Abstract
Imagerie de substrats hyperpolarisés par résonance magnétique est très prometteur pour l'évaluation clinique des processus biochimiques critiques en temps réel. En raison des contraintes fondamentales imposées par l'état hyperpolarisé, les techniques d'imagerie et de reconstruction exotiques sont couramment utilisés. Un système pratique pour la caractérisation des méthodes d'imagerie dynamique, multi-spectrales est critique nécessaire. Un tel système doit reproductible récapituler la dynamique chimiques des tissus normaux et pathologiques. Le substrat le plus largement utilisé à ce jour est hyperpolarisé [1- 13 C] -pyruvate pour l' évaluation du métabolisme du cancer. Nous décrivons un système de fantôme à base d'enzyme qui intervient dans la conversion de pyruvate en lactate. La réaction est initiée par l'injection de l'agent hyperpolarisé en plusieurs chambres à l'intérieur du fantôme, dont chacune contient des concentrations de réactifs qui contrôlent la vitesse de réaction variables. Plusieurs compartiments sont nécessaires pour veiller à ce que imaséquences Ging capturer fidèlement l'hétérogénéité spatiale et métabolique des tissus. Ce système facilitera le développement et la validation des stratégies d'imagerie de pointe en fournissant des dynamiques chimiques qui ne sont pas disponibles à partir de fantômes classiques, ainsi que le contrôle et la reproductibilité qui est pas possible in vivo.
Introduction
L'impact clinique de l' imagerie par résonance magnétique hyperpolarisé (IRM) de 13 composés C-étiquetés dépend essentiellement de sa capacité à mesurer les taux de conversion chimique à travers le temps réel résonance magnétique spectroscopie et imagerie spectroscopique 1-5. Au cours du développement de la séquence et de la vérification, la conversion chimique dynamique est généralement réalisée par l' intermédiaire in vivo ou in vitro dans des modèles 6-9 qui offrent un contrôle limité et de reproductibilité. Pour le test robuste et assurance de la qualité, un système plus contrôlé qui préserve la conversion chimique endémique de cette mesure serait préférable. Nous décrivons une méthode pour réaliser cette conversion de façon reproductible en utilisant un fantôme enzymatique unique dynamique.
La plupart des études avec hyperpolarisés 13 agents C se concentrent sur l' imagerie des substrats hyperpolarisés dans un environnement biologique fonctionnement. Ceci est le choix évident si l'objectif est d'étudier biologiqueal traite ou potentiel pour déterminer l'impact sur les soins cliniques. Cependant, si la caractérisation d' un certain algorithme de traitement du système de mesure ou de données est souhaitée, des modèles biologiques présentent de nombreux inconvénients tels que la variabilité spatiale et temporelle inhérente à 10. Cependant, les spectres statiques conventionnels manquent de conversion chimique qui entraîne l'intérêt clinique primaire en IRM de substrats hyperpolarisés et ne peuvent pas être utilisés pour caractériser la détection des taux de conversion ou d' autres paramètres dynamiques 11. L'utilisation d'un système enzymatique unique, nous pouvons fournir une conversion chimique contrôlable et reproductible, ce qui permet un examen rigoureux des stratégies dynamiques d'imagerie.
Ce système est dirigé vers les chercheurs qui développent des stratégies d'imagerie pour les substrats hyperpolarisés et souhaitent caractériser la performance pour la comparaison avec d'autres approches. Si les mesures statiques sont le point final désiré , puis statique 13 métabolite C-labled Phantoms will suffit 11. À l'autre extrémité , si la caractérisation biologique plus complexe est critique pour le procédé (livraison, la densité cellulaire, etc.), des modèles biologiques réels seront nécessaires 12-14. Ce système est idéal pour l'évaluation des stratégies d'imagerie qui visent à fournir une mesure quantitative du taux apparent de conversion chimique.
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Protocol
NOTE: (Phantom Design) Deux 3 ml chambres ont été usinées sur Ultem et munis d'un tube de PEEK (1,5875 mm OD et 0,762 mm ID) pour l'injection et l'échappement. Les chambres ont été placées dans un tube de centrifugeuse de 50 ml remplie d'eau (figure 1). Pour éviter les vides de signaux créés par les bulles, les chambres et les lignes ont été pré remplies avec de l' eau déminéralisée (dH 2 O).
1. Préparation de la solution
- Préparer une solution de tampon L (81,3 mM de Tris pH 7,6, NaCl 203,3 mM). Peser 11,38 g Trizma préréglés cristaux pH 7,6 et 11,88 g de NaCl et dissoudre dans 1 L de dH 2 O.
- Préparer une solution à 50 mM de NADH. Peser 17,8 mg de sel dipotassique de β-nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) réduite et on dissout dans 280 pl de la solution tampon qui a été préparé dans la première étape.
- Préparer 250 solution U / ml Enzyme. Peser 78,75 unités d'activité de lactate déshydrogénase (LDH) et dissoudre dans 315 pi de tampon de sTep un.
- Préparer mélange d'acide pyruvique. Peser 21,4 mg Ox063 radical trityle et dissoudre dans 1,26 g (~ 1 ml) [1- 13 C] de l' acide pyruvique.
- Préparer des milieux de dissolution (40 mM de Tris, pH 7,6, NaOH 40 mM, EDTA 0,27 mM et du NaCl 50). Peser 5,96 g de cristaux Trizma préprogrammées pH 7,6, 1,6 g de NaOH, de l' acide éthylènediaminetétracétique 0,1 g de sel disodique dihydraté (EDTA) et 2,9 g de NaCl et on dissout dans 1 litre dH 2 O.
- Préparer une solution de 1:10 gadotéridol (50 mM). Mélanger 1 pl de gadotéridol dans 9 ul de dH 2 O. Préparation de 8 M [13 C] urée. Peser 1,465 5 [13 C] urée et dissoudre dans 3 ml dH 2 O.
2. Préparation de hyperpolarisé pyruvate
- Dans une coupelle d'échantillon pour un système de polarisation dynamique nucléaire (DNP), une pipette de 0,3 pi de la solution de gadotéridol et 13 mg (~ 10 pi) de la solution d'acide pyruvique.
- Brièvement remuer ce mélange dans la coupelle d'échantillon avec la pointe de la pipette. </ Li>
- Insérez l'échantillon dans le système DNP.
- Veiller à la porte au système DNP est fermé. Commencez le processus d'insertion de l'échantillon en cliquant sur le bouton de l'échantillon d'insertion sur la console système DNP. Dans l'assistant d'échantillon sélectionnez échantillon normal et appuyez sur suivant.
- Garder la coupelle d'échantillon vertical placer délicatement la tige d'insertion sur la partie supérieure de la coupelle d'échantillon. Lorsque vous êtes invité, ouvrez le système DNP et insérer la coupe dans l'insert de température variable (VTI) en utilisant la tige d'insertion.
- Tirer sur le piston à l'extrémité de la tige d'insertion d'un échantillon pour libérer l'échantillon de l'indice de température variable. Retirer la tige d'insertion de l'échantillon à partir du système et cliquez sur le bouton suivant sur la console système DNP.
- Initier la polarisation.
- Cliquez sur le bouton de polarisation de démarrage sur la console système DNP. Dans le RINMR type de logiciel .HYPERSENSENMR pour lancer un logiciel de surveillance de polarisation. Set construire configuration à 1 et appuyez sur Entrée. Cliquez ensuite sur la construction solide up.
- Définissez l'emplacement et le nom du fichier de sauvegarde. Sélectionnez le profil pour 13-C dans la liste onglet sur la console du système de DNP vers le bas et cliquez sur suivant. Cochez la case pour goûter pendant l'accumulation, régler l'heure de l'échantillon à 300 s et cliquez sur Terminer.
- Mesurer 3,85 g (~ 4 ml) des milieux de dissolution soit en volume avec une seringue de 5 ml ou en poids en utilisant une échelle.
3. Préparation de l'enzyme Fantôme
- Remplir un tube à centrifuger avec ~ 3 ml [13 C] une solution d'urée et le placer dans le tube de centrifugation de 50 ml. Remplir le tube de centrifugeuse de 50 ml avec dH 2 O.
- Pré-remplir les deux chambres de l' enzyme et les lignes avec dH 2 O en injectant ~ 3 ml dH 2 O dans les lignes d'injection du fantôme, en prenant soin de vider les bulles formées.
- Placer le fantôme dans le centre de l'aimant avec un accès facile aux lignes d'injection. Assurez-vous qu'il ya un certain conteneur pour attraper le liquide qui va évacuer à t il ligne d'échappement.
- Préparer le mélange d'enzymes de haute activité (mM NADH 17.14, 44.57 U / ml LDH). Mélanger ensemble la solution de NADH 240 ul, solution de LDH 125 ul et 335 ul de tampon et le maintenir dans une seringue de 3 ml qui peut être attaché à la ligne d'injection.
REMARQUE: une fois combinée avec 500 pl de 40 mM de pyruvate à partir du système de DNP, le volume fantôme final de 1,2 ml avec des concentrations mM pyruvate 16,7 mM, du NADH 10 et 26 U / l de LDH dans une solution tamponnée au Tris avec un pH ~ 7.5. - Préparer le mélange activité enzymatique faible (17,14 mM de NADH 26,79 U / ml de LDH) Mélanger 240 solution de NADH ul, solution de LDH 75 ul et 385 ul de tampon et le maintenir dans une seringue de 3 ml séparé qui peut être fixé à la ligne d'injection.
REMARQUE: une fois combinée avec 500 pl de 40 mM de pyruvate à partir du système DNP le volume fantôme final est de 1,2 ml avec des concentrations mM pyruvate 16,7 mM, du NADH 10 et 15.625 U / l de LDH dans une solution tamponnée au Tris avec un pH d'environ 7,5 .
- positionnement initial.
- Chargez une nouvelle analyse de positionnement FLASH en mode de fonctionnement [1 H] mode Volume TX / RX. Modifier mis en place des dimensions à 2: outil de contrôle Spectrometer -> Modifier GS -> Dimensions de configuration -> 2. Appuyez sur GSP sur le contrôle Spectrometer et déplacer fantôme jusqu'à ce que centré sur l'aimant. Appuyez sur STOP puis appuyez GOP sur le contrôle Spectrometer.
- Numériser Pilot.
- Chargez une nouvelle analyse de positionnement de TriPiolt en mode de fonctionnement [1 H] mode Volume TX / RX. Position Slice: Scan Control -> Slice Tool-> déplacer les tranches (maintenez M sur une touche et faites glisser, sélectionnez la tranche de se déplacer avec le paquet tranche curseur).
- Wobble 1 H Coil: Outil Spectromètre de configuration -> Acq -> Wobble. Tune and match 1 H bobine derrière l'aimant et appuyez sur STOP. Tout en maintenant la presse touche Maj du feu de circulation sur la fenêtre de commande de balayage.
- Chargez une nouvelle radiale écho planar imagerie spectroscopique (radEPSI) scan en mode de fonctionnement [13 C] en mode Volume TX / RX. Position Slice: Slice outil sur le contrôle de numérisation et de déplacer les tranches (détiennent M sur une touche et faites glisser, sélectionnez la tranche de se déplacer avec le paquet tranche curseur).
- Wobble 13 C Coil en cliquant sur l' outil de contrôle Spectrometer -> Acq -> Wobble. Réglez le gain du récepteur pour 1000-2000 sur le Spectrometer.
- Effectuer la vérification du système final. Selon la séquence, observer carbone 13 signal provenant de la chambre de l'urée dans un protocole de scout.
NOTE: Cela garantit que le système est configuré correctement avant de commencer le processus de dissolution irréversible.
6. Run Dissolution
- Lorsque le pyruvate a atteint> 90% de polarisation (~ 1 h), les solutions et les fantômes sont prêts, et le balayage est configuré cliquez sur le bouton run de dissolution sur le sy DNPtige console.
- Lorsque vous êtes invité déplacer le bâton de dissolution dans sa position de fonctionnement et injecter milieu de dissolution. Fermez le système DNP et cliquez sur le bouton fini sur la console système DNP. Déplacer dissolution bâton en position de repos lorsque vous êtes invité, puis cliquez sur Terminer.
- Lorsque le système DNP délivre le pyruvate hyperpolarisé (~ 2 min après le chauffage démarre) retire 500 pi de la solution de pyruvate dans chacune des seringues de solution concentration d'enzyme haute et basse. Lentement (~ 10 sec) injecter chaque seringue dans une ligne d'injection.
NOTA: Le balayage aurait pu être lancé avant l'injection ou à tout moment jusqu'à après l'injection de 3 min en fonction du protocole d'analyse utilisé.
Traitement 7. Image
NOTE: Ce fantôme a été conçu pour être utilisé avec de nombreuses stratégies d'imagerie. Voir Figure 2, comme un exemple de la façon dont les images rad-EPSI ont été traitées à l' aide de Matlab.
- Charger données brutes à partir du fichier fid. Reshape les données en fonction du nombre de projections, lisez les points, échos et compte des données stockées sous forme de paires réelles et imaginaires. Séparer les points d'écho pairs et impairs.
- soit une transformation de Fourier les échos pairs ou impairs dont les dimensions le long d'écho. identifier visuellement les bandes de fréquences pour les pyruvate et lactate. Par souci de simplicité de la valeur absolue du spectre a été utilisé.
- Séparer chaque bande de métabolite et transformée de Fourier le long de la direction de codage de fréquence pour obtenir des sinogrammes isolées pour chaque métabolite. radon Inverse transformer les sinogrammes séparés pour produire l'image de l'un lactate ou pyruvate.
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Representative Results
images 2D Slice sélectives ont été acquises à l'aide d'une séquence de snapshot radEPSI. images métabolites ont été reconstruits à l'aide rétroprojection filtrée. Les images des métabolites sont bien alignés avec les images de protons, comme on le voit sur la figure 2. Ce signal de lactate de système hyperpolarisé ne peut être générée à partir de la conversion enzymatique de la pyruvate hyperpolarisé. Sur la figure 4, la chambre inférieure, avec une concentration plus élevée de la LDH, le lactate a une plus forte et plus faible signal de pyruvate par rapport à la chambre supérieure. En utilisant les signaux relatifs de métabolites comme une estimation de la concentration enzyme lactate rapport pyruvate est 1,47 fois plus élevée dans la chambre inférieure. Le taux de concentration de l' enzyme réelle entre les compartiments supérieurs et inférieurs était 1,66 fois ce qui est en accord grossier avec les rapports de signaux (figure 4).
Temps images de cours étaient gèneclassé en utilisant une séquence IDEAL (figure 3). Forte accord entre les images métabolites et la référence de protons a été de nouveau observé. Notez que pas d'urée fantôme était présent pour cette étude. Dans la chambre de l'enzyme haute à droite, un signal de lactate initiale très forte est observée. La réaction a été presque complètement catalysée par le temps qu'il a été livré dans la (livraison 9 sec, 12 sec pic lactate) chambre. La réaction progresse plus lentement dans la chambre de faible concentration d'enzyme (à gauche). Il est également à noter que moins de signal pyruvique a été observée dans la chambre enzymatique plus élevée que le signal a été converti en lactate.
Figure 1. Phantom Schéma: (A) Schéma montrant la conception de la chambre. Chambers A et B équipés pour les injections et les lignes d'échappement. La chambre de l'urée est scellée car il n'a pas besoin d'être injectered lors de l'acquisition. (B) Photo de fantôme démonté montrant les chambres, les lignes d'injection et tube de 50 ml. (C) Le système fantôme assemblé avec les lignes d'injection enroulées autour de sorte que les connecteurs de la seringue à la fin des lignes sont dans le cadre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. images métabolites utilisant rad-EPSI. Images coronales générées à partir de deux bandes spectrales distinctes, pyruvate (centre) et le lactate ( à droite). La chambre supérieure a de signal nettement plus pyruvate et moins signal de lactate de la chambre inférieure. Une image de protons ( à gauche) a été acquis après l' imagerie agents hyperpolarisés. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. images de cours de temps de Métabolite utilisant une séquence IDEAL. Axial images de cette série ont été acquises en 3-sec intervalles. Pyruvate (en haut) et le lactate (en bas) sont affichés sur l'image de protons en niveaux de gris. les signaux les plus faibles pyruvates fort lactate et sont observées dans la chambre de droite qui contient la concentration d'enzyme élevée. La chambre gauche, avec la concentration d'enzyme inférieure, a montré moins de lactate et le signal de pyruvate plus fort. Les chambres sont vides de signaux hyperpolarisé pour les 9 premiers sec parce que le balayage a été lancé avant l'injection. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. Images transformés: Les grandeurs de signal moyennes pour chaque chambre montré sur les images métabolites combinés ( à gauche). La différence de lactate à des taux de pyruvate pour les chambres supérieure et inférieure correspond qualitativement la différence dans les activités enzymatiques utilisées, indiquées sous forme de graphiques à barres (à droite).
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Discussion
imagerie en temps réel des métabolites hyperpolarisés a de nombreux défis uniques pour la conception de la séquence, la validation et le contrôle qualité. La capacité de résoudre l'hétérogénéité spatio-temporelle et spectrale offre un potentiel clinique substantielle, mais exclut les méthodes d'assurance qualité et de validation associés à l'IRM conventionnelle. séquences d'imagerie complexes ou des algorithmes de reconstruction peuvent avoir des dépendances subtiles qui les rendent difficiles à caractériser ou à l'extérieur de valider l'expérience d'imagerie. Hétérogénéité biologique et d' autres considérations pratiques limitent l'utilisation in vivo et des modèles in vitro pour caractériser ou valider des séquences, du matériel ou des algorithmes de traitement de données.
À compartiments multiples spatiales et l' évolution chimique dynamique, il est possible de rappeler les caractéristiques essentielles associées à des substrats d'imagerie hyperpolarisé in vivo , mais d'une manière contrôlée. Régions d'activité haute et basse enzyme fournissent reproductibilitécontraste dynamique ble pour l'évaluation des biomarqueurs d'imagerie qualitative et quantitative. Les variations spatiales assurent des distorsions géométriques, désalignements, et d'autres sources d'erreurs sont comptabilisés correctement.
Bien plus contrôlable que les systèmes vivants les vitesses de réaction catalysée par la LDH sont encore des conditions expérimentales très sensibles et sont une source majeure d'incertitude. Critique, LDH est sensible à la température. Si les mesures suivantes doivent être comparés plus grand soin doit être pris que la chambre et la température du liquide restent constantes dans toutes les mesures. En outre, les concentrations élevées de pyruvate associées à des études hyperpolarisés force l'utilisation de concentrations élevées de la coenzyme NADH et la LDH de l'enzyme. Ces concentrations élevées ne permettent généralement pas aux hypothèses peu ou pas d'inhibition de l'enzyme ou un substrat particulier étant en excès de concentration. Si la caractérisation rigoureuse de la cinétique chimique était souhaitée probableconcentrations de différence de réactifs seraient nécessaires pour récupérer ces hypothèses. Cependant, cette formulation se traduira par la production de lactate hyperpolarisé à des taux variables dans chaque compartiment, ce qui devrait être suffisant pour la plupart validation d'imagerie.
Si peu ou pas de signal de lactate est observé un premier endroit pour vérifier serait l'activité de l'enzyme, qui peut avoir besoin d'être remplacé. En outre la variation de la livraison dans les compartiments fantômes provoque l'incertitude dans la quantité de signal hyperpolarisé. Pour réduire ces sources de variabilité, il est essentiel que la quantité de pyruvate hyperpolarisé ajouté à chaque chambre est mesurée avec précision et il est ajouté en douceur. La décroissance du signal intrinsèque de pyruvate hyperpolarisé complique cette tâche en plaçant des délais stricts sur l'injection. Les travaux futurs se concentrera sur la mise en œuvre d'un mécanisme d'injection automatisé qui permettra au processus d'introduction pyruvate hyperpolarisé au mélange enzymatiqueet l'injection ultérieure dans le fantôme à la machine contrôlée. Ce système permettra d'éliminer l'erreur humaine dans la mesure de la quantité de pyruvate ajouté à chaque chambre ainsi que d'augmenter la vitesse de livraison au scanner. Notamment, la pyruvate hyperpolarisé a été retiré dans les seringues contenant le mélange d'enzymes avant que la totalité du volume a été injecté dans les chambres. Cela a été fait pour permettre au processus d'injection pour aider à mélanger le pyruvate avec le mélange d'enzymes. Une limitation de ce procédé est que la réaction du pyruvate en lactate est initiée avant que le mélange se trouve dans le scanner et par conséquent la première partie de la réaction n'a pas été mesurée. raffinement avenir de la conception de la chambre aura pour but de permettre aux chambres à être pré rempli avec le mélange d'enzymes et seul le pyruvate hyperpolarisé injecté tout en assurant un mélange suffisant du contenu de la chambre comme pyruvate arrive.
Par rapport à des fantômes statiques ce système a des limites. Le dependence sur une certaine réaction chimique dynamique limite ces fantômes à usage unique. Après l'injection des lignes et des chambres doivent être nettoyés et des solutions de réactifs frais doivent être utilisés, ou décongelé à partir aliquotes. Alors que le fantôme d'une seule enzyme capte une partie du comportement dynamique chimique, il ne récapituler pas fidèlement un système biologique réel. Dans les systèmes vivants pyruvate est impliquée dans de multiples voies biochimiques complexes ainsi que la simple conversion de pyruvate en lactate en présence de co-enzyme avec une seule isoforme enzymatique est une simplification importante. En outre, si vasculaire ou une autre forme de livraison, ainsi que tout type d'absorption cellulaire sont essentielles à la mesure de ce système sera probablement un modèle insuffisant. Le fantôme d'une seule enzyme est un compromis qui met l'accent sur une certaine réaction chimique, il est pas aussi reproductible ou pratique comme un fantôme statique, mais est encore plus reproductible que les systèmes vivants. La reproductibilité de ce système se caractérise by variation de mesure répétée de 15 à 20 pour cent par rapport aux études sur les animaux qui ont entre intra groupe 25 à 40 pour cent de Variabilité 10. En outre, il ne modélise pas tous les aspects des cellules ou des tissus vivants, mais maintient le comportement dynamique critique qui est perdue lors de l'utilisation d'un fantôme statique.
Ce système fantôme a été conçu pour fonctionner avec une gamme de techniques d'imagerie. Avec une telle plate-forme flexible les scans d'AQ et acquisitions hyperpolarisés effectuées ci-dessus sont interchangeables avec la séquence ou les protocoles utilisés par une autre institution. Pour illustrer cela nous avons réalisé une étude similaire sur un scanner GE 3T en utilisant une séquence IDEAL personnalisée avec des résultats similaires.
Hyperpolarisé IRM [1- 13 C] -pyruvate très prometteur en raison de sa capacité à sonder le métabolisme in vivo du cancer en temps réel. Fait intéressant, la sensibilité de cette technique pose un grand défi lors de l'élaboration ou la validation Measuremtechniques de Ent. L'utilisation d'un fantôme d'une seule enzyme, il est possible de recréer la dynamique spatiale et temporelle qui sont essentiels à la mesure des agents hyperpolarisés par IRM d'une manière pratique, contrôlable et reproductible nécessaire pour être utile pour le développement et la vérification.
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Disclosures
Publication de cette vidéo-article est soutenu par Bruker société.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention CPRIT (RP140021-P5) et un prix Julia Jones Scholar Cancer Research Matthews CPRIT de formation de recherche (RP140106, CMW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpect 7T | Bruker | BioSpec 70/30 USR | 7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner |
| HyperSense | Oxford Instruments | Hypersense DNP Polarizer | Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents |
| 1-13C-Pyrvic Acid | Sigma Aldrich | 677175 | Carbon 13 labled neat pyruvic acid |
| Trityl Radical | GE Healthcare | OX063 | Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| LDH | Worthingthon | LS002755 | Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle |
| NADH | Sigma Aldrich | N4505 | β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt |
| Trizma | Sigma Aldrich | T7943 | Trizma Pre-set crystals |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 |
References
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