Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

La fonction principale des mitochondries est de produire de l’ATP à partir de la phosphorylation oxydative. Cependant, les mitochondries ont de nombreuses autres fonctions cellulaires importantes, y compris, mais sans s’y limiter : la production et la détoxification des espèces réactives de l’oxygène, la régulation du calcium cytoplasmique et mitochondrial, le trafic d’organites, l’homéostasie ionique et l’implication dans l’apoptose^1,2. Par conséquent, il n’est pas surprenant que les mitochondries dysfonctionnelles jouent un rôle dans de nombreuses pathologies pathologiques, telles que le vieillissement, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, le cancer, l’obésité et le diabète^3,4. Il est important de noter que les mitochondries des muscles squelettiques sont spécifiquement impliquées dans bon nombre de ces pathologies^3-5.

Les dosages de respiration mitochondriale utilisant des mitochondries isolées permettent d’évaluer la chaîne de transport d’électrons et la fonction de phosphorylation oxydative, et de déterminer le(s) mécanisme(s) d’action des médicaments et des protéines qui modulent le métabolisme. Il existe des procédures d’isolement mitochondrial pour plusieurs types de tissus et de cellules pour une variété d’espèces^6,7. Cependant, ces procédures nécessitent souvent de grandes quantités de tissus/cellules pour un rendement mitochondriale de haute qualité nécessaire aux tests respiratoires classiques.

Les tests respiratoires basés sur des microplaques permettent des mesures à haut débit en utilisant des quantités minimales de mitochondries isolées, souvent seulement quelques μg par puits⁸. Par conséquent, nous présentons une modification des méthodes précédemment publiées⁷ pour permettre d’isoler des mitochondries de haute qualité à partir de petites quantités de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans des tests de respirométrie basés sur des microplaques. De plus, des méthodes sont fournies pour établir la qualité de la préparation d’isolement mitochondrial et l’intégrité des membranes mitochondriales. Étant donné que les mitochondries des muscles squelettiques sont impliquées dans de nombreuses conditions pathologiques, la mesure de la consommation d’O₂ dans les études mécanistes devient de plus en plus répandue dans la recherche biomédicale^9,10.

Les études animales ont été effectuées en vertu d'un protocole approuvé par le Institutional Animal Care et utilisent Comité à Virginia Polytechnic Institute et State University.

1. Configuration (Durée: ~ 45 min)

1. Décongeler les magasins de 0,25% de trypsine, Isolation tampon pour mitochondries (IBM) 1 et IBM2 dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Rincer la verrerie et instruments de dissection éthanol à 70% puis à l'eau de haute pureté.
3. Préparer la solution de trypsine à 0,05% de 0,25% de trypsine de stock en diluant 1 partie trypsine en 4 parties IBM1.
4. Mélanger la protéase et inhibiteur de phosphatase cocktail avec un tampon de lyse cellulaire (1: 100 du rapport) dans un tube de 1,5 ml avec bouchon à vis.
5. Aliquotes de 5 ml (5 ml / souris) de 0,05% de trypsine dans un tube en plastique de 15 ml.
6. Réglez motorisé homogénéisateur de tissu à 80 RPM.

2. Isolement du muscle squelettique mitochondries (Durée: ~ 90 min)

1. Euthanasier une souris _par le CO 2
2. Retirer muscle rouge du quadriceps et le muscle jumeau, qui comprend le soléaire (~ 75-100 mg au total) comme décrit dans les étapes suivantes:
   1. Peler la peau vers la souris.
   2. Retirer le coussinet adipeux sur le point d'origine quadriceps. Couper le tendon du quadriceps qui est attaché à la rotule avec des ciseaux fins à bout.
      Remarque: le quadriceps est identifié par sa position anatomique sur la partie antérieure du fémur proximal.
   3. Lentement couper l'aponévrose entre l'os et les quadriceps, tout en évitant l'artère fémorale, pour libérer les quadriceps de l'os. Couper le tendon avec des ciseaux fins à bout au point d'origine sur le fémur pour libérer le muscle quadriceps et placer le muscle quadriceps en réfrigérés PBS.
   4. Retirer le tissu adipeux visible sur les quadriceps avec des ciseaux. Retourner les quadriceps plus de sorte que la partie du muscle qui a été recouvrant le fémur est confronté à up. Ouvrez le muscle quadriceps avec une pince dans un mouvement de Fanning. Retirez les deux parties visibles musculaires rouges de chaque lobe avec des ciseaux pointe fine et les placer dans un bécher contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés.
      Remarque: muscle quadriceps apparaissent comme deux lobes avec une bande de muscle rouge situé près du bord latéral de chaque lobe.
   5. Couper la peau recouvrant le tendon d'Achille avec de fines pointe des ciseaux et peler la peau vers la souris. Couper le tendon d'Achille exposé et peler le muscle vers le corps de la souris.
   6. Couper le tendon à la condyles latéral et médial du fémur avec des ciseaux pointe fine pour libérer les jumeaux et placer les jumeaux attachée à ses tendons en réfrigérés PBS.
   7. Retournez le jumeau plus et de décoller le muscle soléaire et le placer dans le bol contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés. Fan ouvrir le jumeau. Retirez les trois parties visuelles rouges musculaires (deux bandes rouges latérales et médiale superficielles) avec fine embout ciseauxs et de les transférer dans le bécher contenant 5 ml de IBM1 réfrigérés.
3. Retirer autre ~ 75 à 100 mg de muscle rouge à partir de l'autre branche de la souris (comme décrit à l'étape 2.2) et la placer dans un tube de 1,5 ml avec une protéase et un inhibiteur de la phosphatase cocktail et un tampon de lyse cellulaire (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de dodécylsulfate de sodium, 0,5% de désoxycholate de sodium, 1% de polyoxyéthylène (9) nonylphényléther, ramifiée. Immédiatement Flash geler ce deuxième échantillon dans de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure dans le Western blot (voir l'étape 6.1).
4. Placez une surface en plastique pré-réfrigérés, à plat sur la glace dans un grand seau. Versez une goutte d'IBM1 sur la surface en plastique et utiliser des pinces pour placer la totalité du muscle rouge coupe (étape 2.2.4 et 2.2.7) dans IBM1 gouttelettes. Émincer le tissu musculaire pendant 2 minutes en utilisant 3 simples lames de rasoir bord en changeant tous les rasoirs 40 sec.
5. Transférer le tissu haché à un nouveau bécher avec 5 ml de IBM1 frais en maintenant la surface de plastique sur ee bêcher et racler le muscle dans le bécher avec une lame de rasoir. Prenez cette solution et les égoutter dans une passoire cellulaire 100 um placé sur un tube conique de 50 ml.
6. Tamponnez le tissu avec une tâche délicate glace, puis le transférer dans 5 ml de la solution de trypsine à 0,05%. Utilisez une pince à épiler pour enlever le tissu de la tâche essuie-glace.
7. Incuber le tissu musculaire sur de la glace pendant 30 min dans une solution de trypsine à 0,05%.
8. Faites tourner les 15 ml tube conique mélange contenant de la trypsine / musculaire à 200 g pendant 3 min à 4 ° C.
9. Verser le surnageant de la trypsine dans un conteneur de déchets et resuspendre le culot avec 3 ml de glace IBM1 froid. Transférer le tissu dans un tube de verre de 45 homogénéisateur ml. Rincer les 15 ml tube conique avec un autre 1,5 ml IBM1 de rassembler tout échantillon restant et ajouter ce au tube d'homogénéisation de verre.
10. Placer le tube de homogénéiseur en verre dans un bécher ou récipient en plastique à mi-chemin rempli de glace afin d'homogénéisation de verre se déplace peu dans le bécher.
11. Transférer le homogénat de tissu dans un nouveau tube de 15 ml conique et le tube de rinçage homogénéisateur en verre avec 6,5 ml de IBM1. Verser le IBM1 dans le tube conique contenant 15 ml de l'homogénat tissulaire.
12. Faites tourner la 15 ml tube conique à 700 g pendant 10 min à 4 ° C. Verser doucement le surnageant dans un haute résistance tube de centrifugeuse en verre et jeter le culot.
13. Spin le surnageant de l'étape précédente à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C.
14. Eliminer le surnageant IBM1 et remettre en suspension le culot par addition lente de 500 ul de IBM2. Coupez l'extrémité d'une pointe de pipette et homogénéiser doucement le culot dans IBM2 avec mélangeant et en agitant des motions. Ajouter encore 4,5 ml de IBM2 au mélange après que le culot est entièrement suspendu.
    Remarque: Evitez de trituration excessive tout en brisant les gros morceaux de boulettes que tson peut endommager les membranes mitochondriales.
15. Spin le broyat / tissu IBM2 à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque: Cette étape peut être répétée dans un tube de centrifugeuse à haute résistance propre pour la quantification plus précise de la protéine de mitochondries isolées à l'étape 4 depuis BSA résiduelle peut contribuer à teneur totale en protéines.
16. Retirer le surnageant et doucement, mais complètement re-suspendre le culot en ajoutant deux paliers de 25 pi de IBM2 avec une pointe de pipette avec son point coupé. Incorporer délicatement le culot et mélanger après chaque addition de 25 pl de IBM2. Placez ce stock mitochondrial sur la glace.

3. Homogénéisation de tout le tissu Lysate (Durée: ~ 45 min; Peut être effectué pendant l'étape 7)

1. Enlever le muscle de celle a été placé dans de l'azote liquide provenant de l'étape 2.3 et incuber à température ambiante jusqu'à ce que complètement décongelé.
2. Émincer le tissu pour ~ 30 secondes sur la glace avec des ciseaux fins à bout.
3. Ajouter deux cuillères 100 pi de Zirconium oxyde Perles au tube de 1,5 ml avec bouchon à vis de l'étape 3.2 qui contient le tissu haché. Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de tissu à l'aide broyeur à billes de deux à trois cycles de 5 min à une vitesse de 4-6 (réglage moyen).
4. Spin mélange de l'étape 3.3 à 12000 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette de 1000 pi après le spin et le transfert dans un tube de 1,5 ml. Jeter le culot et placer le surnageant sur de la glace.

4. Détermination des protéines (Durée: ~ 30 min)

1. Déterminer la concentration en protéine de l'ensemble du lysat de tissu (étape 3.4) et clips mitochondrial (étape 2.17) en utilisant le kit de dosage de protéine BCA de selon les spécifications du fabricant.

5. Les mitochondries Membrane intégrité; Citrate synthase (CS) Activité (Durée: ~ 15 min)

1. Faire deux séparées 1: 20 dilutions du stock mitochondrial dans l'eau de haute pureté. Ajouter0,1% de Triton X-100 à un échantillon et soniquer il à un niveau faible (765 Watts, amplitude de 2). Laissez l'autre dilution sur la glace. Remettre l'échantillon à la glace après sonication.
2. Effectuez un test de la citrate synthase à la fois la non-traité par ultrasons et soniqué dilutions mitochondriales en utilisant un dosage spectrophotométrique comme décrit précédemment ^11,12.
3. Déterminer le pourcentage de membranes intactes mitochondries en utilisant les équations suivantes:
   (CS activité non-traitées aux ultrasons ÷ soniqué activité CS) * 100

100- N (pour cent atteint à partir de ci-dessus)

6. Les mitochondries qualité d'isolation; Western Blot (Durée: Conformément au protocole Lab)

1. Effectuer Western blot sur ​​l'ensemble du lysat de tissu et de mitochondries isolées comme décrit précédemment ^12.
   Remarque: Utilisez anticorps primaires pour GAPDH (1: 1000 dilution dans 5% de BSA / TBS-T) et COXIV (1: 1000 dilution dans 5% non graslait / TBS-T), suivie par anti-chèvre, et des anticorps secondaires de lapin, respectivement (1: 10,000).

7. respirométrique série de test (Durée: ~ 90 min)

1. Effectuer des dosages respirométriques souhaités en utilisant la technologie de mesure de microplaques basé O ₂ de consommation comme décrit précédemment (voir l'article de compagnon et Rogers et al ^8).
2. Déterminer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant par 3 État État 4o (RCR) ou en divisant 3U d'État par État 4o. Utilisez soit le milieu (moyenne) le point, ou le plus haut (Etat 3) et les plus faibles (de taux 4o de l'Etat) à partir des traces de point à point au moment de déterminer RCR.

Activité de la citrate synthase sert de mesure pour l'intégrité de la membrane depuis la citrate synthase est situé dans la membrane mitochondriale interne, et par conséquent ne devrait pas être présent dans les suspensions de mitochondries avec des membranes intactes. La figure 1 représente l'activité de la citrate synthase dans des échantillons non soumis à une sonication mitochondriales par rapport à soniqué des échantillons provenant de la même isolation. Soniquant les résultats de mitochondries dans une augmentation statistiquement significative de l'activité de la citrate synthase (p <0,01). Surtout, 92,5 ± 2,0% des mitochondries étaient intacts suite à l'isolement.

La figure 2 représente l'expression de GAPDH et COXIV dans les mitochondries isolées et l'ensemble du lysat de tissu musculaire squelettique. GAPDH est une protéine située dans le cytosol, mais peut également être trouvée dans le noyau après la translocation, tandis que COXIV est une protéine située dans la membrane mitochondriale interne. L'expression de GAPDH et COXIV sont évidentes dans l'ensemble tissue lysat. Dans le mitochondries isolées, l'expression de COXIV est observée, alors que seuls les faibles bandes de GAPDH sont évidents. Ces résultats indiquent de bonnes isolations mitochondriales, avec peu de contamination par des composants non-mitochondriales au cours de la procédure d'isolement.

La figure 3 est un tracé représentatif des taux d'O 2 de consommation (OCR) en fonction du temps pour une analyse de couplage (10 mM pyruvate / mM malate 5) réalisées à partir de mitochondries isolées en utilisant ce protocole et réalisées avec la technologie de microplaques basé O 2 de la consommation. Chaque panneau représente O 2 la consommation dans les différents Etats mitochondriales telles que décrites par Chance et Williams 13. Le premier panneau représente basale consommation d'O 2, ou de l'État 2. Le deuxième panel, après l'injection de l'ADP, représente maximale couplée respiration, ou de l'État 3. Le troisième panel, après l'injection de oligomycine A (un inhibiteur du complexe V), represents respiration en raison de fuite de protons, ou de l'État 4o. Le quatrième panneau, après l'injection de FCCP, représente maximale respiration découplé ou 3U de l'Etat. Enfin, le cinquième panneau, après injection de antimycine A, représente l'inhibition de la respiration oxydative. Le ratio respiratoires de commande (RCR), une mesure de la fonction mitochondriale 1, a été calculée en divisant État 3 par État 4o. Le tableau 4 présente les valeurs moyennes RCR pour les autres essais de couplage de substrat qui peuvent être effectuées à partir du rendement de mitochondries de ce protocole. Surtout, la consommation d'O 2 traçage et les valeurs élevées RCR représentent hautement fonctionnement et les mitochondries couplés. RCR valeurs rapportées ici sont plus élevés ou similaire que précédemment rapporté en utilisant des protocoles d'isolement similaires dans le muscle squelettique de souris 7,14,15, accentuant ainsi la haute qualité des mitochondries isolées lors de cette procédure.

Figure 1: Citrate Synthase activité. L'activité de l'enzyme synthase de citrate comme déterminée par spectrophotométrie en préparations non traitées aux ultrasons et soniquées mitochondries. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM. ** p <0,01. Les données représentent n = 3 répétitions couplé biologiques et exprimé par rapport au mg de protéine.

Figure 2:. Cytosolique et l'expression de la protéine mitochondriale dans les mitochondries isolées et lysat de tissu entier deux mitochondries isolées et lysats de tissus entiers ont été immunotransférés avec COXIV et des anticorps de GAPDH. La protéine mitochondriale, COXIV, était évident dans les deux échantillons, cependant GAPDH était évident que faiblement dans les mitochondries isolées. L'absence d'une bande de GAPDH de premier plan dans the mitochondries isolées est indicatif de peu de contamination provenant de sources non-mitochondriales au cours de la procédure d'isolement.

Figure 3:. Traçage Représentant de l'essai de couplage avec mitochondries isolées du muscle squelettique de souris 10 mM pyruvate / 5 mM malate couplé mitochondriales tracés de test de respiration tel que déterminé par la mesure de consommation d'O 2 multi-puits. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SD. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 2,5 pg. OCR = O 2 Taux de consommation; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 - (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A.

Tableau 1: Préparation de solutions mères.

Tableau 2: Préparation de l'isolement tampon pour mitochondries 1 (IBM1).

Tableau 3: Préparation de l'isolement tampon pour mitochondries 2 (IBM2).

Tableau 4: Ratios de contrôle respiratoire de ratios de commande couplée mitochondrial respiration Essais respiratoires telles que déterminées par la première mesure O 2 taux de consommation avec des dosages respirométriques base de microplaques, puis en divisant maximale couplée respiration (ADP stimulée Etat 3) par la respiration en raison de fuite de protons (oligomycine. A 4o de l'Etat de réponse). Les valeurs sont exprimées comme moiSE ±. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 2,5 pg pour la pyruvate / malate et succinate / tests de roténone, et 3,5 ug de protéine mitochondriale par puits pour le palmitoyl L-carnitine / malate et du glutamate / malate dosages.

George Rogers est un employé de Seahorse Bioscience qui produit l’instrument pour lequel ce protocole a été modifié.