Abstract
Sin una próspera población activa, célula que está bien distribuido y estable anclada a la plantilla insertada, no se produce la regeneración ósea excepcional. Con las plantillas convencionales, la ausencia de micro-canales internos resultado en la falta de infiltración de células, la distribución y inhabitance profundamente dentro de las plantillas. Por lo tanto, una plantilla altamente poroso y uniformemente interconectado trabecular-similar al hueso con micro-canales (plantilla microambiente biogénico; BMT) ha sido desarrollado para hacer frente a estos obstáculos. La novela BMT fue creado por conceptos innovadores (acción capilar) y fabricado con una técnica de recubrimiento de esponja plantilla. El trasplante de médula ósea consiste en varios componentes estructurales:-poros primarios interconectadas (300-400 micras) que imitan poros en hueso trabecular, micro-canales (25-70 micras) dentro de cada trabécula y nanoporos (100-400 nm) en el la superficie para permitir que las células para anclar. Por otra parte, el trasplante de médula ósea ha sido documentada por el estudio prueba mecánica para tener simILAR propiedades de resistencia mecánica a las del hueso trabecular humana (~ 3,8 MPa) 12.
El BMT exhibió alta absorción, retención y morada de las células a través de las plantillas (pi) en forma de puente (3 cm de altura y 4 cm de longitud). Las células que estaban inicialmente sembradas en un extremo de las plantillas inmediatamente movilizados al otro extremo (10 cm de distancia) por acción capilar del BMT en el medio celular. Después de 4 horas, las células homogéneamente ocuparon todo el BMT y exhiben comportamiento celular normal. La acción capilar representó la infiltración de las células suspendidas en los medios de comunicación y la distribución (migración activa) en todo el TMO. Habiendo observado estas capacidades del BMT, proyectamos que BMTs absorberá células de médula ósea, factores de crecimiento y nutrientes desde la periferia en condiciones fisiológicas.
El trasplante de médula ósea puede resolver las limitaciones actuales a través de la infiltración rápida, la distribución homogénea y inhabitana de las células en las plantillas grandes y volumétricos para reparar defectos óseos masivos.
Protocol
1. Poliuretano (PU) Preparación Esponja como plantilla
- Utilice esponjas de poliuretano para producir plantillas de hidroxiapatita contienen poros interconectados. Use cada esponja para proporcionar las trabéculas primaria para la formación de los puntales de la plantilla, así como la formación de micro-canales dentro de las trabéculas.
- Cortar y recortar 80 ppi (poros por pulgada) esponjas en 2 puentes formas con dimensiones de 3,5 cm de altura x 5 cm de largo x 1,5 cm de ancho.
Nota: Las dimensiones y formas pueden ser elegidos de acuerdo con el tamaño de poro primario deseado: 100 ppi, 80 ppi, y 60 ppi. - Hacer una 100 ml de 4% (w / v) solución de NaOH usando un vaso de precipitados 150 ml; a continuación, sumergir y apretar hasta que las esponjas preparadas están completamente empapados.
- Después de remojar, coloque el vaso con las esponjas en el ultrasonicador (42 kHz).
- Ultrasonidos pre-tratamiento de las esponjas de poliuretano de 15-20 minutos sin calor para modificar las propiedades de la superficie.
- Enjuague con agua destiladaagua durante 5 a 10 min. Si bien aclarado, exprimir las esponjas y les permiten expandir 5 a 7 veces con el fin de quitar el NaOH residual dentro de las esponjas.
- Apriete las esponjas con toallas de papel para eliminar el exceso de agua; luego secarlos en un horno a 60-80 ° C.
2. La hidroxiapatita (HA) preparación de la suspensión para recubrir
- Antes de hacer la suspensión de HA, medir el peso de un vaso de precipitados con una barra agitadora magnética. Esta medición se utilizará para calcular la relación polvo / líquido.
- Medir 10 g de la HA en polvo de tamaño nanométrico.
- Añadir 20 ml de agua destilada en el vaso de precipitados de 50 ml. El calor de 120-140 ° C y remover con un agitador magnético plato caliente.
- Añadir 0,3 g (3% w / w) de alcohol de polivinilo (PVA) (89,000-98,000 MW) por polvo en agua destilada mientras se agitaba a de 300-400 rpm.
- Revuelva hasta que el PVA se haya disuelto completamente. La solución debe ser transparente después de la disolución completa del PVA.
- Gire off el calor y añadir 0,1 g (1% w / w) de carboximetilcelulosa sódica (CMC) (ultra-baja viscosidad) para el polvo mientras se agita a de 400-500 rpm. La solución debe ser transparente después de la disolución completa del PVA.
- Revuelva hasta que el CMC se haya disuelto por completo y enfriar a temperatura ambiente.
- Añadir 0,3 g (3% w / w) de dispersante de poliacrilato de amonio por polvo mientras se agita a de 300-400 rpm. Revuelva hasta que esté completamente disuelta.
- Añadir 0,2 g (2% w / w) de la glicerina por polvo mientras se agita a de 300-400 rpm. Revuelva hasta que esté completamente disuelta.
- Lentamente dispersar el polvo de HA en la solución mientras se agitaba a los 600-900 rpm y se mantiene la agitación durante 5 min.
- Someter a ultrasonidos durante 5 minutos usando un ultrasonicador para asegurar la dispersión de cualquier aglomeración del polvo de HA.
- Añadir un extra de 5 ml de agua destilada a la mezcla con agitación a 600-900 rpm y se calienta a 90 hasta 100 ° C.
- Mantener la agitación la mezcla usando un agitador magnético a 600-800 rpm a 90-100 ° C en order para evaporar el contenido de agua.
- Medir el peso total incluyendo el vaso de precipitados y la mezcla de vez en cuando hasta que se obtiene una relación polvo / líquido de 1,75 a 1,8.
- El formateo de la relación polvo / líquido, dividir el peso del polvo por el peso total de la mezcla de (2.14), que incluye el polvo, reactivos, y el agua, menos el peso del vaso de precipitados y un agitador (2.1), y menos el polvo de HA (2.2).
Nota: Por ejemplo: Si A (mezcla entera incluyendo polvo, reactivos y agua) es 49,05 g, B (vaso de precipitados con agitador) es 33,5 g, y luego C (polvo HA) es de 10 g.
C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 - Permitir que la suspensión se enfríe a temperatura ambiente antes de usar para el recubrimiento.
3. HA recubrimiento, secado y sinterización
- Escudo de las esponjas de poliuretano preparadas con la suspensión de recubrimiento de HA con una espátula de acero hasta que la suspensión se distribuye de forma homogénea en toda la esponja PU sobre una placa de vidrio.
Nota: Después de retirar el exceso de insultory, algunos de los poros todavía puede que se hayan obstruido con suspensión debido a la alta viscosidad de la suspensión. - Con el fin de garantizar la interconexión, la uniformidad, y poros abiertos, ligeramente soplar las plantillas HA recubiertas utilizando un compresor de aire. Este proceso asegura que las plantillas se recubren homogéneamente tanto en las superficies interiores y exteriores de la esponja PU.
Nota: Si no se logra un recubrimiento homogéneo, las plantillas recubiertas de HA colapsarán durante el proceso de sinterización y también pueden agrietarse durante la manipulación debido a la baja resistencia mecánica. Además, el recubrimiento homogéneo es crítico en la creación de los micro-canales dentro de las trabéculas. - Seque las plantillas HA recubiertas por un mínimo de 5 horas bajo condiciones de refrigeración (20-25 ° C), con una circulación de aire suave. Sin embargo, extender el tiempo de secado en función del tamaño de la plantilla.
Nota: Después del secado, las plantillas HA revestidas típicamente reducir aproximadamente 8% a 10% en cada dimensión. - Después de que el proceso de secado, coloque el HAplantillas recubierto en un crisol de alúmina. Luego, colocarlos en un horno de alta temperatura y utilizar el siguiente perfil de sinterización 8 paso.
- Heat 2 ° C / min hasta 230 ° C.
- Caliente 1 ° C / min hasta 280 ° C.
- Calentar 0,5 ° C / min hasta 400 ° C.
- Heat 3 ° C / min hasta 600 ° C. Mantenga a 600 ° C durante 1 hora.
- Heat 5 ° C / min hasta 1230 ° C. Mantener 1230 ° C durante 3 horas.
- ! 5 ° C / min a RT.
Nota: La sinterización se reducirá aún más las plantillas de esponja HA revestidos en aproximadamente 22% - 25% en cada dimensión.
4. Ingreso y inhabitancy de celdas en la plantilla
- Cultura células MC3T3 pre-osteoblásticas en un medio no osteogénico que consiste en α-MEM, suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibióticos (estreptomicina y penicilina) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 .
- Añadir 10 mlde una suspensión celular a 2 x 10 6 densidad celular en un único bien dentro de una placa de 6 pocillos.
- Coloque la plantilla en forma de puente de 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalmente en la placa de 6 pocillos. Coloque una pata de la plantilla en la placa que contiene la suspensión de células, y la otra pierna en un pozo vacío adyacente.
- Permitir que la plantilla para absorber la suspensión celular durante 10 min.
- Añadir 5 ml de los medios de comunicación a partir de entonces hasta el pozo que estaba lleno originalmente con la suspensión celular.
- Reponer el medio en ambos pozos cada 2 ó 3 días hasta que hayan transcurrido 7 días.
- Determinar la eficacia de la movilidad celular por tinción con hematoxilina y eosina 11.
- Fijar las células y andamio por inmersión en EtOH al 100% durante 20-30 minutos.
- Mancha con hematoxilina durante 1-2 minutos.
- Enjuague con agua destilada durante 1-2 minutos por el doble.
- Deshidratar por inmersión en 70%, entonces 95%, entonces 100% de EtOH durante 1-2 min cada uno.
- Mancha con eosina durante 20-30 segundos.
- Enjuague con agua destilada durante 12 minutos para dos veces.
- Deshidratar por inmersión en 70%, 80%, 90% y 100% de EtOH durante 1-2 min cada uno.
- Insertar el andamio en una resina acrílica para seccionar y de imagen.
- Determinar la viabilidad celular con los de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) ensayo de viabilidad celular y el ensayo Live / Dead (kit de tinción de células vivas / muertas MPTP) en el tiempo de puntos del día 3 y 7 11.
Nota: El esquema de protocolos de fabricación plantilla de hueso como se representa en el "Los resultados representativos" sesión.
Representative Results
La estructura general del BMT exhibe una plantilla tridimensional único con estructuras internas de hueso trabecular-similares. El trasplante de médula ósea contiene macroporos, micro-canales, y nano-poros. Configuraciones claras de totalmente interconectadas macro-poros (tamaño medio de 320 micras), micro-canales (diámetro medio de 50 micras), y nano-poros (tamaño promedio de 100 nm) se verificaron con un microscopio electrónico de barrido (EVO-40; ZEISS), así como a través de micro-tomografía.
La figura 1 muestra los protocolos detallados paso a paso en la creación de un trasplante de médula ósea. A través de un control preciso de los protocolos de la preparación de las esponjas de poliuretano en el proceso de sinterización (P1 - P7; Figura 1), las siguientes funciones se pueden lograr: una superficie muy densa y suave después del recubrimiento de HA y secado; una precisión de forma y tamaño de plantilla 3-D; una red trabecular porosa totalmente interconectada similar a la del hueso trabecular; y micro-canales ingeniohin cada trabécula que imitan los canales intra-óseas tales como canales de Havers y canales de Volkmann (Figuras 2 y 3). Además, resistencia mecánica relativamente alta (~ 3,8 MPa) similar a la del hueso trabecular humano se midió mediante una prueba de resistencia a la compresión. Parámetros histomorfométricos altamente similares con las de las vértebras lumbar humana hueso trabecular se confirmaron mediante análisis micro-CT 12. Diferentes magnitudes de la acción capilar se demostraron a través de diferentes diámetros capilares en la Figura 4 mediante simulación computacional. A través de estas simulaciones, proyectamos que el trasplante de médula ósea podría exhibir tasas de absorción variables dentro de los poros-primarios (300-400 micras) y micro-canales (25 a 70 micras) en base a los diámetros. Capilares más pequeños mostraron capacidades de absorción más fuertes. Esta suposición se verificó en este experimento como se muestra en la Figura 5.
El BMT mostró altamente eficazla absorción y retención de fluidos a través de la acción capilar de las estructuras micro-canal; mancha azul de Stevenel se usó como el medio fluido a seguir fácilmente el flujo (Figura 5). Sobre la base de la simulación computacional, el BMT con estas configuraciones se observaron para absorber y retener las suspensiones de células de hasta 8,5 cm en la distancia total dentro de 10 seg. Debido a una fuerte acción capilar inducida por las estructuras internas, el medio manchado alcanzó el extremo opuesto de un 3 cm (altura) x 4 cm (longitud) x 1 cm (anchura) de plantilla en forma de puente dentro de 1 min y 40 seg. Además, se observó la movilización de células activo y la incorporación en el BMT (Figura 6). Posteriormente, la movilización de células homogénea y el apego resultaron en una mayor proliferación y formación de la matriz en una formación distribuida de manera uniforme. Por otra parte, de larga distancia (~ 10 cm) migración de las células a través del trasplante de médula ósea fue validada inmediatamente después del trasplante de médula ósea se saturó con la suspensión de células. Se EDED células sobrevivieron en el segmento de plantilla que se expone al aire y no sumergido en el medio de cultivo. En este experimento, se proporcionó el medio de cultivo para las células por exclusivamente en los pocillos que tocan sólo las patas de la andamio. La acción capilar mostrada por los microcanales después se dejó para el medio fresco para llegar a la, parte de puente superior del andamio. Después de 3 días de cultivo, la plantilla se hizo ocupado con células que proliferan rápidamente. Después de 7 días de cultivo, cada trabécula fue envuelto por las matrices extracelulares y embebidos con células 13.
Figura 1. El protocolo de fabricación plantilla similar al hueso en general desde el pre-tratamiento de la PU esponja (P1) para el tratamiento térmico final (P7). Manteniendo el perfil preciso de sinterización después de P7 es crucial en la consecución de una resistencia mecánica favorable.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 2 microscopio estereoscópico Representante (AmScope; SM-2TZ-M) imágenes (x4) de un ppi 80 dimensionada PU esponja (izquierda), HA revestido y se seca BMT (centro) y BMT sinterizado (derecha) (Dimensión: 3. cm de altura x 4 cm de largo x 1 cm de ancho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. SEM y micro-CT imágenes de una plantilla de biogénica: (A) una imagen global de una plantilla biogénico,
. Figura 4. cálculo computacional de la acción capilar con diferentes diámetros de canal En el mismo período de tiempo (0,4 ms), mientras que el más grande capilar (d = 300 m: se refiere a poro primaria) absorbe el medio (azul) hasta 0,16 mm la altura, el capilar más pequeño (d = 30 m: se refiere a las micro-canales) absorbe el medio hasta 0,415 mm de altura. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Imágenes mostraron diferencias de capacidades de absorción de la acción capilar a base de diferentes tamaños de poros-primarios y micro-canales (tamaño de poro primaria se refiere al diámetro medio: 60 ppp ≈ 470 m, 80 ppi ≈ 320 m, ≈ 100 ppi 200 micras). Las líneas amarillas representan la acción capilar inducida por la combinación de los poros primarios y micro-canales. Las líneas rojas representan la acción capilar inducida por principalmente micro-canales exhibidos en cada trabécula. Como se muestra en (F), la plantilla 100 ppi indujo la acción capilar más fuerte, dando lugar a la saturación completa de la plantilla dentro de 39 seg. Las plantillas de 80 ppi y 60 ppi fueron probados a partir de entonces. (B) 0 seg, (C) 0,5 seg, (D) 1,5 seg, (E) 17,0 seg, (F) 39,0 seg, (G) 50,0 seg, y (H) 1 min 18 seg después de la inmersión. (Dimensión Plantilla: 1cm x 1 cm x 4 cm de altura cúbico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. La entrada y la inmigración de las células de los pozos sin semillas (parte I) a los pozos no cabezas de serie (parte V) a través de las plantillas biogénicas inducidos por la acción capilar. Las células sembradas inicialmente llegaron al final de la pierna no cabeza de serie (parte V) inmediatamente después la saturación completa. Después de 3 días, la confluencia de las células era evidente a lo largo de toda la plantilla. Después de 7 días, la formación de la matriz de colágeno espacio-temporal se produjo dentro de las poblaciones de células (H & E stain). (Dimensión Plantilla: 3 cm de alto x 4 cm de largo x 1 cm de ancho). Por favor, click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Se necesita una plantilla de varios componentes incluyendo las células, factores de crecimiento, nutrientes, etc. para la regeneración ósea exitoso y restauración funcional de los defectos óseos grandes críticos de tamaño. Dentro de estos factores, propiedades biológicas anatómicamente conformes son esenciales. Para lograr la funcionalidad biológica, la plantilla debe exhibir biocompatibilidad, osteoconductividad, integridad mecánica, área de superficie suficiente, adecuada textura de la superficie, y los medios para el transporte de nutrientes y oxígeno. A nivel celular, las siguientes características son especialmente crucial para la restauración funcional de los defectos óseos masivos: la penetración facilitado en plantilla (reclutamiento activo), la distribución uniforme en toda la plantilla (de retención), la proliferación acelerada y alta viabilidad (morada). Por último, la subsiguiente formación de matriz extracelular sustancial y el desencadenamiento de la expresión génica son cruciales en los procesos biológicos esenciales, tales como la rápida vascularización unaosteogénesis nd.
Se han propuesto muchos tipos diferentes de sustitutos sintéticos para reemplazar / asignaciones injertos óseos auto-. Sin embargo, la organización andamio actual no presenta un microambiente interno que contiene micro-canales y nano-poros, y por lo tanto no facilita la infiltración de células activamente, distribución y inhabitance profundamente en los sustitutos sintéticos que son mayores que 10 mm. No proporcionan señales físicas por ser pionero en las células de manera eficiente, migrar rápidamente y uniformemente profundamente en la plantilla de los huesos. En su lugar, el reclutamiento pasiva limitado de células crea una poblaciones de células distribuidas de manera desigual entre las zonas exteriores e interiores del andamio. Esto no sólo agrava el desafío inicial de las células alcanzan el núcleo interno de la plantilla, pero también dificulta el flujo de nutrientes y la comunicación celular con el otro extremo del sustituto sintético. Este tipo de contratación y habitar resultados celulares desproporcionada en la celda death y huesos incompletos crecimiento tras el andamio ha sido implantado en el cuerpo 14,15.
Por lo tanto, hemos introducido el concepto de acción capilar como la señal física primaria para abordar estos obstáculos. Hemos diseñado minuciosamente microcanales en el trasplante de médula ósea para inducir la acción capilar que tener en cuenta la fuerza de arrastre principal responsable de reclutar activamente a las células profundas en el trasplante de médula ósea.
La técnica de recubrimiento esponja PU presenta varias propiedades únicas. En primer lugar, permite una fácil preparación de las estructuras trabeculares porosas bien controlados, que a su vez dependen de las estructuras de plantilla predefinida (es decir, 80 poros por pulgada plantilla para de 300-400 micras). Esto es muy importante para la optimización de tamaño de poro para la infiltración de los osteoblastos 15. En segundo lugar, la técnica permite la construcción de micro-canales interconectados, que representan el papel importante de la inicialización de reubicación celular 11. En tercer lugar, casi no hay limitaciones cuando se utiliza la esponja PU en términos de creación de formas y tamaños de las plantillas personalizadas. El fabricante puede utilizar una tijera de formas simples o de corte por láser, incluso computarizada para geometrías complejas. El uso de estas tecnologías controladas con precisión, creamos el TMO. HA fue seleccionado como el material de partida debido a su biocompatibilidad y la capacidad osteoconductiva 17.
En este estudio, hay varios pasos críticos que deben ser destacados. Durante la preparación de la suspensión HA, si la temperatura es demasiado alta y la velocidad de agitación es demasiado baja, la suspensión HA se quedarán atascados en los bordes inferiores de la vaso de precipitados y se secan. Después del proceso de revestimiento cuando se sopla hacia fuera el exceso de suspensión HA, demasiado alto de una presión de aire puede inducir grietas en la superficie del BMT. Es importante mantener la presión de aire relativamente baja para ventilar adecuadamente el exceso de lechada Sólo AH. Por último, la segunda y la tercera etapas del proceso de sinterizaciónson más crucial (Heat 1 ° C / min hasta 280 ° C y calor 0,5 ° C / min hasta 400 ° C). En este rango de temperatura, la esponja PU se quema por completo, mientras que el HA se vuelve denso. Si este protocolo no se sigue de cerca, el BMT se colapsó o se derrumbó después de la sinterización.
El BMT se describe en este estudio ofrece varias ventajas. En primer lugar, los macroporos interconectados (300-400 micras) son similares a los del hueso trabecular humana y permite el flujo de la médula ósea suave. En segundo lugar, las plantillas se componen de micro-canales (25-50 micras) dentro de cada tabique trabecular para acelerar la penetración inicial de las células óseas a través de la acción capilar. Como se ha demostrado mediante simulación computacional 13, si la plantilla sólo tenía 300 micras poros (poros primarios) y no hay microcanales, la acción capilar sería insuficiente para la saturación completa de la plantilla con la médula ósea. Esto sería especialmente cierto para los defectos de gran tamaño que requieren lplantillas de tamaño arge. De tamaño micrométrico canales exhiben absorción de líquidos altamente efectivo, y por lo tanto espera que los microcanales a ser el principal responsable de la acción capilar en nuestro estudio. En tercer lugar, nuestros BMTs han colocado estratégicamente nano-poros. Los datos de la literatura indican que las células son especialmente sensibles a nano-patrones 18,19; Por lo tanto, esperábamos las nano-poros en las paredes de los microcanales para jugar un papel en el aumento de la unión celular. Poros de tamaño nanométrico (de 100-400 nm) en la superficie de los septos trabecular permitió células para anclar inmovilizado. En general, los efectos combinados de estas tres estructuras internas resultaron en una mayor movilización de células y la adhesión a lo largo de la plantilla. Sin embargo, hay algunas limitaciones del protocolo y los pasos críticos para fabricar el BMT perfecto. Por ejemplo, a menudo hay una gran cantidad de HA suspensión preparada debido a la dificultad de mantener una viscosidad homogénea mientras recubrimiento. También hay una limitación en la fabricaciónplantillas de más de 5 cm 3 de volumen debido al tiempo de trabajo, mientras recubrimiento. El espesor del recubrimiento es crítico que varía en función de las técnicas del fabricante.
Los resultados de nuestro estudio sugieren que el trasplante de médula ósea capaces de absorber y retener las células ofrecen potenciales ventajas sobre aloplástica convencional (o sintético) andamios. Un estudio prospectivo se está considerando para verificar los beneficios de BMT en la osteogénesis y / o angiogénesis junto con factores de crecimiento relacionados con el hueso. Por lo tanto, afirmamos que nuestra única andamio BMT ofrecido puede abordar los principales obstáculos de la infiltración de la médula ósea insuficiente en las construcciones sintéticas y regeneración ósea incompleta en grandes defectos.
El objetivo final de este estudio es el de simplificar el actual paradigma de la bioingeniería en la reconstrucción ósea y la restauración funcional en defectos óseos críticos empresas al eliminar la necesidad de estroma de la médula ósea tiempo- / mano de obra intensivaaislamiento l células y expansión procesos. Por último, nuestro objetivo es utilizar anatómicamente conforme 3D construcciones con micro-canales y nano-poros, que inducen una rápida absorción celular, distribución homogénea y habitabilidad para la reconstrucción del hueso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
| Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |
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