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Article de méthode

Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

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⸱

DOI :

10.3791/54032

⸱

18 mai 2016

 , 
1Department of Infection and Immunity, London School of Hygiene & Tropical Diseases

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit l’utilisation d’une souche bioluminescente de trypanosomes africains pour permettre le suivi de l’infection à un stade avancé et démontre comment l’imagerie en direct in vivo peut être utilisée pour visualiser les infections au sein du système nerveux central en temps réel.

Résumé

La trypanosomiase humaine africaine (HAT) est une maladie à plusieurs stades qui se manifeste en deux stades : un stade sanguin précoce et un stade tardif lorsque le parasite envahit le système nerveux central (SNC). L’étude in vivo du stade avancé a été limitée, car les méthodologies traditionnelles nécessitent l’ablation du cerveau pour déterminer la présence des parasites.

L’imagerie par bioluminescence est une forme d’imagerie optique non invasive et très sensible qui permet de visualiser en temps réel un agent pathogène transfecté par la luciférase. En utilisant une souche de trypanosome transfectée qui a la capacité de produire une maladie à un stade avancé chez la souris, nous sommes en mesure d’étudier la cinétique d’une infection du SNC chez un seul animal tout au long de l’infection, ainsi que d’observer le mouvement et la dissémination d’une infection systémique.

Nous décrivons ici un protocole robuste pour étudier les infections du SNC à l’aide d’un modèle de bioluminescence de la trypanosomiase africaine, fournissant des observations non invasives en temps réel qui peuvent être analysées plus en détail avec des approches optionnelles en aval.

Introduction

La trypanosomiase humaine africaine (THA), ou maladie du sommeil, est causée par les parasites protozoaires à transmission vectorielle de Trypanosoma brucei spp1. Le nombre de cas actuels est estimé à moins de 7 mille chaque année, avec près de 70 millions de personnes exposées au risque d’infection parasitaire sur le continent africain. La maladie, qui est le plus souvent mortelle si elle n’est pas traitée, comprend un stade hémolymphatique précoce où les parasites sont présents dans le sang, progressant vers un stade tardif lorsque les parasites envahissent le système nerveux central (SNC) et ne sont plus sensibles au traitement par des médicaments trypanosomales à un stade précoce2. Les traitements médicamenteux actuels pour la THA à un stade avancé ont à la fois des schémas thérapeutiques complexes et prolongés et des effets indésirables graves, ainsi qu’une résistance signalée, de sorte que la recherche de nouveaux traitements médicamenteux est impérative3,4.

L’étude de la trypanosomiase humaine africaine (HAT) à un stade avancé dans des modèles murins traditionnels est longue et complexe, l’ablation de tissu cérébral étant nécessaire pour surveiller la charge parasitaire5. La souche infectieuse animale T. b. brucei est utilisée comme modèle d’étude de la trypanosomiase, le stade avancé apparaissant 21 jours après l’infection (dpi). Pour surveiller l’infection parasitaire non bioluminescente de type sauvage dans le modèle murin, les frottis sanguins périphériques ou la PCR quantitative sont les seules méthodes pour déterminer la charge parasitaire. Pour la charge parasitaire dans le cerveau, la souris doit être éliminée, le cerveau excisé et la qPCR effectuée sur les tissus, ce qui rend impossible le suivi des parasites à plusieurs moments de l’infection au stade avancé. Cela se traduit par l’incapacité de suivre en temps réel les infections dans le système nerveux central (SNC).

L’imagerie de bioluminescence in vivo (BLI) peut fournir une détection très sensible et non invasive de la dissémination du parasite et de la progression de la maladie dans un modèle murin qui peut être suivi chez un seul animal pendant toute la durée de l’expérience6. BLI est basé sur l’émission de lumière dans le spectre visible produite par une réaction catalysée par la luciférase. Les photons émis sont ensuite détectés par une caméra CCD (dispositif à couplage de charge)7. À cette fin, l’agent pathogène est génétiquement modifié pour exprimer une protéine de luciférase et le substrat, la luciférine, est introduit à des points temporels d’intérêt par injection. Le principal avantage de cette méthode est la possibilité de réaliser des études longitudinales, dans lesquelles le même animal peut être imagé plusieurs fois avec un minimum d’effets indésirables. Le signal de bioluminescence acquis peut être quantifié, indiquant ainsi la charge pathogène.

L’optimisation et la validation d’un T. b. brucei bioluminescent décalé vers le rouge ont permis d’étudier l’infection à un stade avancé grâce à des procédures non invasives, détectant les parasites plus tôt que la microscopie à film sanguin et réduisant considérablement le temps, le coût et le nombre d’animaux nécessaires pour étudier l’infection du SNC et le dépistage de médicaments dans la trypanosomiase à un stade avancé8,9. Dans ce protocole, nous démontrons l’infection de souris avec des trypanosomes bioluminescents et comment visualiser ensuite les parasites in vivo pour quantifier la progression de la maladie et la pénétration du SNC.

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Protocole

Éthique
Tous les travaux ont été effectués en vertu de l'approbation du Royaume-Uni Home Office Animaux (Procédures scientifiques) de la Loi de 1986 et la London School of Hygiene and Tropical Medicine Bien-être des animaux et Comité d'éthique. ARRIVÉE directive sont suivies dans le présent rapport.

1. In Vivo Passage de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

  1. Retirer un stock cryoconservés (stabilat appelé) de T. b. souche brucei GVR35-VSL-2 (disponible chez le professeur John Kelly à la London School of Hygiene & Tropical Medicine par MTA) 9 à partir de l' azote liquide et laisser équilibrer à la température ambiante. Diluer stabilat à 2 x 10 4 trypanosomes / ml dans du tampon phosphate stérile de glucose (PBS-G) pH 8,0 (1 litre de PBS + 15 g de glucose) 10.
    Note: T. b. brucei GVR35-VSL-2 est non-infectieux pour l' homme et exige SAPO autorisé des installations pour mener à bien des expériences.
  2. Inject 20-25 g femelle CD1 souris avec 0,2 ml dilué trypanosomes par voie intrapéritonéale (IP) avec une aiguille de 25 G. Ceci est la "souris donneuse". Placez la souris infectée dans un spécifique Pathogen gratuit (SPF) -cage et alimentation ad libitum.
    Remarque: les souris CD1 sont une souche consanguine et T. b. infections brucei GVR35 sont bien caractérisés dans cette souche. Cependant, ce protocole est également applicable aux souches consanguines ou génétiquement modifiés, mais il est important de noter que la couleur de la fourrure peut avoir un impact sur ​​la sensibilité de l' imagerie 6,9.
  3. Surveiller parasitémie périphérique par prélèvement de sang. Placez la souris dans un restrainer plastique et prendre 5 pi de sang de la queue par ponction veineuse avec 21 aiguilles G ou saignées et mélanger 1/10 avec 0,85% de chlorure d'ammonium stérile pour lyser les globules rouges et de permettre un meilleur comptage.
  4. Comptez le sang dilué dans un Neubauer hémocytomètre.
    1. Chargez le sang dilué dans les deux chambres. Comptez tout le gr centralid d'une chambre pour donner n trypanosomes. Concentration de trypanosomes dans le sang = n x 10 4 trypanosomes / ml, ajuster pour tout facteur de dilution et de calculer la moyenne des deux chambres.
      Remarque: Après environ 5-7 jours après l'infection, la parasitémie périphérique devrait augmenter suffisamment pour mener à bien une infection à une concentration de 2 x 10 4 trypanosomes / ml.
  5. Lorsque les niveaux de trypanosomes sont suffisants pour le nombre de souris nécessaires élevé, passer à l'étape 1.6. Un niveau de parasitémie de 6 x 10 4 trypanosomes / ml dans une souris donneuse est suffisante pour l' infection de 10 souris.
    Remarque: Pour des tailles de groupes statistiquement significatifs, n = 6 pour chaque groupe de souris de traitement sont nécessaires 8. Pour les autres modèles d'infection, il faudrait appliquer pour déterminer la taille des groupes appropriés calculs de puissance.
  6. Placez la souris dans une boîte de chaleur (à 28-30 ° C pendant environ 5-10 min) pour permettre aux veines de la queue à se dilater.Pour induire une anesthésie terminale, administrer 20 mg / kg iv pentobarbital avec une aiguille 25 G. Confirmer la souris est anesthésiée en appuyant doucement les coussinets pour assurer qu'il n'y a aucun retrait réflexe.
  7. Hépariner une aiguille 21 G par aliquotage 5 ml d'héparine à 5000 unités USP / ml dans un tube bijou et sucer deux fois dans et hors de l'aiguille reliée à une seringue de 1 ml.
  8. Prenez le héparinisé 21 G aiguille et seringue de 1 ml, et d'effectuer une ponction cardiaque sur la souris de passage anesthésié par l'insertion de l'aiguille centrale en dessous de la cage thoracique (un cordon de sang commun dans la base de l'aiguille) et tirez doucement sur le piston afin de ne pas replier l'enceinte du coeur. Recueillir un minimum de 0,7 ml de sang.
  9. Diluer sang infecté pour produire un inoculum de 2 x 10 4 trypanosomes / ml dans du PBS-G pH 8,0 que l' étape 1.1 ci - dessus.
    Remarque: À ce stade, le sang restant peut être cryoconservés pour produire stabilat par mélange avec 8% de glycérol, 20% inactivé par la chaleur foetal casérum lf (salut-FCS) et du sang infecté 72%. geler lentement à -80 ° C en utilisant un lent gel gel récipient pour atteindre une vitesse de refroidissement de -1 ° C / min, avant le transfert à l'azote liquide.

2. L'infection des souris expérimentales

  1. Placez CD1 souris femelles (~ 21-25 g) dans une boîte de chauffage pour réchauffer doucement pour dilater les veines. Placez les souris réchauffés dans un dispositif de retenue en plastique et injecter 0,2 ml inoculum dilué par voie intraveineuse avec une aiguille G 25 dans la veine de la queue, ce qui équivaut à 4.000 trypanosomes par souris. Placez la pression au niveau du site d'injection après pour endiguer l'hémorragie.
    Remarque: l' infection intrapéritonéale est un itinéraire valide de l' infection et a été utilisé dans les études précédentes 10, mais nous avons trouvé cela moins reproductible que la voie intraveineuse.
  2. Randomize souris et cage infectées par groupes de 3 dans des cages SPF-ventilés. En tant que témoin, injecter CD1 souris femelles de type sauvage parasite non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Surveiller l'infection par le biais du sang Film Microscopie
    1. Spot 5 ul sang de venepuncture ou saignées sur une lame de verre et d'effectuer un frottis sanguin (en utilisant une deuxième lame de verre pousser doucement la goutte de sang à travers la diapositive pour produire un film mince). Autoriser les diapositives à l'air sec.
    2. Fixer le frottis sanguin avec 100% de méthanol et tache avec Giemsa pendant 10 min avant de rincer avec dH 2 O et laisser sécher à l' air. Sous l'objectif 100X compter le nombre de trypanosomes dans 10 champs de vision (FOV).
      Remarque: le tournage de sang est effectué aux côtés de l'animal entier imagerie non invasive dès après l'infection d'un jour. Lors du traitement d'un certain nombre d'animaux, cette méthode de détermination quantitative du trypanosome est préféré au comptage hémocytomètre que les échantillons peuvent être conservés à la température ambiante et on les compte plus tard.

3. bioluminescence Imaging to Track Infection

Remarque: Pour surveiller l'infection, toute animal imagerie non invasive peut être utilisée.

  1. Préparer une solution mère de D-luciférine, le substrat de la luciférase de luciole, dans Phosphate Buffered Saline de Dulbecco (DPBS) à 30 mg / ml. Filtre stériliser et congeler à -20 ° C.
    Remarque: D-luciférine est sensible à la lumière, donc la protéger de la lumière en enveloppant aliquotes dans du papier. Ne pas la congélation-décongélation répétée luciférine car il peut affecter l' activité 11.
  2. Chauffer une partie aliquote de la D-luciférine à la température ambiante. Retirez chaque souris de la cage (y compris les souris témoins infectées par la souche nonbioluminescent parasite de type sauvage) et injecter 150 mg / kg de la D-luciférine réchauffé (dilué dans du DPBS) intrapéritonéale avec une aiguille 25 G. Placer la souris dans une chambre isofluorane pendant environ 5 min pour induire une anesthésie avec 2% d' isofluorane / O 2 au mélange de 2,5 L / min.
    Note: Les souris deviennent immobiles quand ils sont sous anesthésie. Pour l'imageur utilisé ici, 3 souris peuvent être traitées à la fois. Si les souris sont anesthettérisé pendant plus de 30 min, une pommade ophtalmique artificielle déchirure peut être appliquée pour prévenir les yeux des souris contre le dessèchement.
  3. Pour l'imageur décrit ici, ouvrez le logiciel et initialiser la machine en utilisant le logiciel selon les instructions du fabricant. Acquérir les images une fois caméra et plaque chauffante ont atteint la température.
    Remarque: Cet instrument est généralement pas éteint, permettant à la machine d'effectuer des étalonnages de fond pendant la nuit. Dans le cas où il a besoin de redémarrer, il doit exécuter une vérification d'étalonnage en premier.
  4. Placer les souris anesthésiés dans l'imageur (voir 3.5). Utilisez de grands séparateurs noirs entre les souris pour minimiser saigner à travers de tout signal bioluminescent lumineux. souris de l'image en utilisant un ensemble de temps d'exposition; 1, 3, 10, 30, 60 et 180 secondes, avec binning moyenne, 1 f / arrêt et un filtre ouvert, et le champ de vision E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Remarque: Les souris témoins infectées par le type sauvage parasites GVR35 nonbioluminescent fournissent un backgrvaleur de bioluminescence ound. À partir d' un essai de cinétique de luciférine (figure 6) avec ce modèle, nous avons constaté que les crêtes du signal de bioluminescence à 10 minutes après l' administration et de l' imagerie dure environ 5 minutes pour 3 souris. Prenez ce délai en considération lors de l'anesthésie et l'imagerie des souris.
  5. Pour assurer l'imagerie approfondie des souris, tourner pour obtenir une ventrale, dorsale et vue latérale. Maintenir la cohérence dans l'ordre d'orientation pour l'imagerie entre les animaux séquentielles.
  6. Après l'imagerie, permettent la souris pour récupérer de l'anesthésie sous observation avant de revenir au SPF-cage.
  7. Continuer imagerie souris tous les 7 jours jusqu'au jour 21 post-infection. Il devrait y avoir une augmentation constante du signal de bioluminescence sur l'animal entier.
  8. A D21, l'image et le film de sang des souris comme décrit ci-dessus et la dose souris avec 40 mg / kg par voie intrapéritonéale acéturate de diminazène. Ce médicament va effacer la parasitémie périphérique, mais ne sera pas traverser la barrière hémato-brain barrière, et permet donc une meilleure visualisation de l'infection du système nerveux central.
    Remarque: Diminazène diminazène est un médicament bien établie utilisée pour traiter la trypanosomiase animale à un stade précoce.
  9. Continuer l'imagerie et la surveillance à J28 et J35.

4. Confirmation CNS Infection

  1. A D35, les souris d'image indiqués ci-dessus (étapes 3.1-3.4).
  2. Après l'exposition, les souris permettent de récupérer à partir de souris d'anesthésie et exsangue comme décrit à l'étape de 1,6 à 1,8, la collecte de sang pour une analyse ultérieure.
  3. Suite à une ponction cardiaque, perfuse des souris avec 20 ml de PBS (en option: ajouter 3 mg / ml de luciférine à une solution de perfusion), par l'intermédiaire du coeur pour effacer le sang provenant des organes et à réintroduire l'étiquette de luciférine qui aurait effacé de la région du cerveau au cours de l'intervalle de temps de l'étape 4.1.
  4. Retirez délicatement le cerveau, en utilisant des ciseaux courbes, coupe de la base autour de la circonférence du crâne, et soulevant la partie supérieure du crâne, pour permettre au cerveauà soulever délicatement avec une pince incurvées.
  5. Placer excisés du cerveau sur une section de matière plastique noire et la pipette 50 ul de 15 mg / ml de luciférine sur l'organe avant l'imagerie, afin d'assurer la luciférine adéquate a été ajoutée au cerveau excisée. L'image en utilisant les paramètres ci-dessus. Cela démontrera la localisation de l'infection aux hémisphères cérébraux.
    Remarque: la quantification de la parasitémie en aval sur le cerveau excisé peut être effectuée par qPCR 8 comme décrit précédemment. D'autres applications en aval alternatives peuvent inclure histologie ou immuno-histochimie afin d'identifier des parasites dans le tissu cérébral après fixation.

5. Quantification de la bioluminescence Imaging

Note: bioluminescence peut être quantifiée en utilisant la région d'intérêt (ROI) avec le logiciel d'imagerie et corrigé pour le fond bioluminescence.

  1. Utilisation de l'outil de retour sur investissement, créer un ROI rectangulaire pour l'animal entier une quantificationnd positionner sur l'image de la souris pour couvrir la pointe du nez à la base de la queue de la souris. Utilisez la même boîte de taille pour chaque animal et chaque point de temps. Lorsque l'on regarde le retour sur investissement pour le cerveau, utilisez un ROI circulaire de la même manière, en le positionnant sur la région de la tête de la souris dans l'image.
  2. Si vous le souhaitez, d'ajuster les images apparaissent sur le même spectre pour une représentation visuelle de l'infection.
    Remarque: Le logiciel utilisé ici génère une carte de couleur pour chaque image réglée automatiquement pour le comptage de photons minimum et maximum. Pour permettre une comparaison visuelle entre une série d'images, l'échelle de couleurs doit être réglé sur les mêmes valeurs pour toutes les images.
    1. Utilisation de l'image la plus bioluminescence et l'onglet «Réglage d'image» sur la palette d'outils, sélectionnez une échelle logarithmique et une échelle minimale de couleur appropriée et maximale (à déterminer empiriquement). Appliquer cette échelle à toutes les images tout au long de l'expérience.

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Résultats

Ce protocole démontre comment suivre la progression de la maladie après infection de souris avec T. b. brucei, un modèle pour la trypanosomiase humaine africaine. La figure 1 montre la chronologie du protocole expérimental, ce qui démontre le calendrier de traitement et d' imagerie étapes. La figure 2 montre un champ de vue typique dans un Giemsa teinté frottis sanguin fixe utilisé pour quantifier la parasitémie périphérique, avec des trypan...

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Discussion

Le développement d'un T. bioluminescente b. souche brucei GVR35 permet la visualisation d'une infection trypanosomienne du début à la fin de l' étape. Modèles d'infection antérieurs ont été incapables de détecter la phase tardive, lorsque les parasites sont dans le cerveau, en temps réel de la microscopie de frottis sanguin, et nécessitaient l'abattage et l' élimination des cerveaux de souris infectées afin de déterminer la charge parasitaire 12. La biolumine...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions John Kelly et Martin Taylor (London School of Hygiene and Tropical Medicine) pour fournir T. b. brucei GVR35-VSL-2 et le Dr Andrea Zelmer (LSHTM) pour obtenir des conseils sur l' imagerie in vivo. Ce travail a été soutenu par le Programme Bill et Melinda Gates Fondation mondiale de la santé (nombre subvention OPPGH5337).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PBSSigma, Royaume-UniP4417comprimés pH 7,4
GlucoseSigma, Royaume-UniG827099,5 % (moléculaire) Chlorure
d’ammoniumSigma, Royaume-UniA943499,5 % (moléculaire)
Héparine (sel de lithium)Sigma, Royaume-UniH0878
Hi-FCSGibco, Life Technologies, Royaume-Uni10500-064500 ml
DPBSSigma, Royaume-UniD4031Filtré stérile
M. FrostyNalgene, Royaume-Uni
GiemsaSigma, Royaume-UniG5637
D-LuciferinPerkin Elmer, Royaume-Uni
Sigma,Royaume-Uni 115144-35-9
Acéturate de diminazèneSigma, Royaume-UniD7770Qualité analytique
IVIS Lumina IIPerkin Elmer, Royaume-Uniautres bioimageurs disponibles par exemple de Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2Perkin Elmer, Royaume-UniLogiciel propriétaire pour les instruments Perkin Elmer IVIS ; d’autres instruments peuvent avoir leur propre
seringue de 1 mlFisher Scientific, Royaume-Uni10142104
seringue de 20 mlFisher Scientific, Royaume-Uni10743785
aiguillesde 25 gGreiner Bio-oneN2516
21 G AiguillesGreiner Bio-oneN2138
Lame de microscope double dépolieVWR, UK631-0117
1,5 ml Tube de microcentrifugationStarLab, UKI1415-1000
7 ml Tube BijouStarLab, UKE1412-0710
Dispositif de contention de sourisSigma, UKZ756903Notre dispositif de contention a été fabriqué en interne, il s’agit d’un modèle similaire

Références

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