Article de méthode

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

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DOI :

10.3791/53217

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13 novembre 2015

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1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une modification d’une méthode précédemment rapportée qui permet d’isoler des mitochondries purifiées de haute qualité à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris. Cette procédure aboutit à des mitochondries fortement couplées qui respirent avec une fonction élevée lors des tests respiratoires sur microplaques.

Résumé

Le dysfonctionnement des mitochondries des muscles squelettiques jouent un rôle dans le métabolisme est modifié observée avec le vieillissement, l'obésité et le diabète de type II. Des dosages de préparations mitochondriales respirométriques mitochondries isolées permettent l'évaluation de la fonction mitochondriale, ainsi que la détermination du mécanisme (s) d'action des médicaments et des protéines qui modulent le métabolisme. Procédures d'isolement actuelles exigent souvent de grandes quantités de tissu pour donner mitochondries de haute qualité nécessaires pour les essais respirométriques. Les méthodes présentées ici décrivent comment haute qualité mitochondries purifiées (~ 450 ug) peut être isolé à partir de quantités minimes (~ 75-100 mg) de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans des mesures respiratoires à haut débit. Nous avons déterminé que notre méthode d'isolement donne 92,5 ± 2,0% mitochondries intactes en mesurant l'activité de la citrate synthase spectrophotométrie. En outre, l'analyse Western blot dans les mitochondries isolées abouti à l'expression faibles de l'cytosoprotéines lic, GAPDH, et l'expression robuste de la protéine mitochondriale, COXIV. L'absence d'une bande de GAPDH de premier plan dans les mitochondries isolées est indicatif de la contamination à partir de sources peu de non-mitochondriales au cours de la procédure d'isolement. Plus important encore, la mesure de O 2 le taux de consommation sur la base d'une technologie de micro-plaque et la détermination du rapport de contrôle respiratoire (RCR) pour des essais couplés respirométriques montre très couplés (RCR;> 6 pour tous les essais) et les mitochondries fonctionnelles. En conclusion, l'addition d'une étape de hachage séparé et réduisant de manière significative entraîné par un moteur vitesse d'homogénéisation d'un procédé précédemment rapporté a permis l'isolement de haute qualité et des mitochondries purifiées à partir de petites quantités de muscle squelettique de souris qui en résulte dans les mitochondries fortement couplés qui respirent avec une haute fonction lors de microplaques base des essais de respirometirc.

Introduction

La fonction principale des mitochondries est de produire de l’ATP à partir de la phosphorylation oxydative. Cependant, les mitochondries ont de nombreuses autres fonctions cellulaires importantes, y compris, mais sans s’y limiter : la production et la détoxification des espèces réactives de l’oxygène, la régulation du calcium cytoplasmique et mitochondrial, le trafic d’organites, l’homéostasie ionique et l’implication dans l’apoptose1,2. Par conséquent, il n’est pas surprenant que les mitochondries dysfonctionnelles jouent un rôle dans de nombreuses pathologies pathologiques, telles que le vieillissement, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, le cancer, l’obésité et le diabète3,4. Il est important de noter que les mitochondries des muscles squelettiques sont spécifiquement impliquées dans bon nombre de ces pathologies3-5.

Les dosages de respiration mitochondriale utilisant des mitochondries isolées permettent d’évaluer la chaîne de transport d’électrons et la fonction de phosphorylation oxydative, et de déterminer le(s) mécanisme(s) d’action des médicaments et des protéines qui modulent le métabolisme. Il existe des procédures d’isolement mitochondrial pour plusieurs types de tissus et de cellules pour une variété d’espèces6,7. Cependant, ces procédures nécessitent souvent de grandes quantités de tissus/cellules pour un rendement mitochondriale de haute qualité nécessaire aux tests respiratoires classiques.

Les tests respiratoires basés sur des microplaques permettent des mesures à haut débit en utilisant des quantités minimales de mitochondries isolées, souvent seulement quelques μg par puits8. Par conséquent, nous présentons une modification des méthodes précédemment publiées7 pour permettre d’isoler des mitochondries de haute qualité à partir de petites quantités de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans des tests de respirométrie basés sur des microplaques. De plus, des méthodes sont fournies pour établir la qualité de la préparation d’isolement mitochondrial et l’intégrité des membranes mitochondriales. Étant donné que les mitochondries des muscles squelettiques sont impliquées dans de nombreuses conditions pathologiques, la mesure de la consommation d’O2 dans les études mécanistes devient de plus en plus répandue dans la recherche biomédicale9,10.

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Protocole

Les études animales ont été effectuées en vertu d'un protocole approuvé par le Institutional Animal Care et utilisent Comité à Virginia Polytechnic Institute et State University.

1. Configuration (Durée: ~ 45 min)

  1. Décongeler les magasins de 0,25% de trypsine, Isolation tampon pour mitochondries (IBM) 1 et IBM2 dans un bain d'eau à 37 ° C.
  2. Rincer la verrerie et instruments de dissection éthanol à 70% puis à l'eau de haute pureté.
  3. Préparer la solution de trypsine à 0,05% de 0,25% de trypsine de stock en diluant 1 partie trypsine en 4 parties IBM1.
  4. Mélanger la protéase et inhibiteur de phosphatase cocktail avec un tampon de lyse cellulaire (1: 100 du rapport) dans un tube de 1,5 ml avec bouchon à vis.
  5. Aliquotes de 5 ml (5 ml / souris) de 0,05% de trypsine dans un tube en plastique de 15 ml.
  6. Réglez motorisé homogénéisateur de tissu à 80 RPM.

2. Isolement du muscle squelettique mitochondries (Durée: ~ 90 min)

  1. Euthanasier une souris par le CO 2 inhalation, suivie par dislocation cervicale.
  2. Retirer muscle rouge du quadriceps et le muscle jumeau, qui comprend le soléaire (~ 75-100 mg au total) comme décrit dans les étapes suivantes:
    1. Peler la peau vers la souris.
    2. Retirer le coussinet adipeux sur le point d'origine quadriceps. Couper le tendon du quadriceps qui est attaché à la rotule avec des ciseaux fins à bout.
      Remarque: le quadriceps est identifié par sa position anatomique sur la partie antérieure du fémur proximal.
    3. Lentement couper l'aponévrose entre l'os et les quadriceps, tout en évitant l'artère fémorale, pour libérer les quadriceps de l'os. Couper le tendon avec des ciseaux fins à bout au point d'origine sur le fémur pour libérer le muscle quadriceps et placer le muscle quadriceps en réfrigérés PBS.
    4. Retirer le tissu adipeux visible sur les quadriceps avec des ciseaux. Retourner les quadriceps plus de sorte que la partie du muscle qui a été recouvrant le fémur est confronté à up. Ouvrez le muscle quadriceps avec une pince dans un mouvement de Fanning. Retirez les deux parties visibles musculaires rouges de chaque lobe avec des ciseaux pointe fine et les placer dans un bécher contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés.
      Remarque: muscle quadriceps apparaissent comme deux lobes avec une bande de muscle rouge situé près du bord latéral de chaque lobe.
    5. Couper la peau recouvrant le tendon d'Achille avec de fines pointe des ciseaux et peler la peau vers la souris. Couper le tendon d'Achille exposé et peler le muscle vers le corps de la souris.
    6. Couper le tendon à la condyles latéral et médial du fémur avec des ciseaux pointe fine pour libérer les jumeaux et placer les jumeaux attachée à ses tendons en réfrigérés PBS.
    7. Retournez le jumeau plus et de décoller le muscle soléaire et le placer dans le bol contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés. Fan ouvrir le jumeau. Retirez les trois parties visuelles rouges musculaires (deux bandes rouges latérales et médiale superficielles) avec fine embout ciseauxs et de les transférer dans le bécher contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés.
  3. Retirer autre ~ 75 à 100 mg de muscle rouge à partir de l'autre branche de la souris (comme décrit à l'étape 2.2) et la placer dans un tube de 1,5 ml avec une protéase et un inhibiteur de la phosphatase cocktail et un tampon de lyse cellulaire (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de dodécylsulfate de sodium, 0,5% de désoxycholate de sodium, 1% de polyoxyéthylène (9) nonylphényléther, ramifiée. Immédiatement Flash geler ce deuxième échantillon dans de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure dans le Western blot (voir l'étape 6.1).
  4. Placez une surface en plastique pré-réfrigérés, à plat sur la glace dans un grand seau. Versez une goutte d'IBM1 sur la surface en plastique et utiliser des pinces pour placer la totalité du muscle rouge coupe (étape 2.2.4 et 2.2.7) dans IBM1 gouttelettes. Émincer le tissu musculaire pendant 2 minutes en utilisant 3 simples lames de rasoir bord en changeant tous les rasoirs 40 sec.
  5. Transférer le tissu haché à un nouveau bécher avec 5 ml de IBM1 frais en maintenant la surface de plastique sur ee bêcher et racler le muscle dans le bécher avec une lame de rasoir. Prenez cette solution et les égoutter dans une passoire cellulaire 100 um placé sur un tube conique de 50 ml.
  6. Tamponnez le tissu avec une tâche délicate glace, puis le transférer dans 5 ml de la solution de trypsine à 0,05%. Utilisez une pince à épiler pour enlever le tissu de la tâche essuie-glace.
  7. Incuber le tissu musculaire sur de la glace pendant 30 min dans une solution de trypsine à 0,05%.
  8. Faites tourner les 15 ml tube conique mélange contenant de la trypsine / musculaire à 200 g pendant 3 min à 4 ° C.
  9. Verser le surnageant de la trypsine dans un conteneur de déchets et resuspendre le culot avec 3 ml de glace IBM1 froid. Transférer le tissu dans un tube de verre de 45 homogénéisateur ml. Rincer les 15 ml tube conique avec un autre 1,5 ml IBM1 de rassembler tout échantillon restant et ajouter ce au tube d'homogénéisation de verre.
  10. Placer le tube de homogénéiseur en verre dans un bécher ou récipient en plastique à mi-chemin rempli de glace afin d'homogénéisation de verre se déplace peu dans le bécher.
  11. Homogénéiser le mélange tissu / IMB1 avec le pilon en PTFE attachés à une homogénéisation de tissu motorisé avec 10 passes à 80 tours par minute. Maintenir le fond de chaque passage de ~ 2 sec.
  12. Transférer le homogénat de tissu dans un nouveau tube de 15 ml conique et le tube de rinçage homogénéisateur en verre avec 6,5 ml de IBM1. Verser le IBM1 dans le tube conique contenant 15 ml de l'homogénat tissulaire.
  13. Faites tourner la 15 ml tube conique à 700 g pendant 10 min à 4 ° C. Verser doucement le surnageant dans un haute résistance tube de centrifugeuse en verre et jeter le culot.
  14. Spin le surnageant de l'étape précédente à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C.
  15. Eliminer le surnageant IBM1 et remettre en suspension le culot par addition lente de 500 ul de IBM2. Coupez l'extrémité d'une pointe de pipette et homogénéiser doucement le culot dans IBM2 avec mélangeant et en agitant des motions. Ajouter encore 4,5 ml de IBM2 au mélange après que le culot est entièrement suspendu.
    Remarque: Evitez de trituration excessive tout en brisant les gros morceaux de boulettes que tson peut endommager les membranes mitochondriales.
  16. Spin le broyat / tissu IBM2 à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque: Cette étape peut être répétée dans un tube de centrifugeuse à haute résistance propre pour la quantification plus précise de la protéine de mitochondries isolées à l'étape 4 depuis BSA résiduelle peut contribuer à teneur totale en protéines.
  17. Retirer le surnageant et doucement, mais complètement re-suspendre le culot en ajoutant deux paliers de 25 pi de IBM2 avec une pointe de pipette avec son point coupé. Incorporer délicatement le culot et mélanger après chaque addition de 25 pl de IBM2. Placez ce stock mitochondrial sur la glace.

3. Homogénéisation de tout le tissu Lysate (Durée: ~ 45 min; Peut être effectué pendant l'étape 7)

  1. Enlever le muscle de celle a été placé dans de l'azote liquide provenant de l'étape 2.3 et incuber à température ambiante jusqu'à ce que complètement décongelé.
  2. Émincer le tissu pour ~ 30 secondes sur la glace avec des ciseaux fins à bout.
  3. Ajouter deux cuillères 100 pi de Zirconium oxyde Perles au tube de 1,5 ml avec bouchon à vis de l'étape 3.2 qui contient le tissu haché. Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de tissu à l'aide broyeur à billes de deux à trois cycles de 5 min à une vitesse de 4-6 (réglage moyen).
  4. Spin mélange de l'étape 3.3 à 12000 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette de 1000 pi après le spin et le transfert dans un tube de 1,5 ml. Jeter le culot et placer le surnageant sur de la glace.

4. Détermination des protéines (Durée: ~ 30 min)

  1. Déterminer la concentration en protéine de l'ensemble du lysat de tissu (étape 3.4) et clips mitochondrial (étape 2.17) en utilisant le kit de dosage de protéine BCA de selon les spécifications du fabricant.

5. Les mitochondries Membrane intégrité; Citrate synthase (CS) Activité (Durée: ~ 15 min)

  1. Faire deux séparées 1: 20 dilutions du stock mitochondrial dans l'eau de haute pureté. Ajouter0,1% de Triton X-100 à un échantillon et soniquer il à un niveau faible (765 Watts, amplitude de 2). Laissez l'autre dilution sur la glace. Remettre l'échantillon à la glace après sonication.
  2. Effectuez un test de la citrate synthase à la fois la non-traité par ultrasons et soniqué dilutions mitochondriales en utilisant un dosage spectrophotométrique comme décrit précédemment 11,12.
  3. Déterminer le pourcentage de membranes intactes mitochondries en utilisant les équations suivantes:
    (CS activité non-traitées aux ultrasons ÷ soniqué activité CS) * 100


100- N (pour cent atteint à partir de ci-dessus)

6. Les mitochondries qualité d'isolation; Western Blot (Durée: Conformément au protocole Lab)

  1. Effectuer Western blot sur ​​l'ensemble du lysat de tissu et de mitochondries isolées comme décrit précédemment 12.
    Remarque: Utilisez anticorps primaires pour GAPDH (1: 1000 dilution dans 5% de BSA / TBS-T) et COXIV (1: 1000 dilution dans 5% non graslait / TBS-T), suivie par anti-chèvre, et des anticorps secondaires de lapin, respectivement (1: 10,000).

7. respirométrique série de test (Durée: ~ 90 min)

  1. Effectuer des dosages respirométriques souhaités en utilisant la technologie de mesure de microplaques basé O 2 de consommation comme décrit précédemment (voir l'article de compagnon et Rogers et al 8).
  2. Déterminer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant par 3 État État 4o (RCR) ou en divisant 3U d'État par État 4o. Utilisez soit le milieu (moyenne) le point, ou le plus haut (Etat 3) et les plus faibles (de taux 4o de l'Etat) à partir des traces de point à point au moment de déterminer RCR.

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Résultats

Activité de la citrate synthase sert de mesure pour l'intégrité de la membrane depuis la citrate synthase est situé dans la membrane mitochondriale interne, et par conséquent ne devrait pas être présent dans les suspensions de mitochondries avec des membranes intactes. La figure 1 représente l'activité de la citrate synthase dans des échantillons non soumis à une sonication mitochondriales par rapport à soniqué des échantillons provenant de la même isolation. Soniquant les résul...

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Discussion

Les méthodes présentées ici fournissent une description détaillée de la procédure d'isolement des mitochondries à partir de quantités minimes (~ 75 à 100 mg) de muscle squelettique de souris. Cette procédure d'isolement est capable de produire de haute fonctionnement, les mitochondries pur (~ 450 ug) comme en témoigne O 2 taux de consommation, les valeurs RCR, l'activité de la citrate synthase maximale et l'expression de protéines à partir immunoblotting. Fait important, les mitochondries isol...

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Déclarations de divulgation

George Rogers est un employé de Seahorse Bioscience qui produit l’instrument pour lequel ce protocole a été modifié.

Remerciements

L’Institut de recherche en sciences de la vie Fralin et le Metabolic Phenotyping Core de Virginia Tech ont soutenu ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Essentiellement grasSigma AldrichA6003N/A
Sans acide - BSA
Tris/HClPromegaH5123N/D
KCLSigma AldrichP9541N/A
Tris BasePromegaH5135N/A
EDTASigma AldrichE6511N/A
EGTASigma AldrichE4378N/A
SaccharoseSigma AldrichS7903N/A
D-MannitolSigma Aldrich63559N/A
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolThermo Scientific25200-056N/A
Chlorure de sodium
cristaux blancs ou poudre cristalline
&ge ; 99.0 %		Fisher ScientificBP3581N/A
Dodécylsulfate de sodiumSigma AldrichL3771  ;n/a
Désoxycholate de sodiumSigma AldrichD6750  ;n/a
Polyoxyéthylène (12) nonylphényléther ramifiéSigma Aldrich238651N/A
Lames de rasoir à un seul tranchantFisher Scientific12-640N/A
Falcon- 100 uM Crépines à cellules en nylonFisher Scientific352360N/A
Halt Protéase & Cocktail inhibiteur de phosphatse ThermoScientific1861284N/A
Tubes microcentrifuges de 1,5 ml avec bouchon à visThermo Scientific3474N/A
Billes d’oxyde de zirconiumFisher ScientificC9012112S.O
. Anticorps GAPDH (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A
Anticorps anti-COXIVSignalisation cellulaire4844sN’importe quelle protéine de la membrane interne mitochondriale suffira
Peroxydase conjuguée affinipure Âne, Anti Lapin IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh711-035-152N/A
Peroxydase conjuguée affinipure Chèvre, Anti Souris IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce BCA Kit de dosage des protéines  ;Thermo Scientific23225N/A
Acide pyruvique, 98 %Sigma Aldrich107360Magasin à 4 ° ; C, pH à 7,4 avec KOH avant utilisation dans un test respiratoire
Acide succiniqueSigma AldrichS9512Conserver à température ambiante, pH à 7,4 avec KOH avant d’être utilisé dans un test respiratoire
L(-) Acide malique, BioXtra, &ge ; 95 %Sigma AldrichM6413Conserver à température ambiante, à 7,4 avec KOH avant utilisation dans un test respiratoire
Acide L-glutamiqueSigma AldrichG1251Conserver à température ambiante, à 7,4 avec KOH avant d’être utilisé dans un test respirométrique, à 7,4 avec KOH avant d’être utilisé dans un test respiratoire Palmitoyl
L-carnitine chlorideSigma AldrichP1645Conserver à -20 ° ;C
Oligomycine A, &ge ; 95 % (HPLC)Sigma Aldrich75351Stocker à -20 ° ; C
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)Sigma AldrichC2920Stocker à 2-8 ° ; C
phénylhydrazone
&ge ; 98 % (TLC), poudre [FCCP]
Antimycine A de streptomyces sp.Sigma AldrichA8674Magasin à -20 ° ; C
Adénosine 5&prime ;-diphosphate monopotassique déshydraté [ADP]Sigma AldrichA5285Conserver à -20 ° ; C, à 7,4 avec KOH avant utilisation dans le dosage
RotenoneSigma AldrichR8875Conserver à température ambiante
respiratoire

Références

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Mots-clés

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