Utilisation Ex Vivo Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

La régénération des organes in vivo chez l'homme est très limitée; par conséquent, l'ingénierie tissulaire, le développement des tissus et organes à partir de cellules individuelles donnés par un hôte, devient une thérapie potentielle attractive pour le remplacement d'organes. Cependant, pour cette stratégie thérapeutique soit couronnée de succès, les facteurs et les interactions cellulaires impliqués dans la morphogenèse de l'organe doivent être soigneusement étudiés et bien compris. En raison de l'incapacité d'étudier le développement des organes spécifiques avec les approches traditionnelles, les chercheurs se sont tournés vers l'embryon toute solution de rechange ou de cultures d'organes entiers. Kalaskar et al. ¹ ont montré que la culture ex vivo de l'embryogenèse ensemble donne des résultats comparables (dans 58% des embryons cultivés) au développement in utero, suggérant que ex vivo des méthodes de culture sont une alternative possible pour les études de l'organogenèse.

Un système de culture d'organe individualisé, tel que cette ex vivo droplet système de culture, pour l'ensemble de l'analyse permet d'organe indépendant des effets systémiques, tout en permettant la manipulation d'une voie de signalisation spécifique par l'intermédiaire d'interactions cellulaires ou addition de réactifs pharmacologiques ou des anticorps. Traditionnellement, l'étude du développement des organes du fœtus a été limité à des technologies transgéniques et souris knock-out, en plus réactifs pharmacologiques livrés maternelle. Cependant, il ya des questions techniques concernant ces techniques et les traitements in vivo; la plupart des préoccupations tournent autour des effets d'influencer divers organes simultanément, ce qui se traduit souvent par une létalité embryonnaire. Une inquiétude supplémentaire d'études manipulant le développement du fœtus est pharmacologiquement l'effet maternel de médicaments sur le développement embryonnaire in utero (par exemple, le métabolisme de la mère de la drogue avant qu'elle atteigne l'embryon) et si ces réactifs peuvent passer à travers la barrière placentaire.

La technique de culture d'organe entier décriteici a été adapté à partir d'un premier protocole décrit par Maatouk et al. ^2, dans laquelle les gonades fœtales entières sont mises en incubation dans des cultures ex vivo de gouttelettes verticaux. Un avantage important de la culture de gonades fœtales est que les inhibiteurs de petites molécules peuvent facilement accéder à tout l'organe par simple diffusion. . DeFalco et al ont montré que l'utilisation de cette méthode ex vivo gouttelette de culture conjointement avec les inhibiteurs à petites molécules peut être utilisée pour étudier les processus et les interactions qui se produisent au cours du développement des gonades ³ signalisation; ces processus serait difficile d'examiner in vivo en raison de problèmes techniques (par exemple, le passage de la drogue à travers le placenta ou de létalité affectant plusieurs organes en utilisant des approches génétiques ou pharmacologiques).

La culture de la gouttelette est non seulement une amélioration de certains aspects plus expérimentation in utero, mais il est aussi une amélioration par rapport in vitro et ex visystèmes vo ainsi. L'utilisation de lignées de cellules pour étudier la morphogenèse est extrêmement difficile car ils ne possèdent pas les divers types de cellules, ne disposent pas des éléments essentiels matrice extracellulaire (ECM) qui permettent la formation de l'architecture d'organes, et peuvent présenter des artefacts dans les cascades de signalisation. Bien que l'ingénierie tissulaire a apporté des améliorations significatives dans la création d'échafaudages simulant ECM, le manque de connaissances à l'égard de laquelle les signaux sont tenus par chaque type de cellule pendant l'organogenèse, il est difficile de construire un système d'organes in vitro. Autres ex vivo systèmes ont déjà été mis en place pour étudier l'organogenèse, ou plus précisément la morphogenèse, et ont eu beaucoup de succès pour l'imagerie en direct des organes du fœtus dans l'agar ^4, Transwells ^{5, 6,} filtres et autres matrices d'échafaudage ^7,8. L'avantage du système de culture de gouttelettes est qu'il permet l'étude de la morphogenèse en offrant la possibilité d'utiliser moins de réactifs, qui sont des oouvent cher, mais donnant également la tension superficielle de l'organe, ce qui est important pour la capacité de croissance et de signalisation ^9.

Chez la souris, la morphogenèse des testicules initiale a lieu entre embryonnaire (E) met en scène E11.5 et E13.5; Ces étapes comprennent la fenêtre temporelle optimale pour les facteurs qui influencent la différenciation spécifique du sexe d'instruction. Parmi les processus critiques qui se produisent pendant la formation du testicule sont la génération de l'architecture de la moelle testicule et la formation d'un réseau vasculaire spécifique au testicule. En utilisant cette ex vivo système de culture de gouttelettes d'organes ensemble, on est en mesure de modifier la vascularisation spécifique au mâle et inhiber testicule morphogenèse grâce à l'utilisation d'un inhibiteur à petite molécule qui bloque l'activité des récepteurs de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF); Remodelage vasculaire VEGF est critique pour le développement des testicules ^10-12. Cette technique peut être appliquée avec succès à d'autres organes et peut cibler temps spécifiquefenêtres de développement. Imagerie d'organes totalité montage permet la visualisation des structures vitales ainsi que les changements structurels et cellulaires résultant de l'administration de divers inhibiteurs. Surtout, ce système est avantageux en ce que le chercheur peut contourner les effets de confusion potentiels de l'administration de drogues par la mère ou la perturbation systémique pendant vivo stratégies de gènes ciblés dans. Ainsi, toute cette ex vivo système de culture de gouttelettes organe peut améliorer de façon significative la capacité de comprendre les interactions et la signalisation qui se produisent spécifiquement dans des organes particuliers durant le développement fœtal.

Toutes les souris utilisées dans ces études étaient des souris CD-1 obtenues auprès de Charles River Laboratories. Précédentes expériences de culture ont également été réalisées sur d'autres souches, telles que des souris C57BL / 6J (données non présentées), mais toute souche peut être utilisée. Femmes adultes enceintes sont âgés d'environ 2-3 mois et ont été euthanasiés par inhalation de CO ₂ suivie d'une dislocation cervicale et la thoracotomie bilatérale avant le retrait de l'embryon. Les souris ont été logés conformément aux directives du NIH et protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle Hospital Medical Center de Cincinnati Children.

1. Préparation des instruments, Culture Media, et les plats

1. Préparer une solution d'éthanol à 70%. L'eau déminéralisée autoclave (pour faire des chambres humidifiés et pour la fabrication de solutions de dilution /). Stériliser les outils de dissection (forceps, ciseaux, et 27 g d'aiguilles des seringues) par pulvérisation vers le bas avec 70% d'éthanol.
2. Préparer10X tampon phosphate salin (PBS) contenant du calcium et du magnésium (80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na ₂ HPO _4, 2,4 g de KH _{2 PO} 4, 6,75 ml de 1 M _CaCl2, 3,75 ml de 1 M _de MgCl2 ). Remuez pour dissoudre dans 1 L d'eau à l'autoclave stérile et puis filtrer avec un papier filtre. Diluer 10 fois avec de l'eau pour faire du PBS 1X.
3. Inactiver la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) à 55 ° C pendant 30 min et stériliser par filtration avec un filtre à seringue de 0,22 um.
4. Préparer 38 ml 1X milieu de culture complet (appelé DMEM complet, cDMEM), constitué de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 10% filtré dilution de chaleur FBS inactivé et 1/100 de la pénicilline-streptomycine stock. Ceci devrait être habituellement utilisée fraîche, mais peut être conservé à 4 ° C pendant 1 mois.
5. Reconstituer le VEGFR Kinase Inhibitor II Tyrosine (TKI II) dans le DMSO pour une concentration stock de 5 mg / ml, et diluer avec de stock cDMEM pour obtenir une solution de travail. Le con finalecentration de cette étude est de 1,875 ug / ml dans cDMEM. Selon les recommandations de la société, les solutions mères sont stables jusqu'à 6 mois à -20 ° C. Quant aux solutions de travail, assurez-fraîche et utiliser le même jour.
   Remarque: La concentration de ce médicament dans la solution de travail doit être deux fois supérieure à la concentration finale désirée (car il sera dilué deux fois dans la goutte). Dans le même temps, préparer le même volume de cDMEM contenant le même volume de DMSO pour le traitement de "contrôle".
6. Préparer les réactifs queue de digestion (NaOH 50 mM et 1 M de Tris-HCl [pH 8,0]) séparément dans de l'eau distillée.
7. Faire un bilan de 25 uM des amorces PCR XY (XY Forward 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'et 5'-XY inverse GCC CTG CCA AAT TCT TTG G-3') ensemble dans l'eau sans nucléase.
8. Préparer tampon TAE 50X (242 g de base Trizma, 57,1 ml acide acétique glacial, 100 ml d'EDTA 0,5 M, pH 8,5, et ajouter de l'eau à 1 L file volume final). Préparez tampon Courir TAE 1X (20 ml 50X TAE dilué avec de l'eau à 1 L de volume total).
9. Pour créer une solution à 2,5% d'agarose (0,625 g d'agarose, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml d'eau), une solution d'agarose de chaleur au micro-ondes jusqu'à ébullition, puis laisser refroidir jusqu'à environ 55-65 ° C (mesure de toucher). Une fois refroidi, ajouter 2 pi de solution de bromure d'éthidium à 1%, et versez gel.
   ATTENTION! Le bromure d'éthidium est un mutagène et tératogène; s'il vous plaît utiliser des gants en nitrile et le protocole de sécurité lors de la manipulation. En variante, d'autres agents colorants ou de gel résoudre potentiellement moins toxiques peuvent être utilisés.
10. Préparer une solution de blocage (PBS avec 0,1% de Triton X-100, 10% de sérum bovin fœtal [FBS], et 3% d'albumine de sérum bovin [BSA]) pour immunofluorescence.
11. Préparer la solution de lavage (PBS avec 0,1% de Triton X-100, 1% de FBS, et 3% de BSA) pour immunofluorescence.
12. Préparer PbTx (PBS avec 0,1% de Triton X-100) pour immunofluorescence.
13. Préparer les chambres d'incubation pour culture. Remplissez de grands plats (100 mm de diamètre) de Petri avec 35 ml d'eau à l'autoclave. Placez près du lieu où la dissection et cultures seront effectuées.

2. Isolement des testicules du fœtus à partir de Mus musculus

1. Vérifiez la souris femelle pour bouchons vaginaux chaque matin. Midi le jour où le bouchon vaginal est détecté est considéré E0.5. Euthanasier la souris femelle enceinte à E11.5, d'une manière compatible avec les protocoles d'animaux approuvés.
2. Pulvérisation vers le bas de l'abdomen de la souris avec 70% d'éthanol.
3. Ouvrez la peau du ventre et du péritoine avec une incision en forme de V à l'aide de ciseaux fins et tirez lambeau de tissu pour exposer les organes intérieurs.
4. Repérez les ovaires aux deux extrémités de la corne utérine. Avec des ciseaux, couper à l'ovaire et le tissu conjonctif de séparer l'utérus contenant les embryons provenant du corps de la mère.
5. Ouvrez la paroi utérine en coupant doucement du côté opposé au placenta, exposant les sacs de jaune. Veillez à ne pas puncture jaune sac pour éviter d'endommager ou de perdre les embryons.
6. Coupez près du placenta pour enlever les sacs de jaune contenant l'embryon et les placer dans un plat contenant du PBS avec le calcium et le magnésium. La présence d'ions calcium et magnésium permettra de molécules d'adhésion cellulaire de support pour maintenir l'architecture tissulaire et empêchent le tissu de coller aux outils de dissection.
7. Avec une pince, retirer la vésicule ombilicale et amnios de l'embryon par ponction attentivement le sac jaune pour créer un trou dans lequel l'embryon peut glisser. Une fois que l'embryon est à l'extérieur de la vésicule ombilicale, couper le cordon ombilical.
8. De ce point en avant, utiliser un microscope situé dans une hotte de culture de tissu stérile. Retirer la tête de l'embryon et le jeter en pinçant avec des pinces de chaque côté du cou.
9. Retirer la queue et la placer dans nouveau tube pour l'analyse PCR XY pour déterminer le sexe de l'embryon.
   Remarque: Bien qu'il est optimal de gonades de la culture dès que possible après la récolte, il est également possible pour éliminer l'ADN de queue et effectuer XX / XY génotypage avant la culture, de sorte que le sexe de chaque embryon est connue et que le sexe désiré doit être mis en culture. Alors que le génotypage est fait, les embryons peuvent être tenus séparés (de sorte qu'ils peuvent être suivis) à 4 ° C ou sur de la glace avant d'être prêt pour la culture. Une mise en garde est que cette période en dehors in utero ou conditions de culture peut potentiellement affecter la viabilité de la culture ou le développement ultérieur au cours de la culture.
10. Fixez l'embryon dans une position couchée sur le fond de la boîte de culture en épinglant les aisselles de l'embryon avec une paire de pinces (généralement la pince détenus dans la main faible). Maintenir ces forceps en place pour maintenir l'embryon encore pendant le processus de dissection entier.
11. Avec autre paire de pinces, retirer la peau recouvrant l'abdomen et retirez délicatement le foie, les intestins et autres organes d'exposer paroi arrière du corps.
12. Comme les gonades se trouve sur la paroi arrière du corps de chaque côté de l'aorte dorsale,un grand navire de sang qui coule le long de la ligne médiane du corps, écope sous la crête urogénitale avec des pinces fermées et enlever la crête urogénitale en ouvrant la pince et soulevez. Comme les gonades seront mal fixés au mur, faites attention à ne pas tirer trop vite sans enlever ces raccordements ou les gonades peuvent étirer, causant des dommages aux organes.
13. Déplacez la crête urogénitale dans cDMEM dans un plat pour acclimater tissus aux médias.
14. Séparer le complexe gonades-mésonéphros du reste de la crête urogénitale en utilisant 27 g d'aiguilles. Utilisez une aiguille pour couper en appuyant vers le bas, et utiliser l'autre pour guider le tissu correctement pour permettre une séparation optimale. Évitez d'utiliser un mouvement de sciage contre le fond plat, comme des aiguilles pointues vont créer des tessons de plastique qui peuvent se coller sur le tissu. Veillez à garder les mésonéphros complètement attachés à la gonade.

3. La culture des gonades avec un inhibiteur de petite molécule

1. Placer les deux 20 μl pipettes à 15 pi de chacun. Couper environ 1-2 mm de l'un des conseils barrière de pipette en utilisant une propre, stérilisé lame de rasoir pour le transfert des gonades et plus de contrôle cDMEM, tandis que l'autre pipette sera utilisé uniquement pour cDMEM du traité par un médicament.
2. Alignez les gonades avec leur grand axe parallèle à la pointe de la pipette afin qu'ils puissent facilement être pipette en utilisant la pointe de coupure. Méfiez-vous des gonades coller à l'intérieur de la pointe de la pipette.
3. Attribuer un côté de la gouttelette de commande et l'autre comme la gouttelette contenant un médicament. Seulement deux gouttelettes peuvent tenir sur un couvercle de boîte de 35 mm. Assurez-vous que les étiquettes sur les couvercles correspondent aux étiquettes sur des microtubes queue contenant le tissu.
4. Pipette 15 ul de cDMEM contenant un seul gonades dans une gouttelette dans le couvercle d'un petit (35 mm) boîte de culture (utiliser uniquement les couvercles, car les fonds sont trop grand pour tenir dans une chambre de boîte de Pétri humidifié). Placez deux gouttelettes contenant des gonades distinctes de chaque côté de l'assiette, bien séparés from une autre. Arrivée au microscope pour s'assurer que les gonades ont été transférés à des gouttelettes.
5. Pour la gouttelette désigné comme le contrôle, ajouter un 15 pi supplémentaires de cDMEM contenant DMSO (faite à l'étape 1.5) à faire une gouttelette avec un volume total de 30 pi. Utilisez uniquement le «contrôle» pipette qui ne sera pas contacter le médicament.
6. Pour l'autre gouttelette (échantillon traité par le médicament), ajouter 15 ul de TKI-II contenant cDMEM effectuer une gouttelette d'un volume total de 30 ul. Utilisez uniquement la pipette désigné pour les échantillons traités avec le médicament.
7. Utilisation de la pipette, étaler les gouttes selon un motif circulaire expansion jusqu'à ce qu'ils soient environ 15 à 18 mm de diamètre et la gonade se trouve à peu près au milieu. Orientez la gonade sorte qu'il se trouve sur le côté et la gonade et mésonéphros sont facilement reconnaissables. Orientez le poumon de sorte que les deux lobes à plat.
   1. Bien que le diamètre des gouttelettes peut varier légèrement, veiller à ce que les gonades ne sont pas floating et sont maintenus en place par la tension de surface. Assurez-vous que les gouttelettes ne se touchent pas les uns les autres ou sur le côté du couvercle. Sans la tension de surface, les organes vont croître sur le couvercle pendant la culture et l'aplatir, faussant ainsi la morphologie d'organes.
8. Placez délicatement le couvercle de la boîte de culture contenant les gouttelettes debout sur la surface de l'eau dans le grand (100 mm) plat de l'humidificateur. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles emprisonnées sous le fond du couvercle et qu'il soit bien à plat sur la surface de l'eau. Ne pas inverser le couvercle et faire attention à ne pas laisser l'eau toucher le haut du couvercle où se trouvent les gouttelettes.
9. Pour créer une petite chambre humide, couvrir immédiatement avec le couvercle de la boîte de l'humidificateur plus grande pour enfermer les cultures des gonades. Agir aussi rapidement que possible afin de minimiser toute évaporation des médias. Veiller à ce que le plus petit plat a de la place entre lui et le couvercle de la plus grande antenne de se déplacer librement; autrement, une condensation peut faire un joint et bl'échange d'air verrouillage au tissu.
10. Une fois que deux petits couvercles sont placés dans la chambre, placer immédiatement la chambre dans l'incubateur. Incuber les cultures de gouttelettes de 48 heures dans un _incubateur à CO2 humidifié à 37 ° C.

4. Polymerase Chain Reaction pour déterminer le sexe des embryons

1. Ajouter les queues embryonnaires de fond d'un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
2. Ajouter à chaque tube 200 ul de NaOH 50 mM.
3. Placez à 95 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que le tissu soit complètement dissous.
4. Ajouter 50 pi de Tris-HCl 1M et vortex légèrement et brièvement.
5. Dans un tube de 1,5 ml, faire un mélange maître PCR frais en multipliant chaque volume par le nombre total d'échantillons: solution à 0,5 pi 25 uM d'amorce, 2,5 pi 10X Taq Buffer, 0,5 pi 10 mM dNTP (nucléotides), 19,3 pi nuclease- eau libre, 0,2 ul ADN polymérase Taq. Bien mélanger.
6. Ajouter 23pi de PCR Master Mix PCR à tubes contenant 3 pi lysat de queues digérés.
7. Tubes de Flick à les mélanger, puis effectuer un essorage court pour apporter les échantillons au fond du tube.
8. Exécutez le programme XY (Short) PCR (Tableau 1).
9. Charger les échantillons (avec 5x colorant) et de l'échelle dans un gel d'agarose à 2,5% dans un tampon TAE 1X.
10. Exécutez l'électrophorèse sur gel d'agarose jusqu'à bandes XX et XY peuvent être résolus.
11. L'image du gel de capture d'image avec de la lumière UV et.
12. Analyser le vs Y bandes spécifiques d'un chromosome X-chromosome spécifique (chromosome X = 331 paires de bases [BP] et XY = 302 pb) ^13; XY échantillons (hommes) auront deux bandes de 331 et 302 pb, tandis que les échantillons XX (femelles) apparaîtra comme une seule bande 331 pb.

5. Le total des immunofluorescence Mont Organ

Jour 1:

1. Retirez les gonades de la culture à l'aide d'une pipette de 1000 pi avec une pointe de coupure. Si on le désire, ils peuvent êtreplacé dans une boîte de PBS pour laver les milieux et réactifs. Placer dans PBS dans un tube de 0,5 ml à centrifuger. Le diamètre de tube inférieur permettra d'économiser les réactifs et le rendre plus facile de garder une trace des échantillons dans le tube.
   1. Soyez sûr de garder le contrôle et les échantillons traités, ainsi que des échantillons XX et XY, dans des tubes séparés et les retirer de la culture avec des ensembles distincts de pipettes pour éviter toute contamination de la drogue.
2. Laver les gonades deux fois avec PBS. De ce point sur, ce protocole peut utiliser PBS 1X manque calcium et le magnésium. Pour les laver, permettent les gonades pour couler au fond du tube (par gravité) puis retirez le liquide au-dessus. Veillez à ne pas perdre de gonades par pipetage trop près d'eux.
3. Enlever autant que possible à partir de PBS le tube. Ajouter 250 pi de paraformaldehyde à 4% dans du PBS contenant 0,1% de Triton X-100, et laisser incuber O / N à 4 ° C sur une bascule. En variante, cette fixation peut se faire pendant 2 heures à 4 ° C sur une bascule. ATTENTION! Paraformaldehyde est une substance toxique, alors suivez le protocole de sécurité lors de la manipulation.

Jour 2:

4. Rincer les gonades deux fois dans 250 pi PbTx à TA.
5. Laver les gonades 3 fois avec 250 ul PbTx chacune pendant 10 minutes à température ambiante sur une bascule.
6. Bloquer les gonades au moins 1 heure dans 250 pi solution à la température ambiante sur une bascule de blocage.
7. Colorer les gonades O / N à 4 ° C sur une bascule dans 250 pi d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage.

Jour 3:

8. Rincer les gonades deux fois dans 250 Solution de lavage ul.
9. Laver les gonades 3 fois avec 250 pi de la solution de lavage pendant 10 min à température ambiante chacun sur une bascule.
10. Bloquer les gonades 1 h dans 250 pi de solution de blocage à la température ambiante sur une bascule.
11. Couvrir le microtube de papier d'aluminium pour protéger les anticorps secondaires fluorescents de la lumière.
12. Incuber les gonades 2-4 heures à température ambiante sur arocker dans 250 ul anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage contenant Hoechst 33342. Alternativement, effectuer anticorps secondaire et Hoechst 33342 incubation O / N à 4 ° C sur la bascule.
13. Rincer les gonades deux fois dans 250 pi PbTx.
14. Laver les gonades 3 fois dans 250 pi PbTx chacune pendant 10 minutes à température ambiante sur une bascule.
15. En utilisant une pointe de pipette coupure, transférer gonades sur une lame de liquide minime. Retirer l'excès de liquide à la pipette, mais assurez-vous que le tissu ne se dessèche pas.
16. Orientez les gonades dans la mode désirée avec une pince, et ajouter rapidement une goutte de milieu de montage pour monter les gonades sur la diapositive. Assurez-vous que les manteaux de médias de montage tous les échantillons complètement; il est essentiel d'éviter de laisser sécher les échantillons.
17. Utilisez des lamelles (1.5 Numéro style) de taille appropriée pour couvrir délicatement échantillons. Laissez montage diffusion de médias pour communiquer avec toute la surface de la lamelle. Si nécessaire, appuyez très légèrement sur les coins de la lamelle couvre-objet de sorte queil n'y a pas de grosses bulles d'air.
18. Sceller les diapositives avec du vernis à ongles clair sur les bords pour réduire l'évaporation des médias de montage. Magasin diapositives montées dans l'obscurité à 4 ° C.

La culture ex vivo des gouttelettes permet de manipuler des organes entiers, tels que la gonade, pour étudier les interactions cellulaires et dynamique. La figure 1 montre d'une façon pas à pas comment préparer une culture E11.5 gonadique de gouttelettes. Les premières étapes du protocole de culture comprennent la suppression initiale de l'utérus contenant l'embryon de la souris mère (Figure 1A et 1B). Après élimination de l'utérus de la mère, la paroi utérine est coupé et les embryons sont libérés à partir de la vésicule ombilicale dans du PBS pendant plus dissection (figure 1C-E). Après le prélèvement d'organes viscéraux, la crête urogénitale est clairement visible le long de la paroi du corps dos de l'embryon (figure 1F) et est isolé (figure 1G). Le complexe gonades-mésonéphros est ensuite disséquée de la crête urogénitale (Figure 1H), et est placé dans la culture des gouttelettes avec un inhibiteur à petite molécule (figure 1I,gauche: "T" pour traiter) et sans inhibiteur à petite molécule (figure 1I, à droite: "C" pour le contrôle). Les petites boîtes contenant les gouttelettes sont enfermés dans une chambre de fortune humidifié (figure 1J) et incubées à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 48 heures.

Après 48 h d'incubation les organes en culture sont retirées, lavées avec du PBS et sont soumis à un ensemble de montage d'immunofluorescence protocole pour évaluer l'efficacité de la culture et le traitement de la toxicomanie; en variante, ils peuvent être traités pour l'extraction de l'ARN pour analyse l'expression du gène. Entières fœtales gonades-mésonéphros complexes (E11.5 et plus) ont un taux de survie élevé lors du transfert vers les milieux de culture immédiatement après une dissection propre et cultivées dans des conditions normales (37 ° C et 5% de CO 2) pour 48 heures (mais ils peuvent être potentiellement cultivées pendant plus longtemps si nécessaire). Les comparaisons des gonades E11.5 sous fond clair microscopy à incubation initiale par rapport au bout de 24 ou 48 h de culture révèle un changement radical dans la forme des gonades et l'apparition de structures de la moelle de bandes comme dans la gonade contrôle XY (Figure 2). Par conséquent, après culture pendant 48 heures, l'évolution est comparable à celle de E13.5 dans les gonades in utero (figure 2). En outre, le poumon fœtal E11.5 se développe et affiche augmenté de ramification qui se produit normalement au cours de cette phase de développement (figure 2). Le processus de la culture se traduit généralement par des organes plus petits par rapport à in utero, probablement en raison de fait que les conditions de culture ne sont pas aussi optimal pour la croissance par rapport à l'environnement in utero (voir la discussion).

Bien que la taille des organes issus de la culture de 48 heures diffère de celle des organes -developed in utero, cultivées ex vivo montrent organes architecture tissulaire similaire et peuvent servir en tant que substituts des motifs (FFIGURES 3 et 4). Pour caractériser l'architecture d'organes et de la morphogenèse, marqueurs qui étiquettent spécifiquement types de cellules d'organes critiques ont été utilisés, tels que SOX9 pour pour les cellules des testicules de Sertoli et des cellules pulmonaires de ramification, la E-cadhérine pour les cellules épithéliales pulmonaires, PECAM1 pour les cellules germinales et vasculaire, et caspase 3 les cellules apoptotiques (figures 3 et 4). Sox9, codant pour un facteur de transcription, joue un rôle important dans la prolifération d'organes du fœtus, la différenciation, et la formation de la matrice extracellulaire. Par conséquent, dans les deux organes, SOX9 est utilisé en tant que marqueur d'architecture commune qui marque les cellules de Sertoli situés à l'intérieur les cordes des testicules et des structures de ramification 14-16 dans les poumons 17.

Cultures de gonades en particulier de recréer in utero morphogenèse efficacement. La gonade de la souris est spécifié au embryonnaire (E) E10.0 de scène et est initialement morphologiquement identique dans XY (mâle) et XX (femALE) embryons. L'expression de la (région déterminant le sexe du chromosome Y) gène SRY dans XY gonades à partir de E10.5 entraîne des changements moléculaires et morphologiques majeures qui se produisent rapidement entre E11.5 et E13.5 dans le testicule foetal 19, y compris: la spécification de Les cellules de Sertoli, la lignée cellulaire de support du testicule; la formation de cordons testiculaires, qui sont constitués de cellules de Sertoli et de germe et qui sont les précurseurs du fœtus à tubes séminifères adultes; et le remodelage vasculaire majeur. Dans le remodelage vasculaire spécifique au mâle, les cellules endotheliales libérés à partir d'un plexus vasculaire dans le mésonéphros voisins migrent dans les gonades pour former un système artériel 4,20 spécifiques des testicules. Immunofluorescence analyses révèlent des structures de la moelle testicules bien développés et vasculaire à E13.5 dans les testicules in utero par rapport à E11.5 testicules (Figure 3). Comme les images de la figure 3 montrent, le système de culture de gouttelettes peut recréer testicule différenciation events ex vivo, comme il est possible de visualiser cellules de Sertoli Sox9-positif dans les gonades XY en formant cordons et les tubules-vasculaire comme constituant tout au long de l'organe. En ce qui concerne les poumons, les résultats de la culture de 48 h à ramification accrue des SOX9 / E-cadhérine branches épithéliales double positifs au cours de 2 jours (Figure 4). En outre, nous voyons des niveaux similaires de l'apoptose dans le contrôle de culture et dans les gonades utéro, alors qu'il ya une certaine augmentation dans les cellules apoptotiques dans les poumons dans les mêmes conditions de culture (figures 3 et 4), ce qui suggère que la gonade est prête particulièrement bien aux conditions de culture.

Des inhibiteurs à petites molécules peuvent être utilisées pour étudier le développement des organes en agissant sur la localisation cellulaire, la prolifération, et l'état du cycle cellulaire, ainsi que l'architecture d'organes et diverses cascades de signalisation. L'ensemble du procédé ex vivo de gouttelettes d'organes permet au chercheur d'administrer réactifs pharmacologiques facilement feorganes Tal, à un très petit volume de milieu de culture. Pour examiner les effets de la vascularisation et le remodelage vasculaire sur la différenciation et la morphogenèse des testicules, nous avons utilisé l'inhibiteur à petites molécules TKI II, un réactif qui perturbe le développement vasculaire testicule 3 en bloquant l'activité de récepteurs de VEGF; la formation de l'architecture du testicule fœtal se produit d'une manière dépendant de vasculaire, par l'intermédiaire vasculaire facteur A de croissance endothelial (VEGFA) 11,12. Alors que la vascularisation du testicule est essentiel pour l'exportation de testostérone qui entraîne une virilisation de l'embryon, il est également un facteur majeur de testicule cordon morphogenèse: travaux antérieurs ont montré que lorsque la signalisation VEGFA est bloqué au plus tard à E11.5, les cellules de Sertoli ne parviennent pas à partitionner à partir entourant les cellules interstitielles et aucune structure de la moelle former 3,12. Les résultats présentés ici démontrent que la perturbation de remodelage vasculaire dans le testicule fœtal est efficace dans le système de culture de gouttelettes, et subsequent défauts de testicule morphogenèse (ie, la formation de cordon testiculaire anormale) peuvent être visualisées (figure 3). Il convient de noter que PECAM1, un marqueur pour les cellules endotheliales, est également exprimé par les cellules germinales (figure 3); cette coloration des cellules germinales est un contrôle interne qui montre que l'absence de coloration dans les gonades vasculaire traitée est pas pour des raisons techniques, mais aussi démontre que d'autres types cellulaires telles que les cellules germinales sont pas affectés par le traitement de la toxicomanie. Étant donné que la plupart des testicules morphogenèse initiale a lieu entre E11.5 et E13.5, ces étapes sont la fenêtre optimale pour déterminer les facteurs qui influencent la différenciation selon le sexe, en particulier le rôle du VEGF et le remodelage vasculaire dans la gonade.

L'utilisation de TKI II au cours du développement du poumon entre E11.5 et E13.5 montre que l'inhibition de petite molécule de la vascularisation peut être reproduit dans un autre organe (figure 4). Ce résultat montre l'efficacité de la til ex vivo système modèle de culture fœtal de gouttelettes d'organes et la possibilité d'utiliser des inhibiteurs à petites molécules pour modifier les voies de signalisation à l'intérieur des organes. Compte tenu de la facilité et la souplesse et l'efficacité de ce protocole, la culture de gouttelettes fournit une alternative appropriée pour les questions expérimentales concernant le développement des organes qui ne peut pas être traitée dans vivo.

Figure 1. Étapes du vitro organe entier protocole de culture de gouttelettes dans. (A) euthanasiés souris enceinte de cavité péritonéale ouvert. (B) de la corne de l'utérus avec embryons clos. (C) Vue rapprochée de la paroi de l'utérus ouvert avec poutres jaune sac contenant de l'embryon. (D) Un seul embryon (e) est fixé au placenta (p) enfermé dans le sac vitellin (y). (E) f embryon séparé rom placenta et le sac vitellin. (F) embryon disséqué avec les viscères retirés et crête urogénitale exposés (gonades sein crête urogénitale bordé de noir). (G) Close-up de isolé de crête urogénitale (complexes-mésonéphros gonades décrites en noir). Astérisque indique aorte dorsale G et H. (H) séparation du complexe gonades-mésonéphros de crête urogénitale (dissection représenté par le noir en pointillés). g, gonades; m, mésonéphros. (I) Mise en place de cultures de gouttelettes à l'intérieur de 35 mm couvercle de boîte de culture. Les flèches noires indiquent les gonades dans les gouttelettes. T, traitée; C, le contrôle. (J) Deux culture couvercles des capsules gouttelettes placés dans une chambre humidifiée ouverte. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Développement des ex vivo gouttelette organes cultivés par rapport à des organes in utero images de fond clair:. E11.5 en-utéro développé organes (poumons) et les gonades (première colonne); E11.5 organes après 24 h (deuxième colonne) et 48 h de culture contrôle de gouttelettes (troisième colonne); Organes cultivés pendant 48 heures avec un inhibiteur de VEGFR-TKI II (quatrième colonne) de E11.5; et E13.5 en-utéro organes (cinquième colonne) développé. Gonades sont orientés avec des gonades (de structure claire) au-dessus des mésonéphros (structure opaque). Gonades E11.5 sont bipotentiel et apparaissent morphologiquement identique dans XY (mâle) et XX échantillons (femelle). La barre d'échelle, 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Ex vivo testicules de culture de gouttelettes sont comparables dans l'architecture des tissus et la mort cellulaire à leurs homologues en-utéro développés images immunofluorescence de:. E11.5 in utero -developed testicules fœtaux (première colonne); testicules contrôle E11.5 après 48 heures de contrôle ex vivo la culture de gouttelettes (deuxième colonne); E11.5 testicules après 48 heures de culture ex vivo de gouttelettes avec un inhibiteur de VEGFR-TKI II (troisième colonne); et E13.5 en-utéro développé testicules (quatrième colonne). Les lignes pointillées indiquent gonades-mésonéphros frontière (gonades est orientée sur le dessus). SOX9 est un marqueur de cellules de Sertoli et permet de visualiser l'architecture du testicule de la moelle; PECAM1 est exprimée en germe et les cellules endothéliales vasculaires (donc, en restant PECAM1 coloration dans les gonades traités est presque exclusivement les cellules germinales); et cleaved Caspase 3 est un marqueur des cellules apoptotiques. Gonades de contrôle de culture ont montré formation similaire cordon testiculaire, vascularisation spécifique testicule (flèches à travers la figure), et les niveaux de l'apoptose par rapport à leurs homologues en-utéro développés, tandis que les gonades TKI-II-cultivées exposées perturbé le système vasculaire et la morphogenèse testicule de cordon anormale. Les parenthèses indiquent domaine de surface de gonade où le système vasculaire est normalement présent mais n'a pas été détecté dans les échantillons traités. Pointes de flèches pointent vers mourir amas de cellules vasculaires dans les testicules TKI-II-traités. La barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Autres organes du fœtus (poumon) cultivées ex vivo dans des gouttelettes sont comparables à > In- utéro organes développés des images d'immunofluorescence de:. E11.5 in utero poumons -developed (première colonne); E11.5 poumons après 48 h de contrôle ex vivo de la culture de gouttelettes (deuxième colonne); E11.5 poumons après 48 heures de culture ex vivo de gouttelettes avec un inhibiteur de VEGFR-TKI II (troisième colonne); et E13.5 en-utéro développé poumons (quatrième colonne). Sox9 étiquettes de cellules de ramification; Marques E-cadhérine épithéliale structures tubulaires; PECAM1 étiquettes endothélium vasculaire; et la caspase 3 clivée marques cellules apoptotiques. organes de commande en culture ex vivo montrent architecture similaire et l'expression de SOX9, E-cadhérine, et PECAM1 d'organes de culture par rapport à utéro-développé dans les organes, mais des quantités de variation de la mort cellulaire. Lors du traitement avec TKI II, le développement vasculaire est considérablement réduit dans les poumons (tel que révélé par PECAM1 coloration). La barre d'échelle, 100 um.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Programme d'analyse PCR XY paramètres de cycle pour "(court) XY" programme de PCR utilisé pour XX / XY génotypage des embryons..

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.