Abstract
Coxiella burnetii, agenten som orsakar Q-feber, är en obligat intracellulär bakterie. PCR-baserade diagnostiska analyser har utvecklats för att detektera C. burnetii-DNA i cellkulturer och kliniska prover. PCR kräver specialutrustning och omfattande slutanvändarutbildning, och därför är det inte lämpligt för rutinarbete, särskilt i en resurs begränsade område. Vi har utvecklat en loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP) analys för att detektera närvaron av C. burnetii i patientprover. Denna metod utförs vid en enda temperatur omkring 60 ° C i ett vattenbad eller värmeblock. Känsligheten hos denna LAMP-analysen är mycket lik PCR med en detektionsgräns av ca 25 kopior per reaktion. Denna rapport beskriver framställningen av reaktionen med hjälp av frystorkade reagens och visualisering av resultat med hjälp av hydroxynaphthol blå (HNB) eller en UV-lampa med fluorescerande interkalerande färgämne i reaktionen. Lampan reagens var lyophilized och förvarades vid rumstemperatur (RT) under en månad utan förlust av detektionskänslighet. Denna lampa analys är särskilt robust, eftersom reaktionsblandningen preparatet inte medför komplicerade steg. Denna metod är idealisk för användning i resursbegränsade miljöer där Q-feber är endemisk.
Introduction
Den lilla gramnegativ bakterie Coxiella burnetii är det orsakande medlet av Q-feber, som är en världsomspännande zoonos. På grund av Q-feber världsomspännande distribution och den höga smittsamheten C. burnetii, USA: s militära och civila personal som utstationeras utomlands löper risk att smittas i de endemiska områden.
Q-feber manifesteras i två former: akuta och kroniska infektioner. Akut Q-feber presenterar sig med influensaliknande symptom, hepatit eller lunginflammation, och är vanligtvis en självbegränsande sjukdom med en låg dödlighet. Kronisk Q-feber, medan mindre vanliga, ofta resulterar i endokardit, som har en mycket högre dödlighet om de lämnas obehandlade 1,2. Därför tidig diagnos styra en lämplig behandling är avgörande för patientens vård. Polymerase Chain Reaction (PCR) och kvantitativ realtids-PCR (qPCR) analyser har utvecklats för att detektera C. burnetii-DNA i cellkulturer och kliniska prover 3-5 </ Sup>. Både PCR och qPCR är kostsamma och ofta inte lätt tillgänglig i resursbegränsade områden för rutinarbete.
Ursprungligen beskrevs av Notomi 6, loop-medierad isotermiska förstärkning (LAMP) erbjuder ett alternativ DNA-förstärkning metod. LAMP använder Bst DNA-polymeras för strängförskjutning DNA-syntes tillsammans med specialdesignade primeruppsättningar som känner igen åtminstone sex oberoende regioner i målgenen. Den mest betydande fördelen med LAMP är att amplifiering sker under isoterma förhållanden. Därför krävs endast ett vattenbad, värmeblock eller en inkubator. Denna metod har använts för att detektera flera Rickettsia patogener 7-9. Visualisering av amplifierade DNA-produkter genom gelelektrofores är den mest exakta metod som kan skilja sant positiva från falska positiva på grund av ospecifik förstärkning. Men förfarandet i samband gelelektrofores är inte praktiskt för resursbegränsade arEAS. Flera alternativa metoder utvecklades för att detektera reaktionsprodukterna. Dessa alternativ, såsom grumlighet härrörande från magnesium pyrobildning 10 eller med hjälp av en fluorescerande interkalerande färgämne för att synliggöras under UV-ljus 11,12 är mer gynnsamma än att köra en gel. Lampan reagens var stabila under en månad vid förvaring vid 25 ° C och 37 ° C, som är omgivningstemperaturer i tropiska och subtropiska länder där Q-feber är endemisk 13.
En LAMP analys utvecklades i vårt laboratorium för att detektera närvaron av C. burnetii i plasmaprover 14. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för framställningen av LAMP-reaktionsblandningen från de lyofiliserade reagensen. De frystorkade reagens är stabil i en månad vid förvaring vid rumstemperatur. I kombination med en enkel visualisering metod, är detta en idealisk metod att använda för att detektera C. burnetii i en resursbegränsad inställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered plasmid-DNA Späd som standard för LAMP Reaktion
- Använda en spektrofotometer för att mäta den optiska densiteten (OD) vid 260 nm för att bestämma den plasmid (innehållande målgenen IS1111a av C. burnetii RSA 493) DNA-koncentration. Ett OD 260 av 1 motsvarar 50 mikrogram / l av DNA.
- Konvertera mängden plasmid-DNA in i kopietal. Eftersom storleken av plasmiden är 6330 bp, är molekylvikten av denna plasmid 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). DNA-koncentrationen av plasmiden är 34,2 ng / ul (bestämd från steg 1,1). 1 pl av denna DNA-prov innehåller 34,2 ng plasmid-DNA, vilket motsvarar 5 x 10 9 kopior (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 GX 6,02 x 10 23) av DNA.
- Tillsätt 10 pl av plasmid-DNA (5 x 10 9 kopior / | il) till 90 | il vatten för en 10-faldig spädning för att göra ett DNA-prov av 5 x 10 8 kopior / | il.
- Upprepa steg 1,3 för att framställa DNA-prover av 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, och 5 x 10 0 kopior / il.
2. Förbered DNA mall Prover för LAMP Reaktion
- Utför DNA-extraktion från humana plasmaprover med hjälp av en kommersiell DNA Mini Kit enligt tillverkarens protokoll. Använda totalt 200 | j, l prov för extraktion och eluera heras DNA i en 20 | al volym.
3. Förbered 2x LAMP Reaction Buffer
- Blanda 200 pl 10x Pol buffert, 320 pl 5 M trimetylglycin, 12 pl 1 M MgSO 4, 280 pl dNTP blandning (10 mM vardera) och 188 pl vatten för att göra en ml 2x LAMP buffert. Blanda genom puls-virvling i 10 sek.
4. Utför standardlampa Reaktion
- Blanda 12,5 pl 2x LAMP-buffert (som framställts i steg 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH4) 2 SO4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimetylglycin, 1,4 mM dNTP-blandning), 1,2 pl av tändämnesblandningen, 1 mikroliter av Bst-DNA-polymeras (8 U / | il), och 5,3 | il vatten för att göra reaktionsblandningen (20 | il) i ett 0,2 ml PCR-rör.
- Tillsätt 5 pl DNA (från steg 1 eller 2) till 20 pl reaktionsblandningen och blanda väl.
- Nära röret och inkubera vid 60 ° C under 60 min i ett vattenbad eller värmeblock. Detta är den optimala reaktionstemperaturen som fastställts tidigare.
- Tillsätt 5 | il av 10 x gelladdningsbuffert för att avsluta reaktionen.
- Belastning 5 | il av reaktionsprodukter på en 2% agarosgel färgad med interkalerande nukleinsyra fläcken.
- Kör gelen vid 100 V under 35 min i 1x TBE-buffert.
- Visualisera resultaten av UV-ljus.
5. Utför LAMP Reaktion med rekonstitueradereagens
- Blanda 125 pl 10x Pol buffert, 200 pl 5 M trimetylglycin, 7,5 pl 1 M MgSO 4, till 667.5 il vatten gör 1 ml beredning buffert. Blanda genom puls-virvling i 10 sek.
- Ta bort rören som innehåller frystorkade reagens från den förslutna aluminiumfoliepåse. Använd inte rören om aluminiumfoliepåsen inte är förseglade eller om den är skadad.
- Tillsätt 20 pl beredning buffert i varje rör för att återsuspendera frystorkade reagens.
- Blanda genom att pipettera buffert upp och ned 5 gånger. Ta en titt för att se till att frystorkade reagens är helt resuspenderas. Det vita pulvret ska försvinna i röret.
- Tillsätt 5 | il DNA-mall (från steg 1 eller 2) till de rekonstituerade reagenserna och blanda väl.
- Nära röret och inkubera vid 60 ° C under 60 min i ett vattenbad eller värmeblock.
- Tillsätt 5 | il av 10 x gelladdningsbuffert för att avsluta reaktionen.
- Belastning 5 pl reaktionprodukter till en 2% agarosgel färgad med interkalerande nukleinsyra fläcken.
- Kör gelen vid 100 V under 35 min i 1x TBE-buffert.
- Visualisera resultaten av UV-ljus.
6. Utför LAMP Reaktion med rekonstitutionsbuffert innehållande HNB eller fluorescerande interkalerande färg
- Blanda 125 pl 10x Pol buffert, 200 pl 5 M trimetylglycin, 7,5 pl 1 M MgSO 4, 7,5 pl 20 mM HNB (eller 12,5 pl 100x fluorescerande interkalerande färg) och 660 pl (eller 655 pl) av vatten till göra 1 ml beredning buffert. Blanda genom puls-virvling i 10 sek.
- Använd den färdigberedda buffert som framställts i avsnitt 6 att upprepa stegen 5,2 - 5,6.
- Visualisera resultaten med blotta ögat (reaktion innehållande HNB) eller en UV-ljus (reaktion innehållande fluorescerande interkalerande färgämne).
7. Utför realtid LAMP Reaktion med Tube Scanner
- Lägg 5 | il DNA till reconstituted reagenser som innehåller fluorescerande interkalerande färgämne, nära röret och sätta in den till röret scanner.
- Inställd inkubationstemperatur vid 60 ° C. Mäta fluorescensen vid 520 nm under 60 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De frystorkade LAMP reagenser inuti 0,2 ml tub innehåller Bst DNA-polymeras, primrar och dNTP. 20 | il av rekonstitution buffert används för att återsuspendera de lyofiliserade reagens. Figur 1 visar de LAMP reaktions resultat på agarosgeler med nyberedda reagenser och lyofiliserade reagens. Det frystorkade reagenset minskar inte dess aktivitet. LAMP-reaktioner framställda genom båda reagensen kan detektera 25 kopior av DNA-mall. Figur 2 visar detekteringen av reaktionsprodukterna med HNB eller fluorescerande interkalerande färg närvarande i reaktionen. Tillsats av HNB till reaktionen producerar en synlig färgförändring från purpur till blå med 25, 50 och 100 kopior av DNA-mall som är närvarande i reaktionerna. Inkluderandet av fluorescerande interkalerande färg i reaktionen visar en stark fluorescenssignal med UV-ljus, när 25, 50, och 100 kopior av DNA-mallar är närvarande. Ett rör scanner användesi denna studie för realtidsdetektion. Denna maskin kan utföra 8 reaktioner samtidigt. Figur 3 visar med hjälp av röret skannern för att övervaka fluorescens signaler i realtid med fluorescerande interkalerande färg närvaro. De fluorescenssignaler ligger över baslinjen efter 14, 18, 21, och 23 min med 10 6, 10 4, 10 3, och 100 kopior av DNA-templat i reaktionerna.
Figur 1. LAMP Resultat på agarosgel med nyberedda Reagens (A) och lyofiliserades Reagens (B). Reaktionsblandningar inkuberades vid 60 ° C under 60 min. (A) Spår 1, 100 bp stege; Bana 2-3, 4-5, 6-7 och 8-9 är reaktioner med 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, och inga kopior av plasmid-DNA. (B) Lane 10-11, 12-13, 14-15, och 16-17 är reaTGÄRDER med 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, och 0 kopior av plasmid-DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Metoder för att Identifiera LAMP Products. HNB (A) eller fluorescerande interkalerande färg (B) användes för att detektera LAMP produkter. Reaktioner utfördes vid 60 ° C under 60 min. Spår 1 till 5, reaktioner med 0, 10, 25, 50 och 100 kopior av plasmid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. realtid Detektion av LAMP Products. Reaktioner utfördes vid 60 ° C under 60 min. Reaktioner med 10 6 (svart), 10 4 (röd), 10 3 (grön), 100 (gul), 10 (blå), 1 (orange) och 0 (brun och ljusbrun) kopior av plasmiden. Tre detektioner utfördes självständigt. De var mycket reproducerbar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare har vi utvecklat en känslig och specifik LAMP analys med inriktning på insättningselementet IS1111a 14. Den IS1111 elementet valdes eftersom det är mycket konserverad bland de olika stammar av C. burnetii och dess höga antal kopior (7-110) i bakterier (Klee 2006). Våra resultat visade att LAMP kan detektera ungefär 25 kopior av IS1111 elementet, vilket kan korrelera till så lite som en kromosomal kopia av Coxiella DNA. I denna studie var Bst DNA-polymeras, LAMP primrar och dNTP lyofiliseras och förpackas i en ficka med aluminiumfolie påse. Känsligheten hos dessa frystorkade reagens kvar på 25 kopior; liknar de nyframställda reagens för åtminstone en månad vid förvaring vid RT. Det är mycket viktigt att se till aluminiumfoliepåsen är ordentligt förseglad innan den öppnas. Använd inte rören om aluminiumfoliepåsen inte är förseglade eller om den är skadad. Detta kan leda till att rehydrering of de frystorkade reagens som leder till förlust av dess reaktivitet. Den andra kritiska steget är resuspension av frystorkade reagens med beredning buffert. LAMP reaktion kommer inte att fungera korrekt med reagens som inte är helt resuspenderade. På grund av de höga saltkoncentrationer i reaktionsbufferten och hög viskositet av trimetylglycin lösning, de kan inte vara framgångsrikt frystorkas med Bst DNA-polymeras, LAMP primers och dNTP. En speciell steg krävs för att förbereda beredning buffert med dessa komponenter. Potentiellt LAMP reaktionen kan testas vid låga saltkoncentrationer med låg eller ingen trimetylglycin. Om det finns en reaktion tillstånd som har samma detekteringskänslighet men med låg salthalt och låg trimetylglycin koncentration, behöver det frystorkade reagenset endast spädas med vatten. Detta kommer att ytterligare förenkla reaktionssteg.
Nyligen al. Wang et 15 jämfört tolv ihouse LAMP analyser med kommersiellt isotermiska Master Mix kit och fann de interna analyser har falskt positiva resultat. I vårt laboratorium har vi utvecklat flera LAMP analyser för detektion av olika bakterier och har aldrig hittat falskt positiva resultat i dessa interna analyser. Vidare i början stadier av utvecklingen av LAMP-förfarandet var analyserna testades med både internt beredd huvudblandning och kommersialiserat Master Mix och ingen skillnad observerades i analyser känslighet och specificitet.
Vår studie visar också flera metoder som inte bara kan detektera LAMP produkter utan att öppna reaktionsrören för att minska risken för kontaminering laboratorium kors utan också har en kortare processtid att läsa resultat jämfört med gelelektrofores metod. Fördelen med att använda dessa detektionsmetoder kommer att betydligt öka vår förmåga att snabbt utföra analysen och diagnostisera en individ med C. burnetii
Till skillnad från PCR-baserade metoder där en termo behövs, ett värmeblock, vattenbad eller inkubator upprätthålla en konstant temperatur runt 60 ° C är allt som krävs för LAMP-analysen. Detta gör analysen särskilt lämplig i inställningen resursbegränsad. Till skillnad från den ursprungliga LAMP-analysen, Bst DNA-polymeras, LAMP primrar och dNTP måste förvaras vid -20 ° C. Dessa frystorkade reagens kan förvaras i rumstemperatur, vilket gör det ännu mer användbar för ett resurs begränsad miljö där Q-feber är endemisk. Långtidsstabiliteten studie av de lyofiliserade reagensen vid 4 ° C, 25 ° C, och 37 ° C är för närvarande pågår. I framtiden vill vi visa att denna lampa analys med användning av frystorkade reagens kan detektera C. burnetii med känslighet som liknar detPCR i en avlägsen miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Naval Medical Research Center, forskning arbetsenhet 6000.RAD1.J.A0310. De åsikter som uttrycks i artikeln är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis den officiella politiken eller position Institutionen för marinen, försvarsdepartementet, eller den amerikanska regeringen. Wei Mei Ching är anställd av den amerikanska regeringen. Detta arbete framställdes som en del av sina officiella plikter. Avdelning 17 USC §105 att "det upphovsrättsliga skyddet enligt denna avdelning finns inte tillgängligt för något arbete av Förenta staternas regering." Avdelning 17 USC §101 definierar en amerikanska regeringen arbete som arbete som skall utföras av militärtjänst medlem eller anställd av den amerikanska regeringen som en del av personens tjänsteplikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al.
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
