Introduction
ダブルエマルションは、それらの工業的、医薬における潜在的な用途、及び生物学的用途1中間、非混和性流体層によりキャリア相から分離した小滴からなり、特に重要です。いくつかの例では、ダブルエマルションのコア内の高価値な化合物をカプセル化する能力は、材料を保護し、制御された様式で放出されることを可能にします。例えば、薬物は、外部のキャリア流体2には適していない溶解性条件下でカプセル化することができます。また、中間油層は、薬物、化粧品、および栄養3のカプセル化及び送達のためのカプセルのテンプレートとして使用することができます。これらは、サブナノリットル実験の膨大な数を行うことができるため、生物学において、ダブルエマルションは、その後、検出され、（FACS）装置4,5を蛍光活性化細胞選別を用いて選別、ハイスループットスクリーニングにも有用です。
ENT ">所望の性能特性を有するダブルエマルションの設計は二重エマルジョンサイズ、組成、及び均一性の精密な制御を必要とする。そのような膜乳化などのバルク、乳化プロセスは、業界で使用されているが、得られたエマルジョンは非常に多分散であり、展示機能特性1の多種多様。液滴マイクロフルイディクスのフィールドは自然に慎重に制御組成物6を単分散エマルションの生成を適しています。マイクロ流体ダブルエマルションの生成は、次の2つの主要な戦略、シーケンシャルドロップ作り、ガラス毛細管流動焦点を実現しています。ダブルエマルションことができます処理を行う二段階のドロップを使用して平坦なPDMSデバイスで生成される。第一に、水性の油エマルジョンは、疎水性チャンネル壁と装置の油中水型のドロップ作る領域を用いて作成される。次に、エマルジョンであることができます流しや水の中に油に適した親水性の壁とドロップ作る領域に再注入ドロップすること4。しかし、PMDSの親水性表面処理は、付加的な製造工程を必要とし、多くの場合、一時的な7です。ダブルエマルションを形成するほとんどの制御可能かつ再現方法は、同軸流が集束することによる、技術は、三相を含む同心ジェットは単分散液滴8を生成するために 、小さなオリフィスを通して剪断されるガラスキャピラリーマイクロフルイディクスを使用して開拓しました。この技術は、各相の流量の関数であるダブルエマルションの正確なサイズおよび組成で、チャネルの寸法よりもはるかに小さい液滴の生成を可能にします。滴とチャネルサイズおよび保護外側シースフローとの間の大きな違いは、不必要な表面処理をレンダリングする、チャネル壁に接触する液滴を防ぎます。しかし、そのようなガラスデバイスは、慎重な組立とシールと一緒に、テーパーキャピラリ先端のカスタム製造を必要とします。前の研究者は、3Dソフトリソグラフィを使用していましたグラフィーは、物理学を中心に流れを使用してダブルエマルションを生成するが、これらのデバイスは、直径> 150μmの9,10、通常、FACSでソートしたオブジェクトよりも大きい大きさの約順序でエマルジ ョンを生成しました。魅力的な代替手段は、PDMSソフトリソグラフィの製造の容易さとピントガラスキャピラリー同軸流れの堅牢な機能と小滴の生成を含むことになります。本稿では、50ミクロンエマルジ ョン≤生成するために焦点を当て同軸フローを使用し、完全に3Dソフトリソグラフィー11を用いて構成されている二重エマルジ ョンジェネレータについて説明します。我々のデバイスは、引っ張らガラスキャピラリーノズルにおけるエマルションの形成過程を近似するために小さなせん断流路（ 図1）を含むデバイスを製造するためにクラムシェル方式を使用します。さらに重要なことは、これらのデバイスは、特定の表面処理を必要とせず、すべてのポリマー構造が簡単で再現可能な製造を提供するSC重複した多数のデバイスにalable。ここでは、二重エマルジョン発電機の設計、製造、テストの概要を説明します。ダブルエマルションの生成は14ミクロンの液滴直径まで、堅牢かつ再現性であることが示されています。製造の容易さと機能性の結合は、このデバイスの新しい二重エマルジョンアプリケーションの開発のための魅力的なオプションになります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SU8マスター製作
- AutoCADのソフトウェアを使用して2つの層の製造のためのマイクロ流体構造を設計し、10μmの分解能で回路基板フィルム上に、ベンダーによって印刷されたデザインを持っています。デバイスの設計の詳細は、添付の参考文献11に記載されているチャネルの形状は、 図1に示されている。層は、各加工層12の機能を連結するために役立つ位置合わせマークを含むべきです。
- スピンコーターに予め清浄3インチ径のシリコンウエハを置き、チャックに固定する真空をオンにします。 50μmの層厚を提供し、2000rpmで、30秒間、500rpmで20秒間ウェハと回転の中心にSU8-3035を1ml適用します。
- ウェハを取り外し、30分間135℃のホットプレート上で焼きます。ウエハは次のステップに移動する前に室温に冷却してください。
- 第 1 層マスク（ 図2Aに塗布されたウェハを公開
- スピンコーターにウェハを置き、チャックに固定する真空をオンにします。 135ミクロンの厚さの追加を提供する層で、その結果、1,375 rpmで、30秒、500 rpmで20秒間ウェハとスピンの中心にSU8-2050の1ミリリットルを適用します。
- 次のステップに移動する前に、室温まで冷却後、ウエハを取り出して、30分間135℃のホットプレート上で焼きます。
- 1.3にパターニングジオメトリ上に第 2 層マスク（ 図2B）を合わせ、3分間のLED NMコリメート190ミリワット、365に塗布されたウェハを公開します。暴露した後、1分間135℃のホットプレート上の場所は、次のステップに進む前に、室温まで冷却。
- 30分間のプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートの撹拌浴中に浸漬することによりマスクを開発します。ウェハを洗浄1分間135℃のホットプレート上でイソプロパノール及びベークインチPDMS成形用の100ミリメートルペトリ皿に開発されたマスターを配置します。
2. PDMSデバイスの製造
- プラスチックカップに硬化剤を5gとシリコーンベースの50グラムを組み合わせることにより1 PDMS：10を準備します。攪拌棒を装着した回転工具で内容を混ぜます。 30分間、デシケータ内部に、または全ての気泡が除去されるまで、混合物を脱気。
- マスターの上に3mmの厚さを与え、さらにガス抜きのために戻ってデシケーターに配置するために、PDMSを注ぎます。一旦全ての気泡が除去され、2時間60℃でデバイスを焼きます。
- パターン化された面を上にして清浄な表面上のメスと場所を使用して金型からデバイスをカットします。マスター2（ 図3a）からマスター1を分離するためにかみそりの刃で半分にPDMSモールドをカットします。マスター1によって刻印さ50μmの流体ハンドリングジオメトリを含む片に、0.7との流体入口および出口をパンチ5ミリメートルの生検パンチ。
- プラズマは、300Wのプラズマクリーナーで60秒間、1ミリバールのO 2プラズマでデバイスを扱います。一時的にPDMS-PDMS結合を遅らせると、潤滑剤として機能するDI水の滴でPDMSの非パンチ片の表面を濡らし。マスター2面にステレオ顕微鏡、場所のマスター1を介して表示し、機械的なロックが達成されるまで、比較的表面をスライドさせながら時凹んフレームと図3Aメイトで突出フレーム。
- 60℃のオーブン内で装置を配置し、水で完全な結合を蒸発させ、60℃で2日間組み立てられた装置（ 図3B）を焼きます。
試薬の調製
- 内相のための蒸留水で1mlシリンジを埋めます。
- 1重量％とHFE 7500フッ素系オイルで1 mlシリンジを埋めます。中間相のための生体適合性界面活性剤％の界面活性剤13。
- 10重量％で10 mlシリンジを埋めます。 ％polyethylen1重量％を含有する水溶液で電子グリコール（PEG）。 ％のTween 20および1重量連続相の％ドデシル硫酸ナトリウム。
4.システムの準備
- <100μ秒のシャッター速度が可能、デジタルカメラと接続された倒立顕微鏡のステージ上にマイクロ流体チップを置きます。
- シリンジポンプのすべての注射器を取り付け、27 Gの針を取り付けます。針の上に、PE-2チューブの約30センチの長さを接続し、適切に緩い端を挿入し、デバイスに穴をパンチ。
- デバイスの出口ポートにPE-2の10cmの長さを挿入し、廃棄物収集容器内のもう一方の端を置きます。
- プライム管セグメント内の流体が装置の入口ポートに到達するまでの速度率の高さ（2000μL/分）でシリンジポンプを実行して、デバイス。
5.エマルジョンの生成
- 50ミクロン×50ミクロンのオリフィスを含んでおり、地域に顕微鏡をフォーカス下流の出口チャネル。
- 連続相250μL/内部相のための時間、100μL/中間相のための時間、および700μL/ hrの流量で二重エマルジョン発生器に流体を提供し、平衡化のために10分を待つためにシリンジポンプを設定します。
- それぞれ、250μL/ hrであり、100μL/時間で、内側と中間相の流量を維持します。 1,050μL/ hrで外側相の流量を設定します。流れ条件のセットの下で安定させるためのダブルエマルションの生成のための3-5分待ってください。
- 手動画像分析によるオフライン処理のために30 Hzでビデオ画像の5秒を取得します。
- 表1に示す流量の5.3および5.4を繰り返す。内側及び中間相の流量が一定に保持され、搬送波位相流量は、シリンジポンプの設定を調整することによって変化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ダブルエマルションの生成器は、3D PDMSの製造（ 図1A）を使用して作成したデバイスの焦点を合わせる同軸流から成ります。ジオメトリは、三相の同軸噴流の形成は、水/油/水ダブルエマルション（ 図1B、 図1C）の形成を可能にする、正方形、×50ミクロンのオリフィス50ミクロンに剪断することが可能になります。内水相及び中間油相は、10ミクロン×50ミクロン（ 図1D、ポイント「1」）のチャネル寸法を有する接合部で一緒にされます。突然の拡張チャネルの拡大に達するまでによりPDMSの疎水性のため、フッ素系オイルの抱擁チャネル壁と流体のようなチャネルの中央に内相の滞在は、連続ジェットで移動（ 図1D、ポイント"2" ）。この位置で、内側の2つのフェーズが320μmで背の高いJU ...の中心部に注入され、水性担体相の比較的同心導入を可能化。 3つのフェーズが50ミクロン×50ミクロンのオリフィスを余儀なくされている（ 図1D、点「3」）、これにより、キャリア位相鋏の高流速均一液滴からに分解する長く、細い巻きひげに内側の2つのフェーズ（ 図1E）。
3D PDMSの製造は、2層リソグラフィマスターに成形後クラムシェル構成の2つのユニークなPDMSの型の結合を必要とします。 50μmの背の高い層は、マスタと対向に相補的突出して凹部フレームと共に、マスター1（ 図2A）上の剪断オリフィスと共に、内側及び中間の流体処理チャンネルを形成するために使用されます。付加的な135ミクロントール層は、キャリア流体と出口チャネル（ 図2B）を作成するために使用されます。二重エマルジョン発電機の組み立てはTを利用彼は、凹状及びプラズマ処理（ 図3B）の後に幾何学的な位置合わせのためのフレーム（ 図3A）が突出します。
ダブルエマルションデバイスは、単分散ダブルエマルションを様々なサイズの形成を実証するために、フローの様々な条件で試験しました。これらの実験のために、内側及び中間相の流量を一定に保持し、キャリア相の流速は、液滴生成中に剪断力に影響を与えるように変更されました。実験条件は、内側の2つの相の合計のキャリア位相の流れ（Q cの）の比率によってパラメータ化され（Q 和）を流れます。 3から57に、Q C / Qの合計で行われた実験のための液滴の生成のイメージ図4に示されている。内側の2つの相を含む細長い領域が対流している液滴に50ミクロン×50ミクロンのオリフィスと休憩中に突出することが観察されました下流。私（Q C / Q 和を増大させる ）搬送波位相の流れをncreasingは、より小さな液滴を生成次第に細く領域に剪断され、内側の相をもたらします。異なる流量でデバイスによって生成ダブルエマルションは、5.2％の変動の平均直径係数を示します。 Q C / Qの和の値を選択する液滴直径のヒストグラムは、（ 図5）が生成される液滴の大きさの相対的な均一性を示しています。デバイスが著しく小さいオリフィス幅をダブルエマルションを形成する能力を実証し、増加のQ C / Qの合計 （ 図6）との明確な減少傾向を示しています。試験した最も高い搬送波位相流量で、14ミクロンダブルエマルションは50ミクロン×50ミクロンのオリフィスを用いて形成しました。
doublの図1.幾何学Eエマルジ ョンジェネレータ。作製装置の（A）三次元モデル。 （B）の内側（灰色）の導入を示す中央通路の縦断面、中間（赤）、およびキャリア（青）の段階。 （C）断面が正方形の穴に入る内側の2つの相を含むジェットを示します。 （D）デバイス中のエマルション生成の上面図。ジャンクションで（1）疎水性中間相の注入を被覆するために、チャネル壁を、それを引き起こす、親水性PDMSによって支援されます。ジャンクションで（2）チャネルが展開され、内側の2つの相のジェットは物理的な原因滴形成点までの連続流体の流れの高い速度によって（3）オリフィスに剪断されます。 （E）デバイス内の二重エマルジ ョン世代の顕微鏡画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</ P>
マスターの2リソグラフィ生産図 。 （A）50ミクロンフィーチャーの製造のために使用されるマスク。マスタ1には、流体の入口、中央/内相接合、エマルジョン生成オリフィス、および位置合わせのための凹状溝を成形するために使用されます。マスター2は、位置合わせのために使用される隆起部を含んでいます。 （B）135ミクロンフィーチャーの製造のために使用されるマスク。マスターは、キャリア流体の配線チャネルと出口チャネルを含んで鏡像である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PDMSデバイスの図3のアセンブリ 。 （
異なる流量で発生したダブルエマルションの4イメージ図 。外側相の流量は、各画像の左側に与えられるQ C / Q 和を変更するために変更されます。増加Q C / Qの合計はますます小滴を作成、オリフィスを通ってせん断されている内側の流体のジェットを狭める。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ダブルエマルション液滴の図5ヒストグラムは異なる流量でサイズ 。流れ条件の所定の組で生成したエマルジ ョン液滴の直径の変動の平均係数は5.2％である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
正規化された流量パラメータ対図6.液滴径 。連続相の流量を調整すると、オリフィス径の30％〜100％であり、二重エマルジ ョンを製造することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
実験に使用し、表1流量パラメータ 。内部相と中間相の流速（Q、I、Q mは）一定の組み合わせの流量（Q 和）を与え、一定に保持されます。搬送波位相流量（QC）は、異なる直径を有する二重エマルジョンを生成するために変更されます。比Q C / Qの合計は、実験条件を記述したメインの無次元パラメータです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明する二重エマルジ ョン生成ジオメトリはガラスキャピラリー装置8の物理学を模倣するように設計されています。これらでは、位置合わせ円筒形ガラスキャピラリーは、均一な二重エマルジョン液滴に剪断された3相の同軸噴流を生成するために使用されます。当社の3D PDMSデバイスの機能は、全体の高さは320ミクロンであり、キャリア位相チャンネルと50μmの背の高い加工で形成された小さな特徴の中心位置合わせに依存しています。マスクが正確に整列されていない場合は50μmの背の高いジオメトリに対して、ステップ1.7で2 番目のレイヤーマスクによりパターニング背の高い機能を誤整列するための大きな可能性があります。適切な位置合わせは、フォトパターニング時に同じ場所に配置されるマスクに、このような同心円のような位置合わせマークを、設計することによって支援することができます。デバイスの2つのPDMS半分のプラズマボンディングは、最終的なデバイスの重要な位置合わせ不良につながることが第二の方法です。プラズマボンディングPDMSにPDMSのステップ2.4において、我々は接着を遅延し、 図3（a）に示す位置合わせフレームがロックさせることができるように、操作を可能にするために脱イオン水を用いてデバイス表面の濡れを説明するように、一般的に瞬間的です。これは十分な濡れずにしようとすると、PDMSの表面は、適切な位置合わせに入ってくる前に、結合を不可逆性になり、デバイスが廃棄しなければならないと新しいのPDMS金型を作りました。
二重乳化装置を均一に疎水性表面特性へのリードこと製造技術を利用するように設計されています。しかし、プロトコルで説明されているパラメータの外側に操作が必要な流体プロセスのいくつかを理解する必要があります。内側及び中間相（ 図1D、ポイント「1」）の接合部、内側相と中間相の低流量の比較的高い流れは、疎水性中間相は、チャネル壁を被覆して、二相ジェットを作り出します。もし中間相の比例フローは、離散的な水中油滴がオリフィス（ 図1D、点に液滴形成のためのコヒーレント三相ジェットを形成する能力を排除し、発生し始めるの生成を増加させる「3」 ）。チャンネル拡張（ 図1D、点「2」）の後、キャリア相流のかなりの量は、中間相及び疎水性チャネル壁の間の幾何学的分離を作成するために必要とされます。キャリア相流の減少は、最終的に疎水性のデバイスの壁濡れ中間相につながります。キャリア相流の大幅な削減は、それによって根本的に二重エマルジョン液滴形成の物理学を変更すること、長く、細いフィラメントにインナーフェーズをせん断するのに不十分であるフロー条件を作成することができます。
構築されると、この装置は、商用FACS選別を用いて、50ミクロン、便利な大きさに14からダブルエマルションを生成するように設計されています楽器。このサイズ範囲外ダブルエマルションが所望される場合は、オリフィスの寸法は、ここで使用される50ミクロン×50ミクロンのサイズのスケーリングされる必要があります。デバイスが一様に疎水性表面特性を有する水/油/水ダブルエマルションを生成するように設計されているため、デバイスが一様に親水性にするために適用される表面処理があった場合を除き、油/水/油ダブルエマルションを作成することができません。
この作品は、水/油/水ダブルエマルションの頑強な形成が可能PDMSデバイスを製造するために簡単に示します。以前の研究者が3Dリソグラフィ14,15を使用して作成されたデバイスでのダブルエマルションの形成を報告しているが、それらのデバイス内に形成されたダブルエマルションは、ミクロンの100Sで測定した直径を持っていました。ここで報告されたデバイスは、哺乳動物細胞に類似し、FAによるソートに非常に適したボリュームを提供し、ダブルエマルションをこれより小さい大きさの程度を生産するのに適していますCS。
これらの結果は、ガラス毛管マイクロフルイディクスを用いて達成することができるが、ガラスデバイスを製造することは面倒であり、多くの手をオン必要デバイスあたりの手順。私たちのすべてのPDMSデバイスの場合、製造は主に成形、接着、およびベーキングPDMSスラブ、大量にスケーリングする、シンプルな再現性、および容易なプロセスで構成されます。
集束同軸フローを使用してダブルエマルションを生成するリソグラフィ作製装置の有用性が実証されています。私たちは、簡単な製造と、この二重エマルジョン発電機の設計の堅牢な機能は、科学的および産業用アプリケーションのための適応につながるべきであることを願っています。以前にガラスキャピラリーマイクロ流体で働くために必要な専門的なスキルによって抑止研究者らは、PDMSにソフトリソグラフィー、今一般的な実験技術を使用して、より快適にする必要があります。また、製造することができる小さな液滴サイズはperforに適していM細胞および生物学的アッセイ液滴であり、定量化し、FACSを使用してソートします。産業用途のためには、既にこれらのタイプのデバイスがアレイ内に製造され、単一のデバイスに比べて大きさのオーダーの増加がダブルエマルションの生成速度を可能にする、10並列化できることが示されています。また、チャンネルを中心に大規模な同軸流れの小さなダブルエマルションを形成する能力が介入することなく、長時間のために実行することを目的のデバイスを並列化する際に重要である汚れや目詰まりに抵抗性デバイスを作る必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品はを通じてロジャースファミリー財団、画期的な生物医学研究のためのUCSF /サンドラー財団プログラム、BASF社からの助成金、およびNSFからギャップ賞を埋める、定量的バイオサイエンス（QB3）のためのカリフォルニア工科大学から研究賞によってサポートされていました学部早期キャリア開発（CAREER）プログラム（DBI-1253293）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Biocompatable surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| 35,000 MW PEG | Sigma Aldrich | 1546660 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1369 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 |
References
- Van Der Graaf, S., Schroën, C. G. P. H., Boom, R. M. Preparation of double emulsions by membrane emulsification - A review. J. Membrane Sci. 251 (1-2), 7-15 (2005).
- Laugel, C., Baillet, A. P., Youenang Piemi, M., Marty, J., Ferrier, D. Oil-water-oil multiple emulsions for prolonged delivery of hydrocortisone after topical application: comparison with simple emulsions. Int. J. Pharm. 160 (1), 109-117 (1998).
- Kim, S. H., Kim, J. W., Cho, J. C., Weitz, D. A. Double-emulsion drops with ultra-thin shells for capsule templates. Lab Chip. 11 (18), 3162-3166 (2011).
- Lim, S. W., Abate, A. R. Ultrahigh-throughput sorting of microfluidic drops with flow cytometry. Lab Chip. 13 (23), 4563-4572 (2013).
- Bernath, K., Hai, M., Mastrobattista, E., Griffiths, A. D., Magdassi, S., Tawfik, D. S. In vitro compartmentalization by double emulsions: sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal. Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
- Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S.
- Bauer, W. A. C., Fischlechner, M., Abell, C., Huck, W. T. S. Hydrophilic PDMS microchannels for high-throughput formation of oil-in-water microdroplets and water-in-oil-in-water double emulsions. Lab Chip. 10 (14), 1814-1819 (2010).
- Utada, A. S., Lorenceau, E., Link, D. R., Kaplan, P. D., Stone, H. A., Weitz, D. A. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Chang, F. C., Su, Y. C. Controlled double emulsification utilizing 3D PDMS microchannels. J. Micromech. Microeng. 18 (6), 065018 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
- Tran, T. M., Cater, S., Abate, A. R. Coaxial flow focusing in poly(dimethylsiloxane) microfluidic devices. Biomicrofluidics. 8 (1), 016502 (2014).
- Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
- O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R.
- Chang, F. C., Lin, H. H., Su, Y. C. Controlled W/O/W double emulsification in 3-D PDMS micro-channels. 3rd IEEE Int. Conf. Nano/Micro Eng. Mol. Syst. NEMS, , 792-795 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802 (2012).
