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Neuroscience

चूहे रेटिना वर्णक उपकला में जीन थेरेपी के लिए वायरल वाहक के Limbal दृष्टिकोण subretinal इंजेक्शन

Published: August 7, 2015 doi: 10.3791/53030
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2,4
1Department of Biomedical Sciences, Seoul National University College of Medicine, 2FARB Laboratory, Biomedical Research Institute, Seoul National University Hospital, 3College of Life Sciences, Gwangju Institute of Science and Technology, 4Department of Ophthalmology, Seoul National University College of Medicine

Introduction

नेत्र विज्ञान में, जीन थेरेपी monogenic विरासत में मिला retinopathies में उपचार के साधन के रूप में उभरा है। लेबर जन्मजात amurosis 1,2, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा 3, और अरंजितपटलता 4 सहित रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में जीन के साथ जुड़े विरासत में मिला retinopathies कर रहे हैं। जीन थेरेपी के अनुसंधान के क्षेत्र पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन और ऐसे एडिनो -associated वायरस (एएवी), lentivirus (एल.वी.) और Adenovirus (एडी) के रूप में वायरल वैक्टर का उपयोग क्लिनिकल परीक्षण दोनों में विस्तार हो रहा है 5। विभिन्न वायरल वैक्टर रेटिना में अलग tropism है। एक सुरक्षित और प्रभावी जीन थेरेपी के लिए, वायरल वैक्टर ध्यान से लक्ष्य कोशिकाओं और लक्ष्य जीन के अनुसार चयन किया जाना चाहिए।

प्रभावी जीन डिलीवरी कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए जीन वितरण का मार्ग इस प्रकार, यह सावधानी के रूप में अच्छी तरह से चुना जाना चाहिए, यह भी महत्वपूर्ण है। वायरल वाहक के अंतःचाक्षुष प्रसव के लिए दो सबसे आम तरीकों subret रहे हैंinal इंजेक्शन और intravitreal इंजेक्शन 6। उत्तरार्द्ध, intravitreal इंजेक्शन, व्यापक रूप से मधुमेह रेटिनोपैथी 7 में गीला उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) और धब्बेदार शोफ में choroidal neovascularization के इलाज के लिए दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया है। Intravitreal मार्ग शीशे और भीतरी रेटिना को वायरल वाहक के जोखिम प्रदान करता है, लेकिन बाहरी रेटिना को वैक्टर के प्रसार सीमित है। दूसरी ओर, subretinal मार्ग एक स्थानीय छाला उत्प्रेरण, रेटिना और RPE के बीच संभावित अंतरिक्ष करने के लिए वायरल वैक्टर के प्रत्यक्ष प्रसव प्रदान करता है। इसलिए, subretinal इंजेक्शन वर्तमान में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और RPE को लक्षित करने के लिए एक अधिक कुशल मार्ग माना जाता है। शल्य दृष्टिकोण के संदर्भ में, प्लाना मानव रोगियों में रेटिना क्षति से बचने के लिए intravitreal इंजेक्शन के लिए एक सुरक्षित क्षेत्र के रूप में चुना गया है पार्स। बस चूहों के लिए इस दृष्टिकोण को संशोधित करके, हम limbal दृष्टिकोण के माध्यम से subretinally या intravireally वायरल वैक्टर इंजेक्षन सकता है।

इस वीडियो मेंलेख, हम चूहों RPE में वायरल वाहक के subretinal इंजेक्शन का एक आसान और सुविधाजनक तरीका प्रदर्शित करता है। एक 30 ग्राम 1/2 सुई के साथ किनारी के पीछे में एक पंचर करने के बाद, एक 33 जी कुंद सुई सुसज्जित माइक्रोलीटर सिरिंज limbal पंचर साइट के माध्यम से subretinal अंतरिक्ष में डाला जाता है। 1.5 के वायरल वैक्टर - 2 μl मात्रा रेटिना और RPE subretinal blebs उत्प्रेरण के बीच संभावित अंतरिक्ष के लिए इंजेक्ट कर रहे हैं। यह प्रक्रिया शल्य माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रत्यक्ष दृश्य के तहत किया जा सकता है। बार-बार अभ्यास भी छाला गठन के प्रत्यक्ष दृश्य के बिना replicable के परिणाम की गारंटी होगी। इस चूहों RPE में subretinal जीन डिलीवरी के लिए सटीक और timesaving प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए शोधकर्ताओं में मदद मिलेगी।

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Protocol

सभी जानवरों पर प्रयोगों नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए दृष्टि और नेत्र विज्ञान वक्तव्य में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के अनुसार में प्रदर्शन, और दिशा निर्देशों और नियमों सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति और सियोल नेशनल द्वारा निर्धारित किया गया विश्वविद्यालय अस्पताल जैव सुरक्षा समिति।

1. इंजेक्शन किट और वायरल वाहक की तैयारी

  1. इथिलीन ऑक्साइड गैस का उपयोग निष्फल एक 33 जी कुंद सुई से लैस माइक्रोलीटर सिरिंज तैयार करें। माइक्रो ट्यूब (यानी, 1 एक्स 10 6 टीयू / μl) में पर्याप्त अनुमापांक के लिए पीबीएस में वायरल वैक्टर पतला। सिरिंज में किसी भी मृत अंतरिक्ष दूर करने के लिए सिरिंज वायरल वैक्टर के साथ कई बार फ्लश।

वायरल वाहक 2. subretinal इंजेक्शन

  1. Tiletami के मिश्रण की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ - (8 सप्ताह पुरानी है, यानी 6) वयस्क चूहों चतनाशून्यपूर्वोत्तर और zolazepam (1: 1, 2.25 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) और xylazine हाइड्रोक्लोराइड (0.7 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) या एक वैकल्पिक उपयुक्त संज्ञाहरण शासन।
  2. Phenylephrine 0.5% की एक आंख की गिरावट के साथ विद्यार्थियों को चौड़ा और 0.5% tropicamide।
  3. वायरल वैक्टर के 2 μl - 1.5 के साथ लोड करके माइक्रोलीटर सिरिंज तैयार करें।
  4. पलक खोलें और सुविधाजनक इंजेक्शन के लिए भूमध्य रेखा बेनकाब और ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के अंतर्गत पर ध्यान केंद्रित करने के लिए आँख फैलाना। इंजेक्शन के दौरान हो सकता सुई का इंजेक्शन, या विस्थापन खत्म कर जब तक protruded आँख की स्थिति बनाए रखें। मजबूती से नेत्रगोलक पकड़ करने के लिए, कक्षीय रिम के बाहर उंगलियों रखें।
  5. कॉर्निया की सतह के लिए नेत्र viscoelastic समाधान की एक बूंद लागू करें।
  6. रेटिना कल्पना करने के लिए कॉर्निया की चोटी पर एक छोटे से दौर कवर स्लाइड रखें।
  7. आगे subretinal इंजेक्शन के लिए एक बाँझ 30 ग्राम 1/2 सुई का उपयोग किनारी को मामूली पीछे एक छोटा सा छेद पंचर। के लिए छेद अवर बनाओआर दाहिनी आंख, और सुविधा के लिए बाईं आंख के लिए बेहतर।
    नोट: छेद लौकिक या नाक में किया जाता है, यह इंजेक्शन के बाद पलक द्वारा कवर किया जाना मुश्किल है। प्रारंभिक पंचर थोड़ा बनाया किनारी के साथ चलाने के लिए और आसानी से पहचाना जा सकता है जो limbal जहाजों से बचने के लिए किनारी के पीछे जाना चाहिए। प्रारंभिक पंचर कर रही है जबकि सुई के साथ लेंस मार से बचने के लिए सावधान रहें। लेंस पंचर से बचने के लिए सुई की पूरी बेवल सम्मिलित नहीं करें।
  8. पूर्व की हवा निकाल दी छेद के माध्यम से माइक्रोलीटर सिरिंज का 33 जी कुंद सुई प्लेस और हल्के प्रतिरोध महसूस किया है जब बिंदु तक subretinal अंतरिक्ष में सुई दृष्टिकोण।
    नोट: subretinal इंजेक्शन के लिए, सुई का सबसे अच्छा तरीका कोण आईरिस विमान के खिलाफ 45 डिग्री के बारे में है, और कुंद सुई peripapillary क्षेत्र की ओर पीछे धकेल दिया जाना चाहिए। बिंदीदार वर्ग subretinal injectio के लिए कांच का गुहा भर में सुझाव दिया सुई मार्ग संकेत दियाचित्रा 1 एन।
    नोट: वे बहुत नरम हैं के रूप में चुभ (या गुजर) रेटिना परतों जब कोई विरोध नहीं महसूस किया होगा। इस प्रकार, हल्के प्रतिरोध के पहले महसूस कर सुई पहले से ही RPE परत को छुआ है और सुई की प्रविष्टि बंद कर दिया जाना चाहिए कि इंगित करता है। सुई संभावित subretinal अंतरिक्ष में रखा जाना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक दबाव के साथ scleral ऊतक घुसना करने के लिए नहीं सावधान रहना। सुई अत्यधिक शक्ति द्वारा स्क्लेरल ऊतक punctures हैं, तो यह प्रतिरोध के बिना दृष्टितर कक्षीय रिक्त स्थान में प्रवेश करती है। (यह कदम महत्वपूर्ण है)

चित्र 1
Subretinal इंजेक्शन की चित्रा 1. योजनाबद्ध आरेख। एच ई चिह्नित subretinal इंजेक्शन के लिए एक सुई मार्ग के साथ संरचनाओं का चित्रण माउस आँख का दाग पार अनुभाग (एक बिंदीदार वर्ग)। आवर्धन: 40X, स्केल बार: 500 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. अवांछित ऊतकों को नुकसान से बचने और धीरे सुई वापस लेने के लिए कंपन के बिना subretinal अंतरिक्ष में धीरे वायरल वैक्टर (यानी, 1 एक्स 10 6 टीयू / μl) इंजेक्षन। 2.4 में वर्णित के रूप में इंजेक्शन के दौरान मजबूती से नेत्रगोलक पकड़ो।
  2. कोई रेटिना खून बह रहा है सुनिश्चित करने के लिए ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन के बाद subretinal छाला के गठन का निरीक्षण करें।

चित्र 2
चित्रा 2 रेटिनल नकसीर बिना subretinal Belb गठन। ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत subretinal इंजेक्शन के बाद subretinal belb की सूक्ष्म देखें रेटिना रक्तस्राव के बिना सफल छाला गठन से पता चलता है।एम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,030 / 53030fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. धीरे स्वयं सील के लिए इंजेक्शन साइट को कवर करने के लिए पलक बंद कर दें। घर पिंजरे में चूहों पर लौटें और मूल्यांकन जब तक जीवित रहते हैं।
    नोट: शोधकर्ताओं प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया पाने के बाद, वे इन चरणों का लंघन द्वारा तेजी से प्रक्रियाओं के साथ repeatable परिणाम मिलता है (2.5, 6, और 10) कर सकते हैं

रेटिना वर्णक उपकला में जीन डिलीवरी की प्रभावकारिता की 3. मूल्यांकन

  1. सीओ 2 कक्ष में चूहों बलिदान। कैंची का उपयोग आँखों मालूम करना।
  2. कुछ दिनों के लिए एक न्यूनतम 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde समाधान में आँखों को ठीक करें।
  3. ठीक संदंश के साथ कॉर्निया को पकड़ो और सूक्ष्म कैंची से कॉर्निया पंचर। किनारी साथ scissoring के बाद कॉर्निया निकाल दें। संदंश के साथ लेंस निकालें।
  4. मीटर के साथ सिलिअरी शरीर ट्रिमरेटिना टुकड़ी की इजाजत दी ICRO-कैंची। धीरे RPE / रंजित / श्वेतपटल परिसर से पूरे रेटिना खींच। फ्लैट बढ़ते के लिए 4 से 8 पत्ते बनाने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका में कई बार के पास के केंद्र के लिए परिधि से त्रिज्यात RPE / रंजित / स्क्लेरल जटिल काटें।
  5. नीचे RPE के पक्ष बनाने के लिए, और मांसपेशियों, कंजाक्तिवा और ऑप्टिक तंत्रिका सहित स्क्लेरल पक्ष में शेष सभी ऊतकों ट्रिम करने के लिए RPE / रंजित / स्क्लेरल जटिल फ्लिप। किसी भी शेष ऊतक जटिल असमान बनाता है क्योंकि यह कदम एक फ्लैट RPE / रंजित / स्क्लेरल जटिल बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. (विस्तृत तरीकों के लिए संदर्भ देखें, वैकल्पिक) अपने विशिष्ट अनुसंधान प्रयोजनों के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जटिल सेते हैं। कांच की स्लाइड पर RPE / रंजित / स्क्लेरल परिसरों फ्लैट माउंट और एक शोषक स्पंज के साथ पीबीएस को अवशोषित।
  7. बढ़ते समाधान के 30 μl जोड़ें और कवर स्लाइड रखें। Fluorescein खुर्दबीन के नीचे वेक्टर वितरण की प्रभावकारिता के लिए नमूना निरीक्षण करें। में नमूने रखेंआगे अवलोकन के लिए फ्रिज।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के द्वारा वायरल जीन पारगमन पर subretinal इंजेक्शन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, हम सूचक के लिए GFP और आरएफपी दोनों व्यक्त सीएमवी प्रमोटर के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एल.वी. वैक्टर का इस्तेमाल किया। आंखें अनुसंधान के उद्देश्य के अनुसार उचित समय अवधि के बाद enucleated गया। प्रतिनिधि परिणामों के लिए, आंखों के 10 सप्ताह और subretinal इंजेक्शन के बाद 20 सप्ताह enucleated गया। ऊपर वर्णित विधि का उपयोग रेटिना के पूरी तरह हटाने के बाद, RPE / रंजित / श्वेतपटल परिसर के फ्लैट माउंट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन किया गया था। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 ए (रेटिना के पूरी तरह हटाने के साथ अच्छा उदाहरण) और चित्रा 3 बी (बरकरार रेटिना के साथ गरीब उदाहरण) में दिखाया गया है। RPE परत से अधिक अवशेष तंत्रिका रेटिना (विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड) के अस्तित्व RPE में जीन वितरण के क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए हस्तक्षेप नहीं किया है, यह GFP / आरएफपी और हिचकते प्रत्यक्ष visua के प्रतिदीप्ति अवरुद्ध कियाआगे के विश्लेषण के लिए RPE परत की lization। इसलिए, RPE / रंजित / श्वेतपटल परिसर से तंत्रिका रेटिना की पूरी तरह हटाने के बेहतर परिणाम प्रदान करेगा।

चित्र तीन
चित्रा 3. scleral RPE / रंजित / का उदाहरण परिसर फ्लैट माउंट रेटिना के पूरी तरह हटाने के अनुसार। बीस सप्ताह GFP / आरएफपी जीन के साथ lentivirus के subretinal इंजेक्शन के बाद। फ्लैट रेटिना के पूरी तरह हटाने के साथ माउंट (ए) RPE का अच्छा उदाहरण RPE कोशिकाओं में GFP / आरएफपी के स्पष्ट और असतत अभिव्यक्ति से पता चलता है। रेटिना का कोई हटाने के लिए RPE विकृति का विश्लेषण करने के लिए अपर्याप्त है जो आरएफपी संकेतों के साथ जीन वितरण के क्षेत्र से पता चलता है की वजह से (बी) RPE के गरीब उदाहरण फ्लैट माउंट। आवर्धन: 40X, स्केल बार:। 500 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(यानी 2 μl) के अनुसार वायरल अनुमापांक के अनुसार GFP / आरएफपी अभिव्यक्ति की मौजूदगी से प्रभावकारिता न्याय करने के लिए और अधिक विश्वसनीय हो जाएगा। इस प्रयोग के लिए उपयुक्त वायरल अनुमापांक को समायोजित करने में मदद करता है।

subretinal इंजेक्शन चित्रा 4 (40x) और चित्रा 5 (400X) में विभिन्न बढ़ाई में दिखाया गया के बाद RPE / रंजित के प्रतिनिधि परिणाम / स्क्लेरल फ्लैट जटिल 10 सप्ताह माउंट। कम बढ़ाई साथ छवियों GFP / आरएफपी अभिव्यक्ति के क्षेत्र का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त हैं। दूसरी ओर, उच्च वृद्धि के साथ छवियों को 'शोधकर्ताओं ने विशिष्ट प्रयोजनों के लिए के बारे में अन्य RPE विकृति विज्ञान के लिए आवश्यक हैं। इन छवियों को बुद्धिज विभिन्न आवर्धन RPE में वायरल अभिव्यक्ति पैटर्न को समझने में मदद (चित्रा 4 और 5)। हम भी 36 सप्ताह के बाद इंजेक्शन के लिए ऊपर GFP / आरएफपी की अभिव्यक्ति की जाँच की है। GFP / आरएफपी की अभिव्यक्ति अभी भी 36 सप्ताह के बाद इंजेक्शन के बाद मनाया गया (डेटा) नहीं दिखाया।

चित्रा 4
चित्रा 4. RPE के उदाहरण scleral / रंजित / जटिल GFP / आरएफपी जीन (आवर्धन: 40X) के साथ lentivirus के subretinal इंजेक्शन के बाद 10 सप्ताह फ्लैट माउंट। (ए) ग्रीन चैनल GFP (बी) आरएफपी के लिए लाल चैनल के लिए। स्केल बार:। 500 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. फ्लैट परिसर scleral RPE / रंजित / का उदाहरणGFP / आरएफपी जीन (आवर्धन: 400X) के साथ lentivirus के subretinal इंजेक्शन के बाद -mount 10 हफ्तों। (ए) के GFP (बी) आरएफपी के लिए लाल चैनल के लिए ग्रीन चैनल। स्केल बार:। 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस वीडियो लेख में, हम RPE / रंजित / स्क्लेरल फ्लैट पर्वत के प्रतिनिधि परिणामों के साथ विस्तार से limbal-दृष्टिकोण subretinal इंजेक्शन तकनीक का वर्णन किया। इस RPE में वायरल वाहक के subretinal इंजेक्शन के लिए एक आसान और सुविधाजनक तकनीक है। इंजेक्शन के दौरान छाला गठन के प्रत्यक्ष दृश्य शुरुआती के लिए सही वितरण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। कल्पना प्रयोगों 8-10 के जर्नल में शुरू की कुछ subretinal इंजेक्शन तकनीक है। Subretinal अंतरिक्ष रेटिना और RPE के बीच संभावित जगह नहीं है, इसलिए subretinal अंतरिक्ष दृष्टिकोण करने के लिए दो संभावित मार्गों हैं। एक कांच और रेटिना के माध्यम से subretinal अंतरिक्ष करने के लिए एक के अंदर दृष्टिकोण है और अन्य RPE और श्वेतपटल के माध्यम से एक के बाहर दृष्टिकोण है। इस limbal-दृष्टिकोण subretinal इंजेक्शन तकनीक intravitreal अंतरिक्ष और रेटिना के माध्यम से पूर्व एक है। इस तकनीक के उत्तरार्द्ध की तुलना में अधिक पीछे छाला गठन प्रदान करने के लिए एक फायदा है बाद में एक है क्योंकिpproach परिधीय रेटिना खत्म कर दिया जाना चाहिए जो स्क्लेरल सुरंग खोदने या चीरा के माध्यम से परिधीय ओर से एक छाला बना देता है। इसके अलावा, सरल limbal पंचर रेटिना पैठ बिना स्क्लेरल सुरंग खोदने की तुलना में आसान है। नवजात चूहों के लिए, तथापि, यह बाहर दृष्टिकोण 9 उपयोग करने के लिए अधिक उपयुक्त होगा। नवजात माउस के नेत्रगोलक बहुत छोटा है और लेंस से भरा है, क्योंकि limbal-दृष्टिकोण तकनीक अवांछित मोतियाबिंद गठन या यहां तक ​​कि यक्ष्मा bulbi पैदा कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, प्रारंभिक पंचर कॉर्निया पर भी पूर्वकाल पंचर आईरिस क़ैद बनाता है, या बहुत पीछे पंचर परिधीय रेटिना में प्रत्यक्ष छेद बना देता है, क्योंकि जगह से थोड़ा किनारी के पीछे होना चाहिए। दूसरे, यह प्रारंभिक पंचर कर रही है जबकि सुई के साथ लेंस की मार से बचने के लिए सावधान रहना करने की सिफारिश की है। यह लेंस पंचर से बचने के लिए सुई की पूरी बेवल सम्मिलित करने के लिए बेहतर नहीं है। तीसरा, खसुई की स्था दृष्टिकोण कोण आईरिस विमान के खिलाफ 45 डिग्री के बारे में है, और कुंद सुई peripapillary क्षेत्र की ओर पीछे धकेल दिया जाना चाहिए। अंत में, सुई अन्यथा विस्थापित सुई intravitreal इंजेक्शन का कारण बनता है, वर्दी छाला संरचनाओं में जिसके परिणामस्वरूप, इंजेक्शन के दौरान subretinal अंतरिक्ष में रखा जाना चाहिए।

आंख यह जीन थेरेपी 11 के लिए एक आकर्षक लक्ष्य है कि बनाने के अद्वितीय विशेषताओं के साथ एक छोटा सा अंग है। विशेष रूप से, यह अपेक्षाकृत कम विषाक्तता और आंख में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिकूल प्रणालीगत प्रभाव के साथ जीन थेरेपी के लिए सक्षम बनाता है कि प्रतिरक्षा विशेषाधिकार के साथ एक छोटे-से संलग्न कम्पार्टमेंट है। आसान दृश्य और शल्य चिकित्सा के दृष्टिकोण के लिए तैयार एक्सेसिबिलिटी जीन थेरेपी के लिए आंख के अन्य लाभ कर रहे हैं। रेटिना 10 अलग परतों के साथ एक उच्च स्तरीय आयोजन लामिना संरचना है। इस प्रकार, सटीक स्थानिक जीन डिलीवरी केवल अंतःचाक्षुष इंजेक्शन का उचित तरीके से प्राप्त किया जा सकता है। intr के लिए दो सबसे आम तरीकोंवायरल वाहक के aocular वितरण intravitreal इंजेक्शन और subretinal इंजेक्शन 6 हैं। सामान्य में, intravitreal इंजेक्शन रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और मुलर कोशिकाओं को लक्षित भीतरी रेटिना के लिए पसंदीदा मार्ग है। Subretinal इंजेक्शन फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और RPE कोशिकाओं को लक्षित बाहरी रेटिना के लिए पसंदीदा मार्ग है। RPE में एक कुशल पारगमन के लिए, यह subretinally रेटिना को नुकसान के लिए क्षमता के बावजूद वायरल वैक्टर वितरित करने के लिए आवश्यक है।

इस अध्ययन में, हम दृश्य के लिए GFP और आरएफपी के साथ एल.वी. वैक्टर का इस्तेमाल किया। वायरल वैक्टर रेटिना के विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के लिए tropism है क्योंकि, वायरल वैक्टर 5 कोशिकाओं को लक्षित करने के एएवी, एल.वी., के tropism और विज्ञापन के अनुसार चुना जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, AAV2 / 2, AAV2 / 6 और AAV2 / 8 RGC और मुलर कोशिकाओं को उच्चतम पारगमन दक्षता कर रहे हैं। AAV2 / 5, 2/7, 2/8 और 2/9 कुशलता AAV2 / 8 चूहों 5,12 में सबसे कुशल सीरोटाइप होने के साथ फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और RPE transduce 5 transduce। एल.वी. वैक्टर के लिए, intravitreal इंजेक्शन 13 के बाद subretinal इंजेक्शन के बाद RPE कोशिकाओं में अभिव्यक्ति है, लेकिन बहुत कम या कोई अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर है।

RPE के लिए प्रभावी जीन डिलीवरी के लिए, वायरल प्रमोटरों भी विचार किया जाना चाहिए। ऐसे cytomegalovirus (सीएमवी) के प्रमोटर और काइमेरिक चिकन बीटा actin / सीएमवी बढ़ाने के प्रमोटर के रूप में वायरल प्रमोटरों, इस प्रकार, वे जीन थेरेपी के अध्ययन के बहुमत में उपयोग किया जाता है, मजबूत और सर्वव्यापी प्रमोटर हैं। RPE में, सीएमवी प्रमोटर आर पी ई 65 प्रमोटर 14 की तुलना में ज्यादा प्रोटीन दस गुना व्यक्त करने के लिए अनुमान है। महत्व के प्रमोटर और सीरोटाइप सहित वायरल वैक्टर का इष्टतम संयोजन मानव आर पी ई 65 प्रमोटर सीरोटाइप rAAV2 / 4 rAAV2 की तुलना में 2/15 में पैक कर रहे हैं जब आर पी ई 65 की बेहतर अभिव्यक्ति के द्वारा प्रदर्शन के रूप में बेहतर परिणाम के लिए हासिल किया जाना चाहिए। RPE कोशिकाओं को जीन वितरण पर केंद्रित है, RPE-सपाऐसे आर पी ई 65 या VMD2 प्रवर्तक के रूप में ecific प्रमोटरों बंद लक्ष्य सुरक्षा 16 मुद्दों पर कम कर देता है।

AMD के रूप में सूखी AMD करने के लिए संदर्भित एक अपक्षयी चरण और के रूप में गीला AMD करने के लिए संदर्भित choroidal neovascularization की विशेषता चरण के साथ दो चरणों है कि एक जटिल बीमारी है। इसके अलावा, एएमडी पूरक कारक एच (CFH) सहित कई आनुवंशिक भावनाएँ, मैं (CFI), आयु से संबंधित maculopathy संवेदनशीलता 2 (ARMS2) और ApoE 17 कारकों पर्यावरण जोखिम के साथ संयुक्त कर रहे हैं कारक, सी 3 के पूरक के पूरक हैं, जिसमें एक बीमारी है। कारण AMD में आनुवंशिक जोखिम वाले कारकों के जटिल प्रकृति को अपने जीन थेरेपी के लिए कोई एक उम्मीदवार जीन है। इस प्रकार, AMD में मौजूदा जीन थेरेपी गीला AMD के 18 में choroidal neovascularization को लक्षित विरोधी वाहिकाजनक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जीन स्थानांतरण पर केंद्रित है। एक जीन थेरेपी के साथ सूखी AMD के इलाज के लिए अभी तक कोई उम्मीदवार जीन है। हाल ही में, हम इंट्रासेल्युलर amyloid बीटा संचय कर सकता है कि सुझाव दियाट्रांसजेनिक चूहों 19 में एएमडी सुविधाओं से सूखे से संबंधित हो। इसके अलावा, subretinally इंजेक्ट amyloid बीटा चूहों में RPE के द्वारा लिया गया था (डेटा प्रकाशित नहीं)। हम वायरल प्रोटीज 20 के साथ इंट्रासेल्युलर amyloid बीटा फोड़ना कर सकते हैं। इस प्रकार, हम आगे की संभावित निशानों के साथ सूखी AMD में जीन थेरेपी का अध्ययन किया है।

अंत में, नेत्र रोग में जीन थेरेपी किसी अन्य अंग में अधिक से अधिक का वादा किया है। इसके अलावा, subretinal इंजेक्शन विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और RPE के संबंध में, रेटिना रोगों में जीन थेरेपी के लिए एक बुनियादी तकनीक है। इस प्रकार, हम इस तकनीक को और अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है और monogenic रेटिनोपैथी, लेकिन यह भी उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन में विरासत न केवल में जीन थेरेपी की उन्नति में योगदान कर सकते हैं उम्मीद है।

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Acknowledgments

इस अध्ययन सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट (800-20140542) द्वारा समर्थित किया गया था, एनआरएफ / MEST पायनियर रिसर्च प्रोग्राम (2012-0009544), और एनआरएफ / MEST की जैव सिग्नल विश्लेषण प्रौद्योगिकी अभिनव कार्यक्रम (2009-0090895), और एनआरएफ / MEST का अनुदान (2015M3A9E6028949)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS WPI 500233
VANNAS Scissors S/S, 105 mm WPI 555583S
33 G Blunt needle WPI NF33BL-2
NanoFil Syringe, 10 microliter  WPI NANOFIL
RPE-KIT WPI RPE-KIT For easy one hand injection
30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle BD 305107 Initial puncture for subretinal injection
Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) Warner Instruments 64-0720  (CS-3R)
Leica operating microscope Leica LM M80
Fluoresecein microscope Nikon Eclipse 80i
Lentivirus Thermo scientific TMO.LV-Ctr Used to dilute vectors
PBS Gibco 10010-015 Used to dilute vectors
Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) Hanmi For dilation
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) Bausch&Lomb For topical anesthesia
Healon GV OVD Abbott Medical Optics Inc.
Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) Virbac For general anesthesia
Rompun injection (Xylazine HCl) Bayer For general anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 102 subretinal इंजेक्शन रेटिना वर्णक उपकला जीन थेरेपी वायरस नेत्र नेत्र चूहे
चूहे रेटिना वर्णक उपकला में जीन थेरेपी के लिए वायरल वाहक के Limbal दृष्टिकोण subretinal इंजेक्शन
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Park, S. W., Kim, J. H., Park, W.… More

Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030, doi:10.3791/53030 (2015).

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