Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

Résumé

Ce manuscrit décrit l’utilisation d’une souche bioluminescente de trypanosomes africains pour permettre le suivi de l’infection à un stade avancé et démontre comment l’imagerie en direct in vivo peut être utilisée pour visualiser les infections au sein du système nerveux central en temps réel.

Résumé

La trypanosomiase humaine africaine (HAT) est une maladie à plusieurs stades qui se manifeste en deux stades : un stade sanguin précoce et un stade tardif lorsque le parasite envahit le système nerveux central (SNC). L’étude in vivo du stade avancé a été limitée, car les méthodologies traditionnelles nécessitent l’ablation du cerveau pour déterminer la présence des parasites.

L’imagerie par bioluminescence est une forme d’imagerie optique non invasive et très sensible qui permet de visualiser en temps réel un agent pathogène transfecté par la luciférase. En utilisant une souche de trypanosome transfectée qui a la capacité de produire une maladie à un stade avancé chez la souris, nous sommes en mesure d’étudier la cinétique d’une infection du SNC chez un seul animal tout au long de l’infection, ainsi que d’observer le mouvement et la dissémination d’une infection systémique.

Nous décrivons ici un protocole robuste pour étudier les infections du SNC à l’aide d’un modèle de bioluminescence de la trypanosomiase africaine, fournissant des observations non invasives en temps réel qui peuvent être analysées plus en détail avec des approches optionnelles en aval.

Introduction

La trypanosomiase humaine africaine (THA), ou maladie du sommeil, est causée par les parasites protozoaires à transmission vectorielle de Trypanosoma brucei spp¹. Le nombre de cas actuels est estimé à moins de 7 mille chaque année, avec près de 70 millions de personnes exposées au risque d’infection parasitaire sur le continent africain. La maladie, qui est le plus souvent mortelle si elle n’est pas traitée, comprend un stade hémolymphatique précoce où les parasites sont présents dans le sang, progressant vers un stade tardif lorsque les parasites envahissent le système nerveux central (SNC) et ne sont plus sensibles au traitement par des médicamen....

Protocole

Éthique
Tous les travaux ont été effectués en vertu de l'approbation du Royaume-Uni Home Office Animaux (Procédures scientifiques) de la Loi de 1986 et la London School of Hygiene and Tropical Medicine Bien-être des animaux et Comité d'éthique. ARRIVÉE directive sont suivies dans le présent rapport.

1. In Vivo Passage de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

1. Retirer un stock cryoconservés (stabilat appelé) de T. b. souche brucei GVR35-VSL-2 (disponible chez le professeur John Kelly à la London School of Hygiene & Tropical Medicine par MTA) ⁹ à partir de l....

Résultats

Ce protocole démontre comment suivre la progression de la maladie après infection de souris avec T. b. brucei, un modèle pour la trypanosomiase humaine africaine. La figure 1 montre la chronologie du protocole expérimental, ce qui démontre le calendrier de traitement et d' imagerie étapes. La figure 2 montre un champ de vue typique dans un Giemsa teinté frottis sanguin fixe utilisé pour quantifier la parasitémie périphérique, avec des trypan.......

Discussion

Le développement d'un T. bioluminescente b. souche brucei GVR35 permet la visualisation d'une infection trypanosomienne du début à la fin de l' étape. Modèles d'infection antérieurs ont été incapables de détecter la phase tardive, lorsque les parasites sont dans le cerveau, en temps réel de la microscopie de frottis sanguin, et nécessitaient l'abattage et l' élimination des cerveaux de souris infectées afin de déterminer la charge parasitaire ^12. La biolumine.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PBS	Sigma, Royaume-Uni	P4417	comprimés pH 7,4
Glucose	Sigma, Royaume-Uni	G8270	99,5 % (moléculaire) Chlorure
d’ammonium	Sigma, Royaume-Uni	A9434	99,5 % (moléculaire)
Héparine (sel de lithium)	Sigma, Royaume-Uni	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, Royaume-Uni	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, Royaume-Uni	D4031	Filtré stérile
M. Frosty	Nalgene, Royaume-Uni
Giemsa	Sigma, Royaume-Uni	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, Royaume-Uni
Sigma,	Royaume-Uni 115144-35-9
Acéturate de diminazène	Sigma, Royaume-Uni	D7770	Qualité analytique
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, Royaume-Uni		autres bioimageurs disponibles par exemple de Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, Royaume-Uni		Logiciel propriétaire pour les instruments Perkin Elmer IVIS ; d’autres instruments peuvent avoir leur propre
seringue de 1 ml	Fisher Scientific, Royaume-Uni	10142104
seringue de 20 ml	Fisher Scientific, Royaume-Uni	10743785
aiguilles	de 25 gGreiner Bio-one	N2516
21 G Aiguilles	Greiner Bio-one	N2138
Lame de microscope double dépolie	VWR, UK	631-0117
1,5 ml Tube de microcentrifugation	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Tube Bijou	StarLab, UK	E1412-0710
Dispositif de contention de souris	Sigma, UK	Z756903	Notre dispositif de contention a été fabriqué en interne, il s’agit d’un modèle similaire