La construction de base de cellules fluorescentes neurotransmetteur Engineered Reporters (CNiFERs) pour la détection optique des neurotransmetteurs In Vivo

Résumé

Nous présentons un protocole pour créer journalistes neurotransmetteur fluorescents à base de cellules modifiées (CNiFERs) pour la détection optique de la libération de neurotransmetteurs volumétrique.

Résumé

Reporters base de cellules fluorescentes neurotransmetteur d' ingénierie (CNiFERs) fournissent un nouvel outil pour les neuroscientifiques pour détecter optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. Un CNiFER spécifique est créé à partir d' une cellule de rein embryonnaire humain qui exprime de manière stable un récepteur spécifique G couplé à la protéine, qui couple à G _{q / 11} protéines G, et un Ca ²⁺ -detector à base de FRET, TN-XXL. L'activation du récepteur conduit à une augmentation du signal FRET. CNiFERs ont une sensibilité nM et une réponse temporelle de secondes parce qu'un clone CNiFER utilise le récepteur natif pour un neurotransmetteur particulier, par exemple, D2R pour la dopamine. CNiFERs sont directement implantés dans le cerveau, ce qui leur permet de détecter la libération des neurotransmetteurs avec une résolution spatiale inférieure à cent um, ce qui les rend idéales pour mesurer la transmission de volume in vivo. CNiFERs peut également être utilisé pour dépister d' autres médicaments pour la réactivité croisée potentielle dans vivo. Nous avons récemment élargi la famille de CNiFERs pour inclure GPCR ce couple à G _{i / o} protéines G. CNiFERs sont disponibles pour la détection de l'acétylcholine (Ach), la dopamine (DA) et la norepinephrine (NE). Étant donné que toute GPCR peut être utilisé pour créer un roman CNiFER et qu'il ya environ 800 GPCR dans le génome humain, nous décrivons ici la procédure générale pour concevoir, réaliser et tester tout type de CNiFER.

Introduction

Pour bien comprendre comment les neurones communiquent dans le cerveau, il est nécessaire d'avoir une méthode pour mesurer la libération de neurotransmetteurs in vivo. Il existe plusieurs techniques bien établies pour la mesure in vivo des neurotransmetteurs. Une technique couramment utilisée est microdialyse, dans laquelle une canule est insérée dans le cerveau et un faible volume de liquide céphalorachidien est recueillie et analysée par chromatographie en phase liquide à haute performance et détection électrochimique ^1. Microdialyse a une résolution spatiale de l'ordre de quelques diamètres de la sonde, par exemple environ 0,5 mm pour un diamètre microsonde 200 um. La résolution temporelle de cette technique, cependant, est lente en raison des intervalles d' échantillonnage qui durent généralement environ 5 minutes ou plus ^1. En outre, les analyses ne sont pas faites en temps réel. Une autre technique consiste à balayage rapide voltamétrie cyclique (FSCV), qui utilise une sonde en fibre de carbone qui est insérée dans le cerveau. FSCV a une excellente températurerésolution orale (subsecond), haute sensibilité (nanomolaire), et la résolution spatiale avec des diamètres de sonde de 5 à 30 um. Cependant, FSCV est limitée aux émetteurs qui produisent une oxydation caractéristique et le profil de réduction avec la tension sur une sonde potentiométrique de carbone ^2.

Une troisième technique pour mesurer les neurotransmetteurs est directement à travers neurotransmetteurs génétiquement codés (NT) biocapteurs ^3. Avec cette méthode, une protéine de fusion est créée qui contient un domaine de liaison de ligand pour un émetteur couplé à un transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) paire à base de fluorophores ⁴ ou ⁵ permuté une GFP. Contrairement aux deux procédés précédents, ces biocapteurs sont génétiquement codées et exprimées sur la surface d'une cellule hôte, telle qu'un neurone, grâce à la production d'animaux transgéniques ou aiguë avec l'utilisation d'agents viraux pour infecter des cellules. À ce jour, les biocapteurs génétiquement codés ont été seulement développé pour detecting de glutamate et de GABA ^05/03. Limitations avec ces techniques ont été la faible sensibilité, dans la gamme nM, et l'incapacité à élargir la détection du grand nombre d'émetteurs, par exemple, les neurotransmetteurs classiques, neuropeptides et neuromodulateurs, qui signalent par G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). En fait, il y a près de 800 GPCR dans le génome humain.

Pour combler ces lacunes, nous avons développé un outil innovant pour mesurer optiquement la libération de tout neurotransmetteur qui signale par un GPCR. CNiFERs (fluorescente neurotransmetteur à base de cellules rapporteurs modifiés) sont des cellules HEK293 clonales modifiées pour exprimer un GPCR spécifique qui, lorsqu'il est stimulé, provoque une augmentation intracellulaire [Ca ^2+] , qui est détecté par un capteur à base de Ca ²⁺ FRET codé génétiquement, TN-XXL. Ainsi, CNiFERs transformer la liaison en un changement de fluorescence, en fournissant un r optique en temps réel directe et récepteur neurotransmetteuread-out de l'activité des neurotransmetteurs local. En utilisant le récepteur natif pour un neurotransmetteur donné, CNiFERs conserver la spécificité chimique, l' affinité et la dynamique temporelle des récepteurs endogènes exprimés. À ce jour, nous avons créé trois types de CNiFERs, un pour la détection de l' acétylcholine en utilisant le récepteur M1, un pour la détection de la dopamine en utilisant le récepteur D2 et une pour la détection de la norépinéphrine à l' aide du ^6,7 récepteur α1a. La technologie CNiFER est facilement extensible et évolutive, ce qui rend prête à tout type de GPCR. Dans cet article JoVE, nous décrivons et illustrons la méthodologie pour concevoir, réaliser et test CNiFERs in vivo pour toute application.

Protocole

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude sont conformes à Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices, et ont été approuvés par les IACUC à l'École Icahn de médecine Mount Sinai et l'Université de Californie, San Diego.

1. Générer GPCR exprimant lentivirus pour transformer des cellules HEK293

1. Obtenir l'ADNc pour un GPCR spécifique à partir d' une source commerciale, par exemple cdna.org. En variante, amplifier le gène de GPCR à partir d'une banque d'ADNc en utilisant une PCR. Obtenir un vecteur lentivirus exprimant, comme pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Utiliser ce vecteur pour propager l'ADN ainsi que pour générer des lentivirus.
2. Cloner l'ADNc de GPCR dans le vecteur de lentivirus exprimant par PCR. Voir Lorenz ^8, pour plus de détails sur le sous - clonage PCR.
3. Développer et purifier le pCDH-GPCR l'ADN en utilisant un 'maxi' kit de préparation sans endotoxine selon les instructions du fabricant. Vérifiez que le GPCR ADNc sous-cloné dans pCDH est mutation-libre par séquençage d'ADN.
   Note: Avant de soumettre l'ADN pour la production de virus, digérer une aliquote avec une enzyme de restriction appropriée pour confirmer la taille de l'insert et de la pureté de l'ADN.
4. Générer lentivirus en utilisant une installation de base de virus, comme celui au Salk Institute, Université de Penn., Ou à l' Université de Caroline du Nord, etc., ou générer en interne ^9. Utiliser environ 25 ug (> 1 ug / ul) d'ADN exempt d'endotoxine pour la transfection de cellules HEK dans un flacon T75. Faire en sorte que l'ADN soit d' une grande pureté, ayant un rapport d' absorbance (A ₂₆₀ / A ₂₈₀₎ de ~ 1,8.
   Note: Les titres de virus ~ 10 ¹¹ -10 ¹² GC / ml sont optimales pour la transduction des cellules HEK293.

2. Choisir HEK293 / TN-XXL type Backbone cellulaire pour la culture in vitro

Note: Déterminer la protéine G spécificité de couplage, par exemple, G _{i / o,} G _{q / 11,} ou G protéines Gs, du GPCR, que ce dicTates si une protéine G chimère est nécessaire pour la CNiFER. Pour G _q récepteurs -coupled, par exemple M1 récepteurs muscariniques, choisissez HEK293 / TN-XXL (# 3G8) comme l'épine dorsale HEK293 type de cellule. Pour G _{i / o} -coupled récepteurs, la protéine G chimère G _qi5 est nécessaire ^10. Pour le récepteur -coupled _de G, le G _QS5 chimère est nécessaire ^10. Dans ce protocole, la construction d'un D2R CNiFER est utilisé à titre d'exemple. Signaux D2R par G _{i / o} protéines G et nécessite des cellules HEK293 qui expriment de manière stable la protéine chimère G, G _qi5, par exemple, HEK293 / TN-XXL / G _qi5 _ # qi5.6.

1. Obtenir les HEK293 / TN-XXL / G _qi5 _ # qi5.6 cellules clonales à partir d' un laboratoire de recherche. Note: Ce qui suit les cellules clonales, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) pour G _q -coupled récepteurs, HEK293 / TN-XXL / G _qi5 (# qi5.6) G _{i / o} -coupled récepteurs et HEK293 / TN -XXL / G _QS5 (# qs5.47) pour re -coupled Gprécepteurs, sont disponibles gratuitement sur ​​demande ^6,7.
2. Croître et se développer HEK293 / TN-TTG / G _qi5 _ # qi5.6 à ~ 90% de confluence dans une fiole T25 avec 5 ml de milieu de croissance HEK293 (tableau 1). Cultiver les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2.
   Remarque: Tous les travaux avec la culture de cellules HEK293 doit être effectuée en utilisant des techniques de culture de tissus stériles standard.
3. Récolter les cellules HEK293 d'abord par aspiration médias de T25 flacon. Laver les cellules en douceur en ajoutant 5 ml de PBS et on bascule ballon.
4. Retirer le PBS et on ajoute 1 ml de 0,05% (p / v) de trypsine / EDTA (tableau 2). Incuber pendant 1 à 2 min à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2.
5. Recueillir les cellules et transfert à stériles 15 ml tube conique. Centrifuger pendant 5 min à 1000 x g dans une centrifugeuse de culture cellulaire. Aspirer le surnageant.
6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de croissance HEK293. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètrebleu trypan. Calculer la densité cellulaire et passez à l'étape 3.

3. Lentiviral transduction de HEK293 / TN-XXL Cellules / Gqi5

1. Graine d' un flacon T25 avec 0,7 x 10 ⁶ cellules _qi5 HEK293 / TN-XXL / G. Cultiver les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO ₂ jusqu'à ~ 50% de confluence, après environ 1 jour. Geler les cellules restantes (étapes 8.2-8.3). Ces cellules serviront de contrôle CNiFER, à savoir, un CNiFER qui manque le GPCR.
2. Le jour de l'infection, on dilue le lentivirus exprimant le GPCR (étape 1.4) à une concentration finale de 10 ~ ⁹ GC / ml dans un volume total de 2 ml de milieu de croissance HEK293 (tableau 1). Par exemple, ajouter 20 ul de virus 10 ¹¹ GC / ml à 2 ml de milieu dans un flacon T25.
   Remarque: Les informations de titre de virus devrait être fourni par l'installation de base de virus. Combinez lentivirus et les médias dans un tube de centrifugeuse et triturer doucement. Des titres élevés de lentivirus sont du niveau de biosécurité 2 (BSL-2).
3. Aspirer le support du flacon T25. Ajouter 2 ml de virus / mélange des médias de l'étape 3.2. Incuber le flacon T25 O / N à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2.
4. Après une journée d'infection, aspirez le virus / mélange des médias et le remplacer par un milieu de croissance HEK293 contenant la puromycine (2 pg / ml; tableau 1). Puromycin sélectionne les cellules transduites. Incuber le ballon à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO ₂ jusqu'à environ 90% de confluence, après ~ 1-2 jours.
5. Préparer une plaque à 96 puits (noir avec fond transparent) revêtu de fibronectine, pour générer une courbe agoniste / activation de 10 points à l'étape 4.1. Dans une hotte stérile, ajouter 50 ul de fibronectine (5 ug / ml) par puits dans les lignes A et B de la plaque de 96 puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 h. Rincer deux fois pendant 5 min par rinçage avec du PBS. Ajouter 50 ul de milieu de croissance et laisser incuber HEK293 O / N à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2.
   Remarque: Fibronplaques ectin traitées sont disponibles dans le commerce.
6. Récolter les cellules dans le flacon T25 , comme décrit dans les étapes 2,3-2,6 (tableau 2).
7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de croissance HEK293. Ensemencer un flacon T25 avec 1,5 ml de cellules pour une analyse FACS. En outre, les graines d'un flacon T75 avec 1 ml de cellules pour la congélation et de stockage (voir les étapes 8.2-8.3)
8. Pour la courbe de l'agoniste de 10 points, ensemencer les deux premières lignes (A et B) d'une plaque à 96 puits revêtues de fibronectine (étape 3.5) avec 100 ul de la suspension cellulaire par puits.
9. Incuber les cellules HEK293 qui poussent dans un flacon T25, d' un flacon T75 et d' une plaque à 96 puits jusqu'à environ ~ 90% de confluence à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2, après ~ 1-2 jours.

4. FACS et Isolement de simples CNiFER Clones

1. Utilisez la plaque de 96 puits pour générer une courbe d'activation agoniste de 10 points.
   Remarque: Avant de commencer le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), il est important de confirmer lal'expression du GPCR en testant les cellules transduites d'une réponse agoniste (courbe agoniste 10 points). Ce test est effectué en utilisant un lecteur de plaque fluorométrique.
   1. Préparer une plaque de médicament pour la courbe d'activation agoniste de 10 points. Choisissez 10 concentrations différentes agonistes qui encadrent la prédits CE _50, qui peuvent être déterminées à partir de la littérature.
      Remarque: La plaque de médicament contient 3 fois de chaque concentration (en double) pour ajuster la dilution 1: 3 dans la plaque CNiFER. Par exemple, la plaque d'essai d'un médicament pour CNiFER D2 contient 10 concentrations différentes de la dopamine, à des concentrations de 3 fois; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 et 1000 nM. Dans la plaque CNiFER, par conséquent, les concentrations finales de la dopamine sont 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7 et 333 nm.
   2. Préparer les solutions d' agoniste en utilisant un fluide céphalorachidien artificiel (ACSF) (tableau 1). Utiliser deux puits pour "ACSF", par exemple A1 et A2,et deux puits pour les cellules «non», par exemple, B1 et B2.
      Note: Préparer les différentes concentrations de médicaments en utilisant une méthode de dilution en série. Créer un modèle pour garder la trace des clones CNiFER et les concentrations de médicament (figure 3).
   3. Utiliser le logiciel pour programmer le lecteur de plaque à 96 puits pour la mesure fluorométrique FRET et effectuer des transferts de solution.
      1. Réglez la température de lecteur de plaque à 37 ° C.
      2. Pour la mesure de FRET avec TN-XXL, régler la longueur d'onde d'excitation à 436 ± 4,5 nm (centre ± HWHM). Définissez les filtres d'émission à 485 ± 7,5 nm pour ECFP et à 527 ± 7,5 nm pour Citrine. Réglez le filtre de coupure à 475 et 515 nm pour ECFP et Citrine, respectivement.
      3. Programmer le lecteur de plaque pour mesurer l'émission à 485 nm et 527 nm toutes les 4 secondes pour un total de 180 sec. Choisir l'option pour délivrer 50 ul de la plaque de médicament trois fois à 100 pl de la plaque CNiFER, après avoir recueilli 30 secondes d'la fluorescence de base.
   4. Aspirer les médias de lignes A et B et ajouter 100 ul de ACSF à la plaque de 96 puits CNiFER qui est ~ 90% confluentes (étape 3.9).
   5. Chargez le plaque à 96 puits CNiFER et le «3 fois» plaque de médicament dans le lecteur de plaque. Autoriser ~ 30 min pour équilibrer les plaques à 37 ° C. Ensuite, démarrez le programme.
   6. Pour analyser les données de lecteur de plaque, exporter les valeurs de fluorescence à une feuille de calcul. Créer une formule pour soustraire les mesures de fond (prises pour chaque signal à partir de puits sans cellules) de puits avec CNiFERs. Normaliser intensités de fluorescence à des lignes de base-relance pré, F _Citrine (t) / F _Citrine (ligne de base), et calculer le ratio de FRET (AR / R;. L' équation 1) en utilisant les réponses de pointe à 527 nm et 485 émissions nm (voir l' étape 11 ).
      Remarque: S'il y a un changement significatif dans AR / R avec l'agoniste, cela indique l'expression du GPCR et on peut procéder à l'analyse FACS (étape 4.2). Si eavant l'absence de réponse de FRET avec agoniste, résoudre en utilisant un ionophore ^{Ca2 +,} par exemple, A21387, pour tester la réponse Ca ²⁺ et confirmer que le capteur à base de FRET fonctionne. Si le ionophore fonctionne, le récepteur n'a pas été probablement exprimé.
2. A la veille de FACS, préparer quatre plaques à 96 puits revêtues de fibronectine (voir étape 3.5) pour collecter les cellules triées. Ajouter 50 ul de milieu de croissance et laisser incuber HEK293 O / N à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2.
3. Préparer 5% (p / v) de BSA dans du PBS (5 g / 100 ml) et on filtre (0,2 pm) dans un flacon stérile.
4. Récolter les cellules cultivées dans le flacon T25 (voir les étapes 2.3-2.5, tableau 2). Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de 5% (p / v) de BSA dans du PBS. Centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min.
5. Aspirer les médias et remettre en suspension le culot cellulaire dans environ 5 ml de 5% (p / v) de BSA dans du PBS pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 ~ ⁶ cellules / ml.
   Remarque: Vérifiez auprès de la FAinstallation de base CS pour des besoins spécifiques sur la densité cellulaire et les conditions de tri.
6. Filtrer les cellules remises en suspension avec un tamis cellulaire de 40 um pour éliminer les grumeaux. Transférer les cellules à un 5 ml polypropylène tube rond en bas. Placer le tube sur la glace pour le transport vers l'installation FACS.
7. Trier les cellules HEK293 transduites dans une installation FACS. Programmer les paramètres sur un cytomètre de flux FACS comme suit: set 4 ° C pour le porte-échantillon, 100 um pour la buse et 20 psi. Sur la base de l'analyse pré-tri, sélectionnez les cellules, soit choisir une «porte», qui ont une grande fluorescence ECFP (ECFP d'excitation, ECFP émission) et un grand FRET (ECFP excitation, Citrine émission) fluorescence (voir les résultats ci - dessous, la figure 2 ).
8. Fort individuel, cellules triées dans une plaque à 96 puits préparé à l'étape 4.2, avec un clone par puits contenant 50 ul de milieu de croissance HEK293 avec puromycine. Ajouter 50 ul de milieu de croissance HEK293 avec la puromycine (Table 1) pour un total de 100 pi par puits. Maintenir les cellules O / N à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2.
   Remarque: les milieux de croissance de HEK293 contient puromycine pour la sélection de cellules transduites.

5. la mise en culture et l'expansion de classement, CNiFERs clonales

1. Maintenir les CNiFERs dans les plaques à 96 puits en supprimant 50 ul de vieux support de chaque puits et les remplacer par 50 ul de milieu de croissance frais contenant HEK293 puromycine (tableau 1). Répétez ce tous les 5 à 7 jours jusqu'à ~ 90% de confluence, après 2-3 semaines.
2. Récolte des cellules CNiFER par aspiration doucement les médias et le rinçage une fois doucement avec du PBS. Retirer le PBS et on ajoute 20 pl de 0,05% (p / v) de trypsine / EDTA. Incuber pendant 1 à 2 min à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2.
3. Ajouter 100 ul de milieu de croissance des cellules HEK293 aux traités à la trypsine et remettre en suspension les cellules. Transférer le contenu dans une plaque de 24 puits contenant 400 ul HEK293 frais wit de milieux de croissanceh puromycine. Dans la plaque à 24 puits, maintenir les cellules en remplaçant 250 ul de milieu de croissance HEK293 tous les 5-7 jours jusqu'à ce que les puits sont ~ 90% de confluence.

6. Identifier CNiFERs candidats basée sur la réponse FRET utilisant fluorométrique lecteur de plaque

Note: Avec quatre plaques à 96 puits suivant FACS, il devrait y avoir> 100 clones testables qui survivent et se dilatent à l'étape de plaque de 24 puits, puisque la plupart des clones originaux ne parviennent pas à se développer. Pour identifier CNiFERs candidats potentiels, utiliser une analyse de 3 points pour la réponse de FRET avec agoniste apparenté, par exemple, la dopamine pour D2R.

1. Lorsque les cellules sont confluentes à environ 90% dans la plaque à 24 puits, aspirer avec douceur le support. Ajouter ~ 100 ul de 0,05% (p / v) de trypsine / EDTA et on incube pendant 1-2 min à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2. Ajouter 400 ul de milieu de croissance des cellules HEK293 aux traités à la trypsine et mélanger les cellules par trituration douce.
2. Mettre en place la courbe agoniste 3 points pour le dépistage initial du clonda. Pour chaque clone CNiFER, soit l' un des puits de la plaque à 24 puits, aliquoter 100 pi de la suspension cellulaire (~ 4 x 10 ³ cellules / puits) dans chacun des trois puits, par exemple, A1, A2, A3, de une plaque de 96 puits fibronectine (noir avec fond clair) (voir l'étape 3.5).
3. Transférer les 200 ul restants ~ de la suspension cellulaire à une plaque de 12 puits contenant 1000 ul de milieu de croissance HEK293 (1,2 ml de volume final). Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% (v / v) de CO _2, jusqu'à environ 90% confluentes. La plaque à 96 puits est pour le dosage fluorométrique et la plaque de 12 puits est pour la croissance et l'expansion des clones.
4. Pour l'analyse de 3 points, déterminer trois concentrations différentes d'agoniste qui sont 0.1-, 1.0- et 10 fois la CE ₅₀ pour le GPCR spécifique. Préparer des concentrations agonistes dans une plaque de médicament comme décrit dans les étapes 4.1.1-4.1.2. Effectuer un test de lecteur de plaque fluorométrique comme décrit dans les étapes 4.1.3-4.1.5.
5. Calculer la FRrapport ET (AR / R) tel que décrit dans l'étape 4.1.6. Choisissez CNiFERs qui ont une sensibilité appropriée et la plus grande réponse de FRET pour l'expansion, le gel de retour, et des analyses plus complètes (étape 7).
6. Pour les clones qui ont été sélectionnés dans l'étape 6.5 et sont en croissance dans la plaque de 12 puits, enlever et remplacer 600 pi des HEK293 milieux de croissance tous les 5 à 7 jours, jusqu'à ce que ~ 90% de confluence.
7. Peu à peu étendre les clones à partir d' une plaque de 12 puits à une plaque de 6 puits, puis à un flacon T25 (étapes 02.03 à 02.06 et le tableau 2). Lorsque le flacon T25 est ~ 90% confluentes, les cellules de récolte comme décrit (étapes 2,3-2,5). Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de croissance HEK293.
8. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans un flacon T75 avec 9 ml de milieu de croissance HEK293. Utiliser les 4 ml restants de la suspension de cellules pour la cryoconservation et le stockage dans l' azote liquide ₂ (étapes 8.2 à 8.3). Préparer huit 1,5 ml cryotubes et placer sur la glace.
9. Dans le flacon T75, maintenir les cellules en remplaçant les milieux with milieux de croissance de HEK293 frais, par exemple, 10 ml tous les 3-5 jours jusqu'à 70-80% confluentes, après ~ 1-2 semaines.

7. Sélection finale de CNiFER Clones Utilisation fluorométrique lecteur de plaque

1. Le jour avant l'essai de lecteur de microplaques:
   1. Cellules de récolte à partir d' un flacon T75 confluentes ~ 90% (voir les étapes 2.3-2.6, tableau 2). Seed une plaque de fibronectine 96 puits (noir avec fond clair) à 5 x 10 ⁴ / puits avec environ 100 pi de suspension cellulaire. Remarque: Un clone est distribué dans une plaque à 96 puits unique.
2. Préparer une plaque de médicament pour le dépistage complet des clones CNiFER, en distinguant les réponses agonistes spécifiques des réponses non spécifiques CNiFER.
   1. Pour générer une courbe dose-réponse complète, choisissez 10 concentrations d'agonistes différents autour de la CE prédit _50. Utilisez deux puits pour 'pas de cellules »et deux puits pour' ACSF '.
   2. Pour la détermination des réponses non spécifiques, choisissez thrconcentrations ee de 12 différents neurotransmetteurs ou modulateurs (72 puits) (figure 3). Comme l'agoniste, la plaque de médicament contient des concentrations de 3 fois en double. Par exemple, 100 ul de trois concentrations différentes de l'acétylcholine, le glutamate, l'orexine, le VIP, l'adénosine, la sérotonine, la norépinéphrine, le GABA, la substance P, la mélatonine, la somatostatine et de l'histamine, chacun à une concentration de 3 fois de 50, 1000 et 3000 nM sont chargés dans la plaque de médicament à 96 puits.
3. Réglez les paramètres du lecteur de plaque fluorométrique pour mesurer FRET et effectuer des transferts de solution comme décrit dans les étapes 4.1.3-4.1.5.
4. Pour l'analyse de la courbe de pleine dose-réponse, calculer le ratio pic de FRET (AR / R) (étape 4.1.6), tracé en fonction de la concentration d'agoniste du journal et correspondre à l'équation de Hill (étape 11.4). Déterminer la CE _50, coefficient de Hill, et le ratio maximal de FRET. Pour les 12 autres neurotransmetteurs / modulateurs, terrain de pointe AR / R en fonction of concentration du médicament.
5. Choisissez clones ~ 10 CNiFER qui ont un grand ratio de FRET, un CE approprié ₅₀ pour l'agoniste apparenté, et peu ou pas de réponses de fond à d' autres agonistes de neurotransmetteurs (réponse non spécifique).

Clones CNiFER 8. Gel-back sélectionnés

1. Utilisez un confluentes T75 flacon d'un clone CNiFER individuel ~ 90%. Récolte des cellules telles que décrites (étapes 2.3-2.5, tableau 2). Pour la congélation de cellules, remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de croissance HEK293. Etiqueter dix 1,5 ml cryotubes et mis sur la glace.
2. Pour la cryoconservation, les cellules mélange 1: 1 avec 20% (v / v) de DMSO dans le milieu de croissance HEK293, par exemple, 5 ml de 20% (v / v) de DMSO / support est doucement mélangé avec 5 ml de suspension cellulaire (définitif concentration de DMSO est de 10%).
3. Aliquote de 1 ml dans chacune des cryotubes. Congeler tubes avec des cellules dans un -80 ° C congélateur O / N, dans une boîte à isolation de mousse (voir Matériaux). Transfert CryoTubes à LIQUid azote pour le stockage à long terme.

9. CNiFER Implantation dans Souris Cortex

1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave avant la chirurgie. Préparer un champ de semi-stérile pour la chirurgie en essuyant avec 70% d'éthanol et fixant une couche de laboratoire propre.
2. Préparer la pipette d'injection CNiFER en tirant sur un tube capillaire en verre (id de 0,53 mm) sur une électrode de traction verticale. Utilisez une paire de pas. 5 pince à pointe fine pour briser la pointe de l'électrode à un diamètre de ~ 40 um.
   Note: Ceci est mieux accompli sous un microscope à zoom stéréo avec un réticule.
3. Anesthésier un adulte (60-90 jours après la naissance) souris C57BL / 6 avec de l'isoflurane: 4% (v / v) pour l'induction et de 1,5 à 2,0% (v / v) pour l'entretien. Utilisez la queue ou pincement de l'orteil pour vous assurer que la souris est complètement anesthésié.
   Remarque: Re-pincement et évaluer périodiquement whisker secousses pendant toute la chirurgie pour réévaluer la profondeur de l'anesthésie.
4. Couvrir les yeux avec pommade ophtalmique à pséchage revent. Monter la souris dans un cadre stéréotaxique avec des barres d'oreille. Maintenir la température du corps de la souris à 37 ° C en utilisant un tampon de chaleur régulée par une sonde rectale.
5. Rasez une superficie d'environ 5 mm par 12 mm avec un rasoir électrique des animaux. Appliquer la Bétadine suivie par 70% (v / v) d'isopropanol. Utilisez une lame de scalpel pour couper et enlever la peau sur la surface du crâne. Utiliser une lame de scalpel pour enlever le périoste de la surface du crâne. Exposer et de nettoyer la surface du crâne, comme décrit pour la chirurgie stéréotaxique ^11.
6. Abaisser un verre vide à la pipette bregma et enregistrer le antéro-postérieur (A / P) et médio-latérale (M / L) coordonne. En se référant à l'atlas de cerveau de souris, calculer la position du point d'injection. Déplacer la pipette vers le site cible et marquer le crâne pour la formation de fenêtre subséquente. Voir Cetin et al. Pour plus de détails sur les injections stéréotaxiques avec les rongeurs ^11.
   Note: Le site d'injection et dépendent de la fenêtre du siègeion à étudier et la répartition des neurotransmetteurs ou de peptides libérant des projections dans le cortex. Par exemple, dans une publication récente ^7, l'stéréotaxique coordonne à +2.0 mm +1.0 A / P et de 1,0 à 2,0 mm M / L ont été utilisées pour injecter des cellules CNiFER dans le cortex frontal pour l' imagerie in vivo de la libération de dopamine pendant le conditionnement classique .
7. Former un 2 mm x 3 mm fenêtre crâne amincie comme décrit précédemment ^12,13.
   Remarque: L'os dans la fenêtre devrait être 15-20 um d'épaisseur. Les petites taches blanches dans l'os ne doivent pas être visibles lorsque la surface du crâne est humidifié, si l'os est suffisamment amincie ^12,13.
8. Placer une éponge imbibée ACSF sur la fenêtre pour le garder humide pendant la préparation de cellules à injecter.
9. Récolter le clone CNiFER qui a été cultivée dans un flacon T75 à ~ 80% de confluence. Aspirer les médias et laver les cellules avec du PBS stérile.
   Note: La trypsine est omise pour ces étapes.
10. Retirer du PBS et utiliser 10 ml of ACSF pour déloger les cellules du fond du flacon. Broyez les cellules à se dissocient amas de cellules. Centrifugeuse et resuspendre le culot dans 100 ul de ACSF. Centrifuger pendant 30 secondes à 1400 xg et retirer le surnageant, en laissant une pastille recouverte de ACSF. Cette étape laisse un amas de cellules en suspension.
11. Remblayer la pipette d'injection préparé à l'étape 9.2 avec de l'huile minérale, de charger la pipette sur un nanoinjector, et de faire avancer le piston pour éjecter une petite perle d'huile. Mettre 5 ul de CNiFER suspension cellulaire sur une bande de film de paraffine en plastique près de la préparation de la souris. Dresser soit les CNiFERs ou contrôler les cellules CNiFER dans la pipette tiré.
12. Déplacer la pipette à la cible des coordonnées X et Y, à savoir, A / P et M / L noté à l' étape 9.5. Abaisser la pipette, perçant le crâne amincie, et continuer à ~ 200-400 um en dessous de la surface du crâne, pour déposer les cellules CNiFER en couches 2/3 du cortex.
13. Injecter ~ 4,6 nl de cellules CNiFER sur le site le plus profond avec le nanoinjecteur, le mouvement de la note dans l'interface de l'huile et de la cellule, puis attendre pendant 5 min pour les cellules de se passer. Retirer la pipette ~ 100 um et injecter un autre ~ 4,6 nl de cellules CNiFER, attendez 5 min. Ensuite , retirer la pipette doucement et lentement pour empêcher le reflux des CNiFERs. Répéter l'injection à un ou plusieurs sites adjacents.
14. Étapes injection Répéter 09/08 à 09/12 avec le contrôle des cellules HEK293 (ie, HEK293 / TN-XXL / G _qi5 clone manque GPCR). Séparez le CNiFER et le contrôle des sites d'injection de cellules de ~ 200 um.
15. Après avoir terminé les implantations de cellules, rincer la fenêtre-crâne amincie avec ACSF et attendez que le crâne pour sécher. Appliquer une goutte de colle cyanoacrylate (voir Matériaux) sur la fenêtre et placez rapidement un verre de couverture stérile prédécoupée sur le dessus de la colle. Poussez doucement le verre de protection contre le crâne pendant quelques secondes. Laisser sécher la colle pendant 2 min ^12,13.
16. Sceller les bords du verre de couverture avec du ciment dentaire et forme awell autour de la fenêtre pour retenir l'eau pour l'objectif d'immersion.
17. Pour immobiliser la tête de la souris lors de l' imagerie, fixez une tête-bar intégré personnalisé avec une petite goutte de colle cyanoacrylate derrière la fenêtre (voir ¹⁴ pour plus de détails sur les dimensions et les matériaux). Laissez la colle sécher complètement puis ajouter du ciment dentaire supplémentaire pour renforcer encore la tête-bar construit sur mesure.
18. Couvrir le reste de la surface du crâne à l'exception de la fenêtre, avec une couche de ciment dentaire. Assurez-vous que les bords de la peau sont couverts par le ciment et le laisser sécher pendant 20 min.
19. Après la chirurgie, arrêter l'administration de l'isoflurane et de laisser la souris sur un coussin chauffant dans une cage jusqu'à ce qu'il récupère complètement de l'anesthésie. Injecter 5% (p / v) de glucose dans une solution saline (sc) pour la réhydratation et de 0,05 à 0,1 mg / kg de buprénorphine (ip, libération instantanée) pour l'analgésie post-opératoire.
    Remarque: Pour minimiser la réaction immunologique potentielle aux CNiFERs humains, injecter la souris par jour avec 20 pl / 100 g cyclosporine (ip) à partir du jour avant l'injection de CNiFERs.
20. Retour de la souris dans sa cage à la maison pour la nourriture et l'eau.

10. imagerie in vivo de CNiFER Clones

Remarque: l'imagerie en direct est réalisée avec des souris en utilisant un microscope à deux photons et un appareil de tête fixe. Aucune anesthésie est nécessaire pendant les séances d'imagerie. Lorsque l'imagerie des animaux à l'état éveillé, limiter l'appuie-tête à seulement quelques heures à la fois pour réduire les niveaux de stress. Retour à l'animal de la maison cage entre les séances d'imagerie pour la nourriture et l'eau. le stress potentiel est réduit au minimum en assombrissant les lumières de la pièce et entourant une partie de la souris dans une enceinte.

1. Le jour après la chirurgie, monter la souris sur une plate-forme d'imagerie par vissage de la tête-barre métallique implantée sur le crâne à la trame de tête de fixation.
   Remarque: Lors de l'imagerie souris éveillés, la session d'imagerie ne doit pas dépasser quelques heures en raison du stress potentiel induit par le dispositif appuie-tête.
2. Placez la plate-forme d'imagerie avec la souris de tête retenu dans une imagerie microscope à deux photons équipé d'un 10X (0,30 NA) et 40X (0,80 NA) objectifs d'immersion de l'eau.
3. Insérer le cube de filtre pour l'imagerie FRET (ECFP et Citrine) qui comporte un miroir dichroïque à 505 nm et passe-bande des filtres qui enjambent 460 nm à 500 nm pour la mesure et ECFP 520 nm à 560 nm pour la mesure de citrine.
4. Ajouter ACSF à la fenêtre du crâne amincie puits contenant et abaisser l'objectif d'immersion dans l'eau dans le ACSF. Utiliser l'oculaire en association avec une lampe au mercure et un filtre GFP cube pour localiser la surface du cortex et le système vasculaire au-dessous de la fenêtre.
   Remarque: Le motif de la vascularisation aide à localiser et à l'image de la même région au cours des jours répétées de l'imagerie. Basculer vers l'objectif d'immersion dans l'eau 40X pour localiser CNiFERs en se concentrant manuellement sur la surface du cortex au cours des cellules en utilisant le GFP filtre cube et une lampe à mercure.
5. Mettre en place pour l'imagerie à deux photons. Sélectionnez l'apchemin de lumière appro- pour l'imagerie à deux photons. Pour un système commercial typique, utiliser le logiciel pour passer en mode d'imagerie à deux photons et rediriger la lumière vers les tubes photomultiplicateurs (PMT) dans les détecteurs non-descanned. Allumez le laser à impulsions femtoseconde dans le proche infrarouge, sélectionnez une longueur d'onde de 820 nm et un réglage de puissance de 5-15%. Note: 5% de la puissance fournit typiquement ~ 25 mW à l'échantillon.
6. Régler la tension PMT1 & PMT2 proche de la valeur maximale, typiquement 700-1000 V en fonction de la PMT. Réglez le gain à 1 pour chaque canal et zéro la position z pour l'objectif.
7. Abaisser l'objectif ~ 100 à 200 um de la surface corticale et commencer le balayage xy. Régler la puissance du laser, le gain et la tension de PMT pour chaque canal, soit ECFP et citrine, afin d' optimiser le rapport signal-bruit de la fluorescence CNiFER.
8. Utilisez la fonction de zoom dans le logiciel pour restreindre l'image à une région qui contient les cellules CNiFER ainsi qu'un background région. Utilisez une vitesse de balayage pas plus lent que d'une image toutes les 2 secondes (0,5 Hz) à 4 ms par pixel. Ajuster la ligne moyenne pour rapport approprié signal-bruit, par exemple, Kalman 2 ligne moyenne.
9. Dessinez une région d'intérêt (ROI) autour des cellules CNiFER, entourant environ 3 à 4 cellules par avion. Mettre en place une analyse en temps réel de ROI intensités moyennes. Lancer acquisition pour surveiller CNiFER fluorescence au fil du temps.
10. Recueillir la fluorescence provenant CNiFERs avant et pendant les manipulations expérimentales, par exemple, la stimulation électrique, CHR2 stimulation, un comportement, tel que déterminé par l'utilisateur.
11. Lorsque l'expérience d'imagerie est terminée, retournez la souris à sa cage. Répétez l'imagerie à travers jours, comme vous le souhaitez. Lorsque re-imager les cellules se réfèrent à l'image précédemment acquise à faible grossissement vasculature pour orienter vers le même champ d'imagerie (étape 10.4).
    Note: CNiFERs implantables peuvent être visualisés pendant au moins 7 jours.

11. Analyse des données

Ouvrir le fichier d'image et sélectionnez ROI pour CNiFERs et un retour sur investissement pour le fond. Sélectionnez 'analyse des séries »pour les deux canaux de chaque ROI. Export intensité de fluorescence moyenne pour chaque ROI comme un fichier délimité par des tabulations.

Utilisez un logiciel mathématique (voir Matériaux) de programme pour analyser les valeurs de fluorescence. filtre passe-bas (0,3 Hz) chaque signal, puis soustraire la fluorescence de fond dans chaque ROI de ECFP et Citrine intensités de fluorescence.

Calculer la fluorescence moyenne de référence et de calculer des rapports tels que décrits dans l'équation 1 pour mesurer le rapport de FRET AR (t) / R.

Pour déterminer la sensibilité de CNiFERs, tracer le ratio FRET en fonction de la concentration log agoniste. Monter avec l'équation de Hill pour déterminer la CE ₅₀ et Hill coefficient (n), en utilisant un logiciel statistique scientifique et la Colline Equation (Equation 2).

Résultats

Un CNiFER est dérivé d'un rein embryonnaire (HEK293) cellule humaine qui est modifiée pour exprimer de façon stable au moins deux protéines: une protéine G spécifique des récepteurs couplés (GPCR) et une [Ca2 ^+] capteur codé génétiquement, TN-TTG. TN-XXL subit un transfert de résonance de fluorescence d'énergie (FRET) entre cyan et jaune fluorescent protéines, ECFP et Citrine, respectivement, en réponse à des ions Ca ^{2+ 6,15.} L' activation de GPCR endogèn...

Discussion

La création de CNiFERs offre une stratégie innovante et unique pour mesurer optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. CNiFERs sont parfaitement adaptés pour la mesure de libération extrasynaptique, à savoir, le volume de conduction, pour les neurotransmetteurs. Surtout, chacun CNiFER possède les propriétés du RCPG natif, fournissant une mesure optique physiologique des changements dans les niveaux de neurotransmetteurs dans le cerveau. À ce jour, CNiFERs ont été créés pou...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro  ;	System Biosciences	CD510B-1	Clonage : pour la génération de lentivirus
12 x 75 *BD Falcon Tube à essai à fond rond en polypropylène haute clarté	BD Biosciences 352063		FACS
BD 40 um Falcon strainers	BD Biosciences	352340	FACS
0,05 % Trypsine EDTA  ;	Invitrogen	25200056	FACS
96 Plaque à puits, fond plat, transparent  ;	Corning  ;	3596	FACS
Plaques de culture cellulaire 96 puits  ;	Corning  ;	CLS3997	Flexstation
Optilux fond noir transparent  ;	Corning  ;	3603	Flexstation Pointes
de pipette Flexstation	Dispositifs moléculaires	9000-0911	Flexstation
Chlorure d’acétylcholine  ;   ;	Sigma-Aldrich	A2661	Flexstation
Norepinephrine  ;   ;	Chlorhydrate de dopamine Sigma-Aldrich	A7256	Flexstation
;   ;	Sigma-Aldrich	PHR1090	Flexstation
GABA  ;   ;	Sigma-Aldrich	A2129	Flexstation
Histamine  ;   ;	Sigma-Aldrich	H7125	Flexstation
Glutamate  ;   ;	Sigma-Aldrich	49621	Flexstation
Épinéphrine  ;   ;	Sigma-Aldrich	E4642	Flexstation
Somatostatine  ;   ;   ;	Sigma-Aldrich	S1763	Flexstation
5HT  ;   ;   ;	Sigma-Aldrich	H9523	Flexstation
VIP  ;	Alpha Diagnostics Inc.  ;   ;   ;	SP-69627	Flexstation
Orexin A	Alpha Diagnostics Inc.  ;   ;   ;	12-P-01	Flexstation
Substance   ;	Sigma-Aldrich	S6883	Flexstation
Adénosine	Sigma-Aldrich	A4036	Flexstation
Mélatonine  ;	Sigma-Aldrich	M5250C	Flexstation
Lecteur de plaques de fluorescence & logiciel	Dispositifs moléculaires	Flexstation 3	Flexstation
; DMEM (hyperglycémie) avec Glutamax  ;   ;	Life Technologies	10569-010	Culture tissulaire
Sérum fœtal bovin	Life Technologies	10082-139	Culture tissulaire
; Stylo/Streptocoque  ; antibiotiques	Life Technologies	15140-122	Culture tissulaire
; Puromycine  ;   ;	InvivoGen	ant-pr-1	Culture tissulaire
; Fibronectine  ;	Sigma-Aldrich	F0895	Culture
tissulaire CoolCell LX Boîte de congélation cellulaire sans alcool à débit contrôlé	Bioexpress	D-3508)	Culture tissulaire
colle cyanoacrylate  ;	Loctite	Loctite n° 495	chirurgie et injection stéréotaxique
film de paraffine plastique.	VWR	Parafilm® ;	chirurgie et injection stéréotaxique
Nanoinjecteur	Drummond	3-000-204	chirurgie et injection stéréotaxique
Électrodes en verre	Drummond	3-000-203G	chirurgie et injection stéréotaxique
Foret à main	OSADA	Exl-M40	Chirurgie et injection stéréotaxique
Meules pour foret	Fine Scientific	19007-05 ; 19007-07)	chirurgie et injection
stéréotaxiqueBain de stérilisation	FST	18000-45, Stérilisateur à billes chaudes	pour la chirurgie et l’injection stéréotaxique
Chambre/masque isoflurane	Highland Medical Equipment	564-0427, HME 109 Machine d’anesthésie de table avec vaporisateur d’isoflurane, débitmètre O2, vanne gang ; 564-0852, Chambre d’induction 16X7X7.5cm	chirurgie et injection stéréotaxique
3D scope avec bras	Chirurgie Zeiss		et injection stéréotaxique
chirurgie de la lumière			et injection stéréotaxique
Bétadine  ;			chirurgie et injection stéréotaxique
70 % (v/v) alcool isopropylique			chirurgie et injection stéréotaxique
Povidone-Iodine Prep Pads	dynarex	1108	chirurgie et injection stéréotaxique
NaCl 0,9 % (injection, USP, 918610)			chirurgie et injection stéréotaxique
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)			chirurgie et injection stéréotaxique
Buprenex (injection) buprénorphine (0,03 &mu ; g par g rongeur)	Chirurgie Sigma-Aldrich		et injection stéréotaxique
Pommade ophtalmique  ;	Akorn	NDC 17478-235-35	chirurgie et injection stéréotaxique
Surgifoam	Chirurgie Ethicon		et injection stéréotaxique
Grip ciment dentaire	Dentsply	#675571,	chirurgie 675572 et injection stéréotaxique
Instant SuperGlue  ;	NDindustries		chirurgie et injection stéréotaxique
LOCTITE 4041			chirurgie et injection stéréotaxique
METABOND	C& B		chirurgie et injection stéréotaxique
n° 0 verre de couverture Chirurgie	Fisher		et injection stéréotaxique
cadre stéréotaxique  ;	Kopf		et injection stéréotaxique
Sonde rectale et coussin chauffant	FHC	40-90-8D, Régulateur de température DC, 40-90-2-06, Coussin chauffant 6,5X9,5cm40-90-5D-02, Sonde à thermistance rectale	chirurgie et injection stéréotaxique
Plaque d’essai optique pour l’imagerie	Chirurgie Thorlabs		et injection stéréotaxique
Huile minérale	Fisher	S55667	chirurgie et injection stéréotaxique
Kwik-Cast (élastomère de silicone)	World Precision Instruments		chirurgie et injection stéréotaxique
Suture  ;   ;	Ethicon	18' ', 1667, 4-0	chirurgie et injection stéréotaxique
Ciseaux	Outils scientifiques fins	91500-09, 15018-10	chirurgie et injection stéréotaxique
Forcepts	Outils scientifiques fins	11252-30 ; #55, 11295-51 ; Grafe, 11050-10	chirurgie et injection stéréotaxique
Student Halsted-Mosquito Hemostats	Fine Scientific Tools	91308-12	chirurgie et injection stéréotaxique
Kit de cautérisation des petits vaisseaux	Outils scientifiques fins	18000-00	chirurgie et injection stéréotaxique
Stérilisateurs à billes chaudes	Outils scientifiques fins	18000-45	chirurgie et injection
stéréotaxiqueBoîtier d’instrument avec tapis en silicone	Outils scientifiques fins	20311-21	et injection stéréotaxique
Récipients de stérilisation en plastique avec tapis en silicone	Outils scientifiques fins	20810-01	chirurgie et injection stéréotaxique
Lunette de fluorescence à platification fixe 2P pour l’imagerie in vivo	Olympus	FV1200 MPE	Imagerie in vivo
Laser	multiphotonSpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	Imagerie in vivo
Green Laser	Olympus	473 nm Laser	Imagerie in vivo
xy base translationnelle	Scientifica	MMBP	Imagerie in vivo
Cube de filtre FRET pour YFP et CFP	Olympus		Imagerie in vivo
Objectifs d’immersion dans l’eau 10x et 40x	Olympus		Imagerie in vivo
table d’air	Imagerie in vivo	Newport
cage étanche à la lumière construite sur mesure	Imagerie in vivo	Thorlab