca. 100 ug / g. Den kontralaterale DG av samme musehjerne ble infusert med en styre / kjøretøy løsning - som besto av like stort volum DMSO anvendt i oppløsning av Ap 1-42 fortynnet i (1x) PBS - for sammenligning. Som nevnt tidligere er kryptert eller omvendt Ap-peptid 1-42 kan benyttes som kontroll for sammenligning, siden vi tidligere har funnet noen effekt på hippokampale neuroner 1. Som innføring av nålen inn i hjernen skaper lokal vevsskade (figur 1B) og forårsaker eventuell DG kollaps har vi valgt å utføre post-injeksjon analyser i tilknytning til injeksjonskanalen hvor vevet er fortsatt intakt. Innen en uke av Ap 1-42 injeksjon DG viste forhøyede Ap 1-42 nivåer i den molekylære lag og det polymorfe cellelaget i nærheten av injeksjonsstedet (figur 2A). Etter 7 og 14 dagers Ap 1-42 fremkalte økninger i TUNEL-positiv farging og avtar i tykkelse DG, bekrefter nevrodegenerative virkninger av Ap 1-42 (figur 2B).

Fordi BF kolinerge nevroner projisere til DGav hippocampus vi bestemt ved om tap av nevroner i DG utløser BF degenerasjon. For denne studien en retrograd tracer Fluorogold (2% suspensjon) var co-injisert sammen med Ap 1-42 inn i DG. 7 dager etter injeksjonen Fluorogold ble detektert i BF (figur 2C) som tyder på retrograd transport av etiketten via kolinerge neuroner. Derfor, i den hensikt å kvantifisering i BF valgte Fluorogold-positive nevroner, fordi dette indikerer at nevronale terminalene ble utsatt for Ap 1-42 i DG. At både en og to uker etter DG Ap 1-42 infusjon, kjernen i diagonal band - en underregion av BF hvor kolinerge nevroner projisere til DG - ipsilaterale til Ap 1-42 -injected nettstedet utstilt økninger i TUNEL farging og reduksjon i kolinerge nevroner (figur 2D). Den observerte tap av nevroner i BF bekrefter tidligere studier knytter den destruktiveeffekter av Ap 1-42 til BF-hippocampus sti 1,10. Det er også viktig å merke seg at fra sammenligningen av de to ukers tidspunktet til en ukes tid punkt på siden av kjernen av det diagonale bånd hvor kontrollen / bæreroppløsning ble injisert i DG var det en ytterligere økning i TUNEL-farging og avtar i kolinerge nevroner (figur 2D, tabell). Disse resultatene reflekterer en betydelig nedgang i GCL tykkelse og økninger i TUNEL-positiv merking (figur 2B, tabell) i DG av kjøretøyet injiserte side sammenligning mellom de to etter injeksjonen tidspunkter, noe som tyder på at den fysiske traumer forårsaket av nålen bidrar til degenerering med tiden. Selv med denne uønskede bivirkning av nålen, den nevrodegenerative virkninger av Ap 1-42 fremdeles er betydelig større enn de av kontrollen / bæreroppløsning (figur 2D). Til sammen dagens infusjon modell effectively reproduserer de toksiske effektene av Ap 1-42 i musehjerne innen 7 dager, noe som gjør dette til et attraktivt modell for å studere korttids Ap 1-42 stimulering.

Figur 1
Figur 1. Oligomeric Ap 1-42 forberedelse og musehjerne injeksjonskanalen visualisering. (A) 2 uM Oligomeric Ap 1-42 ble separert på 10 til 20% tricin gel og overført på nitrocellulosemembran. Membranen ble utslettet med Ap 1-42 antistoff 6E10 (1: 1000). (B) Ap 1-42 (4 ul 100 uM oppløsning) eller kontroll / kjøretøyet ble infusert inn i venstre og høyre DG av hippocampus, henholdsvis 9 måneder gamle C57BL / 6J mus. Musene ble overlevde i 7 dager. Hjernene ble serielt seksjonert ved 20 mikrometer per seksjon. Hippocampus seksjonene ble farget for DAPI. Hash merker skildreinjeksjonskanalen. Pilene viser kollapset DG. Målestokk representerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Oligomeric Ap 1-42 induserer neuron døden i DG og BF. Kontroll / kjøretøy eller Ap 1-42 (4 ul 100 uM oppløsning) ble infusert inn i venstre og høyre DG av hippocampus, henholdsvis 9 måneder gamle C57BL / 6J mus. Musene ble overlevde i enten 7 eller 14 dager. Hjernene ble serielt seksjonert ved 20 mikrometer per seksjon. (A) 7 dager etter injeksjon hippocampus seksjoner farget for Ap 1-42 (NU4 antistoff, 1: 2000). ML, molekylær laget; GCL, ganglion celle laget; PCL, polymorfe cellelaget. Målestokk representerer 50 mikrometer. (B (C) Kjøretøy eller Ap 1-42 co-injisert med Fluorogold (2% løsning). Fluorogold merking bestemt i BF syv dager etter injeksjonen. Lysbilder som inneholder BF ble tilfeldig valgt. Fluorogold merking ble anvendt for å bestemme området av interesse. Når regionen av interesse ble identifisert tilstøtende hjernen skiver ble brukt til å farge for markører av interesse. De innfellinger er regioner der bildene i (D) er valgt. Målestokk representerer 200 mikrometer. (D) 7 eller 14 dager etter injeksjon BF seksjoner farget for chat (1: 100, geitepolyklonalt) eller TUNEL. *** P <0,001 sammenlignet med en uke. * P <0,05 sammenlignet med vehikkel. Kvantifisering ble gjort på hele regionenav interesse. Grensen mellom den mediale septum og diagonalbåndet avgrenset basert på plasseringen av fremre commissure. Målestokk representerer 100 mikrometer. (N = 5 mus). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å oppnå en vellykket Ap 1-42 injeksjon eksperimentator eller kirurg må: 1) bruke aseptisk teknikk; 2) korrekt identifisere hjernen regionen av interesse med nøyaktige koordinater; 3) være i stand til å sikre riktig mus i stereotaxic ramme med hjernen flatet i AP og ML-aksen; 4) har evnen til å operere mikromanipluatoren med presisjon; 5) sikre riktig postoperativ omsorg. Hvis disse viktige trinnene er fulgt musen skal overleve operasjonen uten observerbar infeksjon.

I samsvar med in vitro-studier, har vi og andre vist at Ap 1-42 direkte innsprøytet i hippocampus utløser nervecellen død 1,4,9,10, som skildrer en av de viktigste funksjonene i AD. Den degenerasjon er tydelig i nærheten av injeksjonsstedet, som vist ved en redusert i volumet av dentate gyrus som suppleres av økninger i markører for degenerasjon 1. Videre, tHan kolinerge nevroner som prosjektet til hippocampus dø i en retrograd måte som vist ved en reduksjon i kolinerge merking og en økning i TUNEL-positiv farging i BF 1,10. Derfor fungerer dette in vivo modellen som en utmerket modell for å undersøke semi-akutte effekter av Ap 1-42 lokalt. Den viktigste fordelen med denne injeksjon modellen er den dynamiske natur: enhver hjerneregionen kan være målrettet og forskjellige gamle dyr kan anvendes. 9 måneder gamle hannmus ble valgt i våre eksperimenter fordi vi tror økende Ap 1-42 nivåer i eldre mus bedre simulerer sykdom som forekommer hos eldre mennesker. Videre ønsker vi å holde eksperimentene konsekvent ved å bruke mus på samme alder. Imidlertid kan mus i alle aldre benyttes til injeksjon. I det siste har vi eksperimentert på mus som var 16 måneder gammel, og andre har brukt mus som var to måneder gammel 9,10. Bare hannmus bør brukes i studier som hunnmus utstillings estrogen nivå svingninger og østrogen er kjent for å ha nervecellene effekter 20. Selv om mange forskningsinteresser sentrum rundt de patologiske effekter av Ap 1-42, er det også bevis for at lave eller fysiologiske Ap 1-42 nivåer er nødvendig for normale funksjoner for læring og hukommelse 21,22. I disse studiene etterforskere senket konsentrasjonen av Ap 1-42 injisert og tilført den inn i hippocampus 22,23, effektivt avsløre enda et eksempel på de dynamiske egenskapene til nytten av dette paradigmet. Andre forbindelser som har blitt tilført stereotaksikalt omfatter narkotika, virus, siRNA, antistoffer, og peptider 1,22-26 å undersøke ulike effekter som spenner fra celledød / overlevelse til dyrs atferd. Dermed er det mange programmer for å bruke denne infusjon paradigme.

Den beskrevne metode infusjonen, mens de oppviser forskjellige potensialer for in vIvo studerer ved hjelp av denne teknikken, også kommer med iboende begrensninger. For det første forsøk denne modellen bare å reprodusere virkningen av Ap 1-42 i et isolert hjernen regionen. For det andre er injeksjonsstedet skadet ved innføringen av en nål inn i hjernen. Dette bidrar til ytterligere celledød og gliose. Derfor har analyser kan utføres bort fra injeksjonskanalen. Med riktig kjøretøy kontroll på motsatt side av den samme hjernen dette burde ikke være et problem som injiseres kjøretøy og Ap 1-42 løsninger spredning til omkringliggende vev. For det tredje fordi BF kolinerge nevroner prosjektet til hippocampus, fysisk skade av hippocampus som tydelig av sammenbruddet av DG av nålen (figur 1B) kan utilsiktet drepe noen BFCNs. Heldigvis undersøke nevronale kretser på kort sikt - innen en uke av en enkelt-shot infusjon - ikke utgjør et problem siden vår data tyder på at den øktekolinerge død i den basale forhjerne er et resultat av Ap 1-42 og ikke fra traumer av kanylen; kontroll injeksjoner gi riktig analyse. Dataene tyder på at degenerasjon av DG er også nødvendig for tap av BF kolinerge nevroner som disse nevronene miste sine synaptiske mål (figur 2B). Dessverre for dyr overlever opptil 2 uker kjøretøyet injisert side viser betydelig heving av BFCN død over 1 uke etter kjøretøy injisert dyr som ser ut til å være delvis skyldes degenerasjon og tynning av dentate gyrus følge av fysiske traumer av nål. Men selv på dette trinn data antyder at det er betydelig mer død i BF ipsilaterale til Ap 1-42 -injected området. For det fjerde kan identifisere subtile anatomiske grenser være vanskelig å oppnå. For eksempel ble grensen mellom mediale septum og diagonalen bandet fastsettes basert på plasseringen av fremrecommissure, en teknikk som tidligere er beskrevet 27. Videre, på grunn av den ipsilaterale BF kolinerge nerve projeksjon - hovedsakelig fra den mediale septum og den vertikale gren av den diagonale bånd (MS / DB) - til dentate gyrus av hippocampus 12,28,29 bestemte vi oss for å injisere en halvkule med Ap 1-42 og bruker motsatt halvkule som kontroll for sammenligning. Det kan tenkes at en bekymring for dette paradigmet ville være riktig identifikasjon av grense skille venstre og høyre MS / DB. Mens MS er i midtlinjen region, DBS er mer sideveis. For denne aktuelle arbeid og vår nyeste utgivelse en kunne vi komfortabelt skille venstre og høyre DB. Vår kvantifisering avslører chat (+) nevroner reduseres med ca 25% i DB i Ap 1-42 -injected side. Men vi gjorde ikke oppdage eventuelle vesentlige endringer i chatten (+) nevroner i MS 1. På grunn av den sideveis locasjon av DBs og endringene observerte vi følte vi var berettiget til å ansette kjøretøy og Ap-1-42 injeksjoner innenfor samme dyret. Videre testing av to forskjellige eksperimentelle betingelser innenfor det samme dyr maksimerer ikke bare bruken av dyret, men også reduserer potensialet dyr til dyr variabilitet. Mens vår eksperimentell design tillater oss å sammenligne venstre og høyre hjernehalvdel det kan tenkes denne sammenligningen teknikken kan ikke være mulig i fremtidige studier, dvs. hvis den mediale septum er hovedfokus for studien. I et slikt tilfelle hvert dyr blir nødt til å tjene som en eksperimentell tilstand. Derfor er bruk av dyr ved skjønn av forskere. Femte, kan dagens injeksjon modellen brukes til andre lese-outs som atferd? Vår hensikt i å bruke den nåværende Ap 1-42 injeksjon modellen var å vurdere nevropatologiske virkningene av Ap 1-42 in vivo og sammenligne den med in vitro funn 1 (figur 1B og 2B) når vi målrette injeksjonsnålen inn i eller i nærheten av DG i 7 dager ødeleggelsen av DG kan gi opphav til uønskede atferdsmessige avvik. Derfor, hvis en studie trenger å undersøke effekten av Ap 1-42 på hippocampale avhengige oppførsel, da injeksjonsmålet kan måtte flyttes nær hippocampus i stedet for direkte inn i den og la Ap 1-42 til å diffundere inn i hippocampus. Når det er sagt, bruk av dagens injeksjons paradigme for atferd testing er mulig, men krever mer testing og karakterisering, og den endelige forsøks strategien vil bli bestemt av sluttbrukeren. Interessant nok har det vært tidligere gnager atferdsstudier som involverer ekstern levering av Ap 1-42 direkte inn i hjernen. 22,30 Samlet utgjør disse begrensningene må vurderes ved utformingen in vivo musestudier som benytter denne modellen.

Siden ingen enkelt musemodell i tilværelsen fanger full patologiske effekter av AD stereotaxic Ap 1-42 infusjon teknikk gir forskere med et alternativ in vivo Ap 1-42 musemodell. Når utført av en godt trent individ denne modellen er best egnet for kortvarige studier som fokuserer på effekten av Ap 1-42 på en bestemt hjernen regionen eller kretser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag gi NS081333 (til CMT), Alzheimers Association stipend NIRG-10-171721 og National Institute of Mental Health tilskuddet MH096702 (UH) og National Institute on Aging-finansierte Alzheimers sykdom Forskning Center ved Columbia University pilot tilskuddet AG008702 (til YYJ og JB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine HCl (100 mg/ml) Henry Schein Medical 1049007 100 mg ketamine per 1 kg animal
Xylazine (20 mg/ml) Henry Schein Medical not available 10 mg xylazine per 1 kg animal
Buprenex (0.3 mg/ml) Henry Schein Medical 1217793 0.1 mg buprenex per 1 kg animal
Aβ1-42 David Teplow/UCLA not available 100 μM; This amyloid was used in the paper
Aβ1-42 Bachem H-1368 Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Aβ1-42 American Peptide 62-0-80B Can be used in place of amyloid from the Teplow lab
Scrambled Aβ1-42 American Peptide 62-0-46B Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) Gift from William Klein/Northwestern U. not available 1:2,000 dilution
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody  (Polyclonal Rabbit) EMD Millipore AB9234 May be used in place of Nu4; needs to  be tested by the end user
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) Biolegend sig-39320 1:1,000 dilution
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) Millipore AB144P 1:100 dilution
DeadEnd Fluorometric TUNEL system Promega G3250 Follow manufacturer's directions for use
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P36935 Use when coverslipping slides
Fluorogold Fluorochrome, LLC not available 2% solution
Absolute Ethanol (200 proof) Fisher Scientific BP2818-4 For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting
Novex 10-20% Tricine gel Life Technologies EC6625BOX For separating Aβ1-42
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Life Technologies LC1675 For running 10-20% Tricine gels
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Life Technologies LC3675 For transferring 10-20% Tricine gels
SuperSignal Western Blot Enhancer Thermo Scientific 46640 For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm GE Healthcare Life Sciences 10402088 For transferring 10-20% Tricine gels
Xcell SureLock Mini-Cell Life Technologies EI0001 Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels
GenTeal Lubricant Eye Gel Novartis not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores
 
Name Company Catalog Number Comments
Refresh Optive Lubricant Eye Drops Allergan not available For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal
Betadine Stoelting 50998 For sanitizing and disinfecting
Round/Tapered Spatula  VWR 82027-490 For opening animal mouth
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) Fine Science Tools 18050-28 Optional; For keeping scalp skin apart during injection
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 14060-11 For cutting scalp
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Surgical Blade Fine Science Tools 10011-00 For making scalp incision
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) Fine Science Tools 91100-12 For holding scalp closed during suturing
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201 For shaving hair
T/Pump Warm Water Recirculator  Kent Scientific  TP-700 For warming animal during surgery
Resusable Warmining Pad (5" x 10") Kent Scientific  TPZ-0510FEA For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery
Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor Stoelting 51615
Just for Mouse Stereotaxic Instrument Stoelting 51730 Can use this in place of Stoelting Cat. #51615
Quintessential Stereotaxic Injector Stoelting 53311
Dry Glass Bead Sterilizer Stoelting 50287 For sterilizing stainless steel instruments
Sterile Surgical Drape (18" x 26") Stoelting 50981
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL Hamilton Company 7637-01 For brain injection; use different syringes for different solutions
29 G Needle, Small Hub RN NDL Hamilton Company 7803-06 For attaching to the Hamilton syringe for brain injection
1 ml BD Tuberculin Syringes VWR BD309659 For administering anesthesia and saline
30 G Needle (0.5") VWR BD305106 For administering anesthesia and saline
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) VWR 65500-202 For weighing animals to determine anesthesia dose
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) VWR 47751-148 For warming animals post-surgery
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm Covidien S1173 For closing wound
Vetbond Tissue Adhesive (3M) Santa Cruz Biotechnology sc-361931 Optional: for aiding in wound closure; Use with suture.
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators Fisher scientific 22-029-488 For cleaning and drying surgical wound
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific  12-550-15 For collecting brain sections
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm VWR 48393241 For mounting microscope slides
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm Fisher Scientific 194-2520 For sterilizing saline solution
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical Medline VIS1422SRL91 For marking coordinates on the skull

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
  2. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
  3. Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
  4. Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
  5. Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
  6. Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
  7. Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
  8. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  9. Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
  10. Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
  11. Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer's disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
  12. Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
  13. Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Second edn, Academic Press. (2001).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
  16. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
  17. Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
  18. Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
  19. Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
  20. Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
  21. Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
  22. Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
  23. Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
  24. Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
  25. Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
  26. Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
  27. Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
  28. Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).
  29. Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
  30. Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).

Tags

Neuroscience amyloid-beta hjerne mus infusjon kirurgi nevrovitenskap
Stereotaksisk Infusjon av Oligomeric amyloid-beta i musen Hippocampus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, … More

Jean, Y. Y., Baleriola, J., Fà, M., Hengst, U., Troy, C. M. Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (100), e52805, doi:10.3791/52805 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter