Les protocoles présentés décrivent deux techniques basées sur le dosage immunoenzymatique (ELISA) pour l'étude rapide des interactions ligand-récepteur : Le premier dosage permet la détermination de la constante de dissociation entre le ligand et le récepteur. Le deuxième dosage permet un criblage rapide de peptides bloqueurs pour les interactions ligand-récepteur.
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Article de méthode
Un ELISA à base de liaison et la méthode de la concurrence de déterminer rapidement interactions ligand-récepteur
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une compréhension globale des voies de signalisation nécessite une connaissance détaillée de l'interaction ligand-récepteur. Cet article décrit deux protocoles rapides et fiables point par point d'analyses immunoenzymatiques (ELISA) pour l'étude des interactions ligand-récepteur : l'analyse directe de l'interaction ligand-récepteur (LRA) et l'analyse de la compétition LRA. À titre d'étude de cas, l'analyse par ELISA de l'interaction entre différents interférons lambda (IFNL) et la sous-unité alpha de leur récepteur (IL28RA) est présentée : l'LRA directe est utilisée pour la détermination des constantes de dissociation (valeurs KD) entre le récepteur et les ligands IFN, et l'analyse de la compétition LRA pour la détermination de la capacité inhibitrice d'un oligopeptide, conçu pour entrer en compétition avec les IFNL sur leur site de liaison au récepteur. Les étapes analytiques pour estimer les valeurs KD et la concentration inhibitrice médiane (IC50) sont décrites. Enfin, la discussion met en évidence les avantages et les inconvénients de la méthode présentée et comment les résultats permettent une meilleure compréhension moléculaire des interactions ligand-récepteur.
Introduction
Une compréhension approfondie des voies de signalisation nécessite des connaissances détaillées sur l'interaction ligand-récepteur. La plupart des méthodes d'évaluation de l'interaction d'un ligand particulier avec son récepteur spécifique sont chers, beaucoup de temps, de main - d'œuvre et nécessitent des équipements et de l' expertise 1 spécifique.
Cet article décrit deux protocoles rapides et fiables point par point pour étudier l'interaction ligand-récepteur basé sur une enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): le ligand-récepteur directe interaction dosage (LRA) et la LRA de la concurrence. EL....
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Protocole
1. Préparation des réactifs
- Pour préparer un tampon de revêtement de carbonate, on dissout 0,36 g de Na 2 CO 3 et 0,84 g de NaHCO3 dans 100 ml d'eau distillée; filtre stérile le tampon en utilisant un vide poussé de 0,22 um polyéthersulfone (PES) filtre à membrane et stocker à température ambiante jusqu'à utilisation.
- Préparer une solution de lavage par addition de 0,05% v / v de Tween 20 dans du tampon phosphate salin (PBS).
- Préparer un 5% de sérum albumine bovine (BSA) (solution de blocage) dans une solution de PBS en dissolvant 5 g de BSA (≥98%) dans 100 ml de PBS et conserver à 4 ° C.
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Résultats
Les constantes de dissociation entre INFL1-3 et de leur sous-unité du récepteur alpha IL28RA ont été déterminées par la LRA directe. Les résultats sont présentés sur la figure 3: La fraction des sites de liaison occupés est tracée en fonction du logarithme de la concentration d' IFN respectif. L'intrigue Scatchard des données est affiché dans le coin inférieur droit. Les résultats montrent que la LRA directe donne une courbe de liaison, qui peut encore être analy.......
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Discussion
ELISA est une norme et une méthode bien établie pour de nombreux laboratoires. Nous avons en outre modifié et amélioré une méthode publiée précédemment 5,7. Le protocole montré étape par étape montre comment il peut être utilisé d'une manière simple pour déterminer les valeurs Kd interactions ligand-récepteur. En outre, la CI50 d'un peptide de blocage qui interfère avec l'interaction ligand-récepteur peut être déterminée.
Les principaux avantages sont la con.......
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Déclarations de divulgation
A.E. a été soutenu par des subventions de recherche du programme «SNSF Ambizione Score» (PZ00P3_154709), «Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte» de l'Université de Bâle, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel et Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. remercie le programme iPhD de l'initiative SystemsX.ch en biologie des systèmes (9e appel) pour son soutien.
Remerciements
Nous remercions le Prof. J. Stelling (Département des sciences et ingénierie des biosystèmes, ETH Zurich et Institut suisse de bioinformatique, Bâle, Suisse) pour sa révision critique du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | Plaque ELISA |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | Pour le tampon de revêtement de plaque ELISA |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | Pour le tampon de revêtement de plaque ELISA |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | BSA à 5% dans PBS pour le blocage |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Interleukine-28 humaine recombinante, récepteur alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Interleukine-29 humaine recombinante/Sans vecteur/étiquette His C-terminale |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Interleukine-28A humaine recombinante/Sans vecteur/étiquette His C-terminale |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Interleukine-28B humaine recombinante/Sans vecteur/étiquette His C-terminale |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Anticorps primaire pour capturer les ligands marqués His |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | Solution de substrat TMB - ELISA |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | H2SO4 5 N (solution d'arrêt de réaction enzymatique) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | Lecteur de plaque ELISA |
Références
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al.
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Réimpressions et autorisations
