Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas

Résumé

Nous présentons un protocole permettant d’identifier des fractions protéiques contenant des antigènes pour les anticorps IgM humains et murins avec des chaînes légères spécifiques kappa (Vκ). Ce protocole n’est pas limité aux anticorps de classe IgM mais s’applique à tous les isotypes d’immunoglobulines qui ciblent leur antigène avec une affinité suffisamment élevée lors des immunoprécipitations.

Résumé

Les anticorps de l’isotype IgM sont souvent négligés en tant que traitements potentiels dans les essais sur l’homme, les modèles animaux de maladies humaines ainsi que la détection d’agents dans les techniques de laboratoire standard. En revanche, plusieurs IgM humaines ont démontré leur efficacité dans des modèles de cancer et des modèles de troubles du SNC, notamment la sclérose en plaques (SEP) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Parmi les raisons pour lesquelles ils ne sont pas pris en compte, citons les difficultés à exprimer, à purifier et à stabiliser les anticorps IgM, la difficulté d’identifier les antigènes (non protéiques), la faible affinité de liaison et les lacunes fondamentales dans les connaissances sur les glucides et les lipides.

Ce manuscrit utilise HIgM12 comme exemple pour fournir un protocole détaillé de détection des antigènes par Western blot, immunoprécipitations et immunocytochimie. HIgM12 cible l’acide polysialique (PSA) attaché à la molécule d’adhésion des cellules neurales (NCAM). Du tissu cérébral de souris postnatal précoce provenant de souris de type sauvage (WT) et de souris knock-out NCAM (KO) dépourvues des trois principales variantes d’épissage du système nerveux central (SNC) NCAM180, 140 et 120 a été utilisé pour évaluer l’importance de NCAM pour la liaison à HIgM12. Une digestion enzymatique plus poussée des tissus du SNC et des cellules du SNC en culture à l’aide d’endoneuraminidases nous a permis d’identifier le PSA comme l’épitope de liaison spécifique de HIgM12.

Introduction

Anticorps de l'isotype IgM montrent un grand potentiel thérapeutique pour le traitement de diverses maladies telles que le cancer et les troubles du SNC ^1-7. Le groupe du Vollmers a identifié de nombreux anticorps chez les patients cancéreux pour une utilisation potentielle en tant que biomarqueurs spécifiques de la tumeur ou thérapeutiques actives qui sont capables de tuer les cellules malignes en induisant les voies apoptotiques ^4,8,9. Fait intéressant, tous les anticorps identifiés ayant un potentiel thérapeutique sont de l'isotype IgM et appartiennent au groupe des «autoanticorps naturels» (NABS).

De même, le groupe de la souris et Rodriguez a identifié des anticorps humains qui stimulent la remyélinisation dans les lésions de la moelle épinière chronique démyélinisées dans des modèles de sclérose en plaques (SEP). Identiques à des anticorps ayant des effets anti-cancéreux, les anticorps de la remyélinisation favorisant AcN et sont de l'isotype IgM ^1,6,7,10. Les antigènes précis pour IgM plus identifiés sont encore undetermined y compris l'anticorps remyélinisation promotion humaine rHIgM22, actuellement en phase I des essais cliniques pour les patients atteints de SEP ^11. Malgré les efforts répétés par des experts dans le domaine de la recherche sur les lipides et les glucides à la fois dans le milieu universitaire et en partenariat avec l' industrie ^11, tente d'identifier les antigènes de rHIgM22 n'a pas été couronnée de succès. L'échec des techniques standard utilisées pour identifier des antigènes d'anticorps IgG à travailler avec des anticorps IgM identifie un besoin critique d'affiner les méthodes spécifiques pour ces anticorps que les plus susceptibles de glucides ou lipides cible les antigènes.

L'objectif de ce manuscrit est l'anticorps régénérative humaine HIgM12 et les procédures expérimentales utilisées pour identifier son antigène. HIgM12 anticorps a été identifié chez des patients atteints de macroglobulinémie de Waldenstrom, stimule la croissance des neurites in vitro ^{de 12 à 14} et des cibles d' acide sialique (PSA) fixé à la molécule d'adhésion des cellules neurales (PSA-NCAM) ^15,16. HIgM12 prolonge la durée de vie dans un modèle de souris de la SLA ¹⁷ et améliore le résultat fonctionnel dans le virus de l' encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV) des souris infectées par. Plus précisément, HIgM12 stimule l' activité motrice horizontale et verticale spontanée chez la souris et augmente chroniquement démyélinisation nombre de petites et moyennes diamètre de la moelle épinière axones huit semaines après une seule dose faible de intrapéritonéale, injecté anticorps ^18.

La molécule d'adhésion cellulaire neuronale (NCAM) est une glycoprotéine de l'immunoglobuline (Ig) superfamille exprimée sur la surface cellulaire des neurones, des cellules gliales, les muscles squelettiques et les cellules tueuses naturelles ^19-25. Les trois principales isoenzymes NCAM appelés NCAM180, NCAM140 et NCAM120, sont des variants d'épissage alternatifs d'un transcrit primaire qui varient seulement dans leur domaine cytoplasmique. Au sein du système nerveux central, la NCAM est la principale molécule polysialylés (> 95%) avec de longues homopolymères d'acide sialique chargés négativement. pOLYSIALIQUE uncid avec n> 10 est appelé PSA mais les structures oligomériques plus courtes existent qui sont aussi biologiquement pertinents. D' autres protéines polysialylés exprimées dans le SNC sont SynCAM1 ^26, Neuropilin-2 (NRP-2) ^27,28 et une sous - unité de canal de sodium ²⁵ (pour revue , voir ^29).

Les méthodes décrites ici permettent l' identification d'antigènes pour les immunoglobulines humaines et de souris contenant kappa (Vk) chaînes légères (VκI, VκIII ou VκIV chaînes légères pour des anticorps humains et les chaînes légères VκI pour les anticorps de souris) spécifiques indépendamment de la isotype de l'anticorps (par exemple, IgG, IgM , IgA, IgD ou IgE). Cette limitation est basée sur l'utilisation de la protéine L agarose pour immunoprécipitations avec des anticorps de l'isotype IgM. D'autres stratégies peuvent inclure des lectines liant le mannose et des anticorps IgG anti-IgM secondaires liés de manière covalente à des billes d'agarose, qui peuvent élargir l'applicabilité de cette méthode pour plusieurs anticorps IgM incLUDING ceux qui lambda (λ) des chaînes légères (voir la discussion). Ratios de sérum chaînes légères IgM Vk par rapport aux chaînes légères de IgM provenant d'individus en bonne santé sont de 1,5: 1 ^30.

Sur la base de la méthodologie chromatographique utilisé ici pour séparer, enrichir et immunologiquement détecter certaines molécules ^31, tous les antigènes sont tenus d'inclure au moins un domaine de petites protéines. Épitope de liaison spécifique de l'anticorps peut être à l' intérieur ou en dehors du domaine des protéines (par exemple, dans les glycoprotéines, les lipoprotéines). étapes biochimiques initiales utilisées pour identifier l'antigène spécifique pour HIgM12, respective pour réduire la liste des candidats potentiels, sont les étapes les plus cruciales dans cette méthode. préparations spécifiques de type cellulaire et la caractérisation basée sur la morphologie des cellules sont décrites pour les cellules gliales, mais cette méthodologie peuvent être extrapolés pour accueillir d'autres types de cellules à l'intérieur ou à l'extérieur du SNC.

Il est urgentbesoin de développer de nouvelles ou modifiées techniques applicables pour le nombre croissant d'anticorps IgM ayant un potentiel thérapeutique pour les différents troubles de l'homme en particulier dans les cas (la majorité des antigènes IgM) où les cibles d'anticorps sont des structures d'hydrates de carbone ou des lipides.

Protocole

des protocoles et des procédures animales ont été menées en conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices et approuvées par le soin des animaux et de l'utilisation des comités institutionnels de la Clinique Mayo (Mayo IACUC numéro de protocole # A51912).

Préparation des tissus 1. Généralités CNS

1. Générer NCAM déficient (KO) souris sur C57 / BL6 fond (aimablement fourni par le Dr Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), les souris hétérozygotes NCAM et de type sauvage (WT) littermates (C57 / BL6) en traversant les hétérozygotes. Génotypage des souris KO NCAM a été décrite précédemment et ^{32 à 34} ne sera pas expliqué plus en détail.

Note: les étapes 01.02 à 01.06 sont en option.

2. Avant la chirurgie, administrer une solution de pentobarbital (Stock: 25 mg / ml; 50/100 pi de pentobarbital pour les premiers stades adultes respectifs postnatales) par injection intrapéritonéale (aiguille de calibre 27 et 1 mlseringue).
3. Attendre 2 min ou jusqu'à ce que l'animal a atteint un plan chirurgical de l'anesthésie. Administrer un anesthésique supplémentaire, si nécessaire, au cours de chaque opération pour maintenir un plan chirurgical de l'anesthésie. Utiliser la méthode de pincement réponse toe pour déterminer la profondeur de l'anesthésie. Les animaux doivent être insensible avant de continuer.
4. Faire 0,5 - incision latérale 1 cm à travers le tégument et la paroi abdominale juste au-dessous de la cage thoracique. Séparez délicatement le foie du diaphragme. Faire une petite incision dans la membrane en utilisant une courbe, ciseaux émoussés. Continuer l'incision de la membrane sur toute la longueur de la cage thoracique afin d'exposer la cavité pleurale.
5. Placez courbes, ciseaux émoussés le long d'un côté de la cage thoracique, déplaçant soigneusement les poumons, et faire une coupe à travers la cage thoracique jusqu'à la clavicule. Faire une coupe similaire sur le côté opposé. Soulever le sternum loin, couper avec précaution tout tissu en le connectant au cœur.
6. Faire une incision à l'animal'S oreillette droite à l'aide d'iris ciseaux pour créer aussi grand une sortie possible. Injecter lentement 10 ml de tampon phosphate salin (PBS) dans le ventricule gauche de l'animal (rouge clair; débit: 1 ml / min) à l'aide d'une seringue de 10 ml équipé d'aiguille de calibre 27. Ne pas augmenter le débit / PBS de pression pendant la perfusion pour éviter la destruction des tissus.
7. Décapitez souris néonatale en utilisant des ciseaux chirurgicaux.
8. Retirez le cerveau en saisissant les orbites avec une pince et en insérant une petite paire de ciseaux dans la colonne vertébrale. Couper le crâne vers l'avant au niveau de l'oreille. Peler le crâne et placez doucement le cerveau dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de milieu de dissection glacée sur la glace (tableau 1). Placez chaque cerveau dans un tube de 1,5 ml et stocker immédiatement sur de la glace sèche (-79 ºC).
9. Inciser le cervelet et le tronc cérébral à partir de cerveaux congelés à l'aide d'une lame de rasoir propre sur la glace. Travaillez rapidement pour éviter la décongélation du tissu.
10. Peser lecerebrum congelés, mis dans un tube de 15 ml sur la glace et ajouter un tampon de lyse glacé (voir le tableau 1) à une concentration finale de 150 pg de tissu cérébral par ul de tampon de lyse. Répétez l'opération pour cerebra restant. Gardez le cerveau sur la glace en tout temps pour les étapes 1.9 - 1.11.
11. Homogénéiser le cerveau dans du tampon de lyse par trituration à travers une pointe de pipette de 1 ml (10 fois), puis par trituration à travers une seringue de 5 ml équipé d'une aiguille de calibre 27 (10 fois). Laisser incuber les lysats de cerveau pendant encore 30 minutes sur de la glace pour permettre une lyse complète des tissus.
12. Retirer matériel et le cerveau des lipides détergents insolubles par centrifugation série (quatre tours à 19.000 xg pendant 10 min à 4 ° C). Jeter (blanc) myéline et les débris cellulaires contenant des granulés tout en conservant le surnageant après chaque étape de centrifugation. Aliquotes lysats du cerveau et conserver à -80 ºC.

2. immunoprécipitations Utilisation IgM humaine (HIgM12 et Isotype contrôle IgM) en tant que "Pull-down" Agent de Cerebral lysats de WT et NCAM KO Souris

1. Agarose L protéine Perle Préparation ^9,35,36
   1. Préparer 200 ml de tampon IP , y compris BSA (voir le tableau 1). Préparer un autre 200 ml du même tampon IP sans BSA.
   2. Par immunoprécipitation transfert de réaction de 100 pi de suspension de protéine L Agarose en utilisant une pipette de 200 pi dans un tube de 1,5 ml. Ne pas protéines vortex perles d'agarose L! Ajouter 1 ml de tampon IP (voir le tableau 1) à chaque tube. Mélanger la protéine L agarose et de tampon IP manuellement à travers l'inversion (cinq fois).
   3. Laver la protéine L billes d'agarose quatre fois par centrifugation dans une centrifugeuse de paillasse (1000 xg, 2 min, 25 ° C). Prenez le surnageant à l'aide d'une pipette de 200 pi sans perturber le culot d'agarose. Répétez les étapes de lavage 2.1.2 à 2.1.3 trois fois supplémentaires.
   4. Equilibrer la protéine L agarose dans 1 ml de tampon IP fraîchement ajouté sur un rouleau pendant une nuit à 4 ° C.
2. Anticorps-antigène-Agarose L Formation complexe et détection d' antigène dans le Western Blot
   1. Laisser incuber 30 mg de tissu cérébral lysées (~ 200 ul de lysat) dans 1 ml de tampon IP glacé avec 20 pg d'anticorps IgM (HIgM12) dans un tube de 1,5 ml pendant une nuit sur un rouleau à 4 ° C.
   2. Isoler des billes d'agarose de protéine L (de l'étape 2.1.4) dans une centrifugeuse de paillasse pendant 2 min à 1000 xg, 4 ° C. Jeter le surnageant à l'aide d'une pipette 200 ul sans perturber le culot d'agarose. Ajouter la solution refroidie anticorps-encéphalique lysat (de l'étape 2.2.1) à la protéine L d'agarose en utilisant une pipette de 1 ml.
   3. Incuber la suspension d'agarose L anticorps-antigène-protéine pendant 2 heures sur un rouleau à 4 ° C. Laver le complexe anticorps-antigène fixé sur Agarose L par centrifugation à 1000 g pendant 2 min, 4 ° C. Eliminer délicatement le surnageant sans perturber le culot et ajouter 1 ml de tampon IP glacée contenant 0,2% de BSA.
   4. Répéter l'étape de lavage une fois de plus en utilisant un tampon IP glacé contenant 0,2% de BSA et deux fois de plus en utilisant un tampon IP glacée sans BSA.
   5. Centrifuger complexe anticorps-antigène fixé sur Agarose L à 1000 g pendant 2 min, 4 ° C. Rejeter le surnageant complètement première en utilisant une pipette de 200 pi jusqu'à ~ 50 pi de solution sont laissées sur le dessus de la pastille d'agarose protéine G suivie d'une pipette 10 ul. Conserver les échantillons sur la glace.
   6. Ajouter 40 pi de tampon d'élution IP (voir le tableau 1) par 1,5 ml microtubes, tubes flick doigt 6 fois et chaleur pendant 5 min à 95 ° C. Mettre les échantillons sur la glace pendant 2 min et centrifuger pendant 30 secondes à 13.000 xg, 4 ° C.
   7. Transférer le surnageant à l'aide d'une pipette de 10 pi (~ 35 pi au total) dans un nouveau tube de 1,5 ml sans perturber le culot. Confirmer l'absence de billes d'agarose protéine L par rinçage dans une petite quantité d'échantillon élué à la paroi intérieure du tube.
      Note: "Granular"la protéine L billes d'agarose sont clairement visibles si elle est présente.
   8. Si billes de protéine L d'agarose sont présents, centrifuger l'échantillon pendant 30 secondes à 13.000 xg surnageant et nettoyer le tuyau. Répétez l'étape jusqu'à ce qu'aucune billes d'agarose sont détectables.
   9. Charge 10 - 20 pi d'échantillons éluées par puits sur gel SDS-polyacrylamide dans un système de tampon Tris / Glycine / SDS (voir le tableau 1).
      Remarque: Utilisez 7,5% ou 4 - 20% de gels de gradient avec 50 ul de volume de chargement par puits pour la détection de PSA-NCAM ou isoformes NCAM (dimensions de gel (W x L x épaisseur: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm).
   10. Gels Run pour ~ 1 h à 100 V (1,74 V / cm ²⁾ sur paillasse. Un refroidissement supplémentaire est pas nécessaire pour cette étape ^37,38.
   11. Les protéines de transfert de PVDF (fluorure de polyvinylidène) à membrane (taille de pores 0,45 um) pendant 2,5 heures en chambre froide à 100 V (1,74 V / cm ²⁾ en utilisant un tampon de transfert à froid (5-10 ° C) (voir tableau 1).
   12. membranes de bloc wvec 10% (p / v) de poudre de lait en poudre dans du PBS-T pendant 1 heure à 25 ° C sur un agitateur orbital de paillasse, lavage des membranes à deux reprises pendant 10 minutes avec du PBS-T et la sonde pendant une nuit avec l'anticorps primaire dans 5% de BSA dans du PBS T sur un agitateur orbital dans la chambre froide.
   13. Le lendemain matin, les membranes de lavage une fois brièvement avec un excès de PBS-T à 25 ° C (y compris le couvercle et le récipient), suivi par 3 lavages avec du PBS-T pendant 10 minutes à chaque fois sur un agitateur orbital (80 tpm) (toutes les étapes de lavage sont effectuées à 25 ºC).
   14. Ajouter un anticorps secondaire (peroxydase de raifort (HRP) conjugué à un anticorps anti-humain anti-IgM (pour HIgM12) (dilution 1: 30 000) dans 5% de lait sec en poudre dans du PBS-T pendant 1 heure à 25 ° C sur un agitateur orbital (70 tours par minute ).
   15. membranes Laver abondamment une fois brièvement avec excès de PBS-T à 25 ºC (comprennent le couvercle et le récipient) suivi de 3 lavages avec du PBS-T pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital (80 rpm) (toutes les étapes de lavage sont effectuées à 25 ° C) .
   16. Mélanger 1 ml de froid chemiluminescen amélioréCE HRP composant de substrat A (enhanced de réactif au luminol) avec 1 ml de composant B (réactif oxydant) (par mini-Blot) à 25 ° C.
   17. Utilisez une pince en plastique pour transférer les membranes sur une serviette en papier pour enlever l'excès de liquide (les tenir sur les bords mêmes). Les contenants secs avec des serviettes en papier et membranes remettre dans les conteneurs (un pour chaque membrane). Immédiatement ajouter 2 ml de substrat pré-mélangé chimioluminescence amplifiée HRP (composé A + B) (étape 2.2.16.) de chaque membrane et on incube pendant 2 min à 25 ° C sur un agitateur orbital (90 rpm). Assurez-vous que les membranes sont uniformément humidifiées par le réactif de chimiluminescence.
   18. Transfert des membranes dans un manchon en plastique transparent et enlever le liquide et les bulles d'air en excès avec des serviettes en papier. Mettez les membranes dans le manchon en plastique dans une cassette de film et, éventuellement, la bande du manchon en plastique dans la cassette. Fermez la cassette.
   19. Prenez la cassette, le cinéma, la minuterie et des ciseaux dans la chambre noire. Couper coin supérieur droit de chaque film à des fins d'orientation, exposer (différents) films pour différentes périodes de temps (10 sec, 1 min, 10 min) et de développer des films à un développeur de film.

3. Endoneuraminidase-NF Digestion de PSA attachés à NCAM ³⁹

1. Digest cerveau lysées tissu de jours après la naissance (P) 7 souris WT et des souris KO P7 NCAM (préparé à partir de l' étape 1.12) pendant 2 h sur de la glace à l' aide endoneuraminidase-NF (endo-NF) comme cela est illustré dans le tableau 2 ^39.
2. Ajouter 5 ul de tampon d'échantillon Laemmli 4x à chacun des tubes (1 - 6) de l' étape 3.1 (tableau 2).
3. Charger les échantillons sur un 4 - gradient de gel et répétez SDS-polyacrylamide 20% étapes 2.2.10 à 2.2.19. Les membranes de la sonde avec HIgM12 (1 pg / ml), disponible dans le commerce anti-PSA anticorps monoclonal (clone 2-2B) (1 pg / ml) et d'anticorps (contrôle de charge) de la β-actine (1 pg / ml) dans 5% de BSA dans du PBS -T.

4. Préparation du Rat et Cultures Souris CNS

1. Préparation du verre Lamelles
   1. Acid-lavage 25 mm lamelles de verre dans HCl 1 M à 50 - 60 ° C pendant 4-16 heures dans une hotte en utilisant un récipient en verre. Agiter lamelles de temps en temps par tourbillonnement doux.
   2. Laver abondamment dans le verre lamelles de l'eau distillée (3x). Assurez-vous de laver l'acide entre les lamelles empilées.
   3. Rinçage des lamelles dans 100% d'éthanol et de les sécher sur du parafilm dans une hotte de culture cellulaire. Un jour avant l'utilisation, chauffer les lamelles de verre pendant 24 heures dans un récipient en verre avec couvercle à 100 ° C dans un four.
   4. Mettez des lamelles de verre dans un plat à 6 puits et manteau avec 3 ml de 40 pg / ml de poly-D-lysine dans l'eau stérile pendant 1 heure à 37 ° C.
   5. Laver deux fois avec de l'eau stérile, sécher complètement sous culture cellulaire hotte et appliquer la lumière UV pendant 20 min.
2. Préparation de la culture de tissu en plastique pour les cellules du SNC
   1. Manteau de 60 mm de boîtes de culture cellulaire ou 75 cm des flacons de culture de tissu ² avec 3ml ml ou 10, respectivement, de 40 pg / ml de poly-D-lysine dans de l'eau stérile pendant 1 heure à 37 ° C.
   2. Laver deux fois avec de l'eau, sécher complètement sous culture cellulaire hotte et appliquer la lumière UV pendant 20 min.
3. Rat mélangé Glia Isolation ⁴⁰
   1. Anesthetize rats nouveau - nés dans IACUC approuvé chambre de l' euthanasie des rongeurs avec du CO ₂ alimentation en gaz (entièrement automatisé). Utiliser la méthode de pincement réponse toe pour déterminer l'absence de réaction de l'animal. Décapitez néonatale rat Sprague Dawley (de P0P1) (6 - 10 chiots à la fois).
   2. Retirez le cerveau en saisissant les orbites avec une pince et en insérant une petite paire de ciseaux dans la colonne vertébrale. Couper le crâne vers l'avant au niveau de l'oreille. Peler le crâne et placez doucement le cerveau dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de milieu de dissection glacée sur la glace (voir le tableau 1).
   3. Répétez pour le reste de jeunes rats (6 - 10) des chiots. Gardez le tissu sur la glace pour les étapes 4.3.2 - 4.3.7.
   4. Divisez le cerveau le long de la ligne médiane en deux hémisphères cérébraux et ensuite couper les bulbes olfactifs, ganglions de la base en dessous du cortex cérébral et l'hippocampe avec une pince Dumont. Placez le cortex cérébral isolé dans un plat propre Petri contenant disséquant moyen sur la glace.
   5. Prenez un cortex. Retirez les méninges avec des pinces à pointes fines sous un microscope de dissection.
   6. Répéter l'opération avec les corticales restants. Placez tous les corticales libres-méninges dans un plat propre Petri sur de la glace.
   7. Combinez hémisphères corticaux de tous les chiots dans une boîte de Pétri de 60 mm et d'utiliser une lame de rasoir stérile dés le tissu cérébral dans 1 mm morceaux hachés.
   8. Transférer le tissu cérébral haché à l'aide d'une pipette de 10 ml dans un non enrobé de 500 ml, flacon en verre stérile et on ajoute 10 ml de milieu de dissection glacée par le cerveau de rat. agiter doucement le flacon tout en ajoutant 1 ml de solution de trypsine dans du HBSS (solution saline équilibrée de Hank) (5 mg / ml de trypsine) à 9 ml de HBSS par le cerveau de rat. Ajouter 2% Du volume total de la solution de DNase I (1 mg / ml) et 2% du volume total _MgSO4 solution (3,82% de _MgSO4 dans HBSS (p / v)) pour la suspension de tissu cérébral et agiter doucement.
   9. Trypsiniser tissu sous agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 30 min à 37 ° C. Assurez-vous que les morceaux de tissu flottent au cours de cette étape et ne sédimentent pas au fond. Augmenter la vitesse de rotation si nécessaire.
   10. Ajouter du sérum bovin fœtal (FBS) à une concentration finale de 10% (v / v) et mélanger en agitant le ballon 10 fois pendant 10 s. Refroidir suspension de tissu dans l'eau glacée pendant 15 minutes. Swirl flacon doucement cinq fois par seconde min.
   11. transférer doucement la suspension de tissu dans 50 ml tubes stériles en utilisant 25 ml ou 50 ml pipettes et centrifuger pendant 5 min à 200 xg, 4 ° C.
   12. Rejeter le surnageant et remettre en suspension doucement le tissu du SNC digéré dans 15 ml de milieu de dissection glacée additionnée de 5 ml de sérum fœtal bovin, 0,4 ml de _MgSO4 solution (3,82%_MgSO4 dans HBSS) et 1,6 ml de DNase I (1 mg / ml).
   13. suspension de tissu de Split également en deux stériles tubes de 15 ml (~ 10 ml chacun) et lentement triturer à l'aide d'une pipette de 10 ml (10 fois) jusqu'à ce que la suspension devient turbide / laiteux. Gardez les cellules en suspension sur la glace lors du traitement du tube suivant. Attendre pendant 3 minutes jusqu'à ce que les tissus du système nerveux central digérée restante des sédiments au fond du tube. Transférer le surnageant à nettoyer 50 ml tube sans perturber la fraction de culot.
   14. En option, passer surnageants turbides à 40 microns tamis cellulaire et de combiner la suspension cellulaire unique résultant en tubes de 50 ml stériles sur la glace.
   15. Spin suspension cellulaire pendant 5 min à 200 xg, 4 ° C.
   16. Retirez délicatement le surnageant en utilisant une pipette de 10 ml jusqu'à ~ 2 ml de dissection moyen sont laissés sur le dessus du culot cellulaire.
   17. Finger culots de cellules de film dans 50 ml tubes (~ 10 fois). Ajouter lentement 5 ml de milieu de croissance chaud (voir le tableau 1) à la suspension cellulaire tout en douceurmain tourbillonnant le tube.
   18. En option, répéter DNase étape 4.3.12 pour 10 minutes de plus sur la glace avec une solution de DNase I fraîche et MgSO ₄ -solution en cas d'amas de tissus visibles ou des touffes d'ADN. Tube Swirl manuellement 5 fois par seconde min.
   19. Plaque de 50.000 cellules par 25 mm lamelle de verre dans une flaque d' eau de 400 milieu de croissance ul dans un plat à 6 puits et laisser les cellules se fixent pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire (5% de CO _2, 37 ° C).
   20. Pour les confluents ( à moins de 24-48 heures après placage) 60 mm des boîtes de culture cellulaire et tissulaire de 75 ^cm2 de flacons de culture, la plaque 500000 cellules (boîte de 60 mm) ou de 2 millions de cellules (flacons de 75 ^cm2).
   21. Ajouter délicatement 2 ml (par puits, des lamelles de verre de 25 mm dans un plat à 6 puits), 3 ml (plats 60 mm) ou 10 ml (75 cm ² flacons) de milieu de croissance chaud à chaque puits. Incuber les cellules pendant la nuit et changer moyen complètement le lendemain matin. Puis changer moyen tous les autres jours (jour 3, jour 5, jour 7, etc.).
       Nonte: Rat cultures gliales mixtes sont prêts à utiliser pour immunocytochimie ou biochimie 24-48 heures après placage.
4. Cultures Souris mixte gliales
   1. Identique à la dissection des cerveaux de rats nouveau - nés décrits dans les sections 4.3.1 à 4.3.6, décapite P0 néonatales souris WT et NCAM KO avec C57 / BL6 fond, retirer les cerveaux et les mettre dans un milieu de dissection glacée (voir Tableau 1). Gardez le tissu sur la glace en tout temps.
   2. Divisez le cerveau le long de la ligne médiane en deux hémisphères cérébraux et ensuite couper les bulbes olfactifs, ganglions de la base en dessous du cortex cérébral et l'hippocampe avec une pince Dumont. Placez le cortex cérébral isolé dans un plat propre Petri contenant HBSS sur la glace.
   3. Prenez un cortex. Retirez les méninges avec des pinces à pointes fines sous un microscope de dissection. Répéter l'opération avec les corticales restants. Placez tous les corticales libres-méninges dans un plat propre Petri sur de la glace.
   4. Transfert hemisphe corticaleres avec pipette de 1 ml de chaque souris dans, stériles 15 ml tubes séparés. Ajouter 1,2 ml de milieu de dissection glacée pour chaque cerveau et perturber mécaniquement le tissu cérébral par pipetage il 2 fois haut et en bas à l'aide d'une pipette de 1 ml.
   5. Ajouter 150 ul de solution de papaïne (10 mg / ml dans du PBS), 100 ul de solution de DNase I (1 mg / ml dans du HBSS) et 50 ul de _MgSO4 (3,82% dans HBSS) pour chaque cerveau et mélanger en tapotant un doigt.
   6. Incuber la suspension du cerveau pendant 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau et mélanger des suspensions de cerveau toutes les deux minutes par le doigt chiquenaude. Ajouter 1 ml de FBS par tube, mélanger et refroidir la suspension de tissu pendant 10 minutes sur la glace.
   7. Centrifuger le tissu cérébral pendant 4 min à 200 x g, 4 ° C et remettre en suspension le culot de tissu dans 1 ml de tampon de dissection glacé additionné de 70 ul de désoxyribonucléase I solution (1 mg / ml dans du HBSS) et 30 ul _MgSO4 solution (3,82% dans HBSS).
   8. Triturer le tissu cérébral en utilisant un FBS revêtu 1 ml pointe de la pipette(~ 5 fois) jusqu'à ce que le surnageant devient turbide. Passez le surnageant à travers un tamis cellulaire de 40 microns et transférer dans un tube propre sur la glace.
   9. Pellet cellules gliales mixtes par centrifugation pendant 5 min à 200 xg, 4 ° C. Aspirer le surnageant jusqu'à ~ 100 ul de milieu sont laissées sur le dessus du culot cellulaire. Resuspendre culot cellulaire par le doigt effleurant (~ 5 fois) et ajouter 1 ml de milieu de croissance de la souris chaude (voir le tableau 1).
   10. Le cas échéant, dissoudre les agrégats de cellules visibles et les cellules lysées / précipite l'ADN par pipetage la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas (cinq fois).
   11. Plate souris cellules gliales mixtes sur des lamelles de verre PDL revêtus ou plats de 60 mm, comme décrit dans les étapes 4.3.19 - 4.3.21. Laver les cellules le lendemain matin avec un milieu de croissance de la souris chaude et ensuite tous les autres jours. Souris glie mixte est prêt à utiliser pour immunocytochimie 48-72 heures après placage.
5. Rat Microglia Isolation
   1. Culture rat mélangéglie dans 75 cm ² flacons de culture tissulaire dans un milieu de croissance (voir le tableau 1) pendant 10 jours. Secouez amas de cellules microgliales de cultures mixtes gliales sur un agitateur rotatif à l' intérieur d' un incubateur de culture cellulaire (5% de CO _2, 37 ° C) à 140 tours par minute pendant 1 heure.
   2. Enlever le surnageant contenant microglie-de cultures gliales mixtes, passer à travers un tamis cellulaire de 40 microns et maintenir la suspension de cellules dans 50 ml tubes stériles.
      Nota: Les cultures microgliales sont généralement> 95% de pureté après cette étape avec peu CPOs contaminantes et très peu d'astrocytes.
   3. Eventuellement, remplacer le milieu de croissance sur les cultures gliales mixtes pour les futurs bouleversements offs microgliales. Typiquement effectuer plusieurs secousses-offs microgliales (une fois par semaine) à partir de cultures mixtes gliales.
   4. Le cas échéant, pour obtenir des puretés supérieur à 95% plaque de 10 ml du liquide surnageant contenant la microglie (étape 4.5.2) par 100 mm de boîtes de Petri et on incube dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 min à 37 ° C. Seulement microglia joindra à des boîtes de Pétri, tandis que les astrocytes et les OPCs restent dans le surnageant.
   5. Secouer doucement les boîtes de Pétri droite et à gauche (cinq fois chacun) dans la hotte de culture cellulaire. Aspirer le milieu de culture cellulaire remplacer complètement et avec 10 ml de milieu de croissance. Résultant des cultures de microglie sont> 98% pure.
   6. microglie de la culture pendant 7 jours dans du DMEM supplémenté avec 1% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine.
6. Rat OPC / oligodendrocytes Isolation
   1. Pour obtenir des cultures OPC hautement enrichi secouer les cellules microgliales première de 10 jours vieilles cultures mixtes gliales cultivées dans 75 cm ² flacons sur un agitateur rotatif dans un incubateur de culture cellulaire (5% de CO _2, 37 ° C) à 140 tours par minute pendant 1 heure. Jeter les microglies ne contenant surnageant ou utiliser pour des expériences spécifiques à la microglie (voir étape 5.5).
   2. Remplacer le surnageant contenant la microglie-avec un milieu de croissance de 10 ml et secouer les cultures gliales mixtes pourun autre 18 heures sur un agitateur rotatif à 200 tpm (5% de CO _2, 37 ° C).
   3. Recueillir le microglia- et le surnageant contenant OPC à partir de cultures gliales mixtes et passer à travers un tamis cellulaire de 40 microns. Recueillir la suspension cellulaire dans des tubes stériles de 50 ml.
   4. Eventuellement, remplacer le milieu de croissance sur les cultures gliales mixtes pour OPC futures secousses-offs.
      Note: OPCs continuent de proliférer sur des couches nourricières astrocytaires et peuvent être ébranlées-off une deuxième et une troisième fois (une fois par semaine), mais avec des rendements plus faibles.
   5. Plaque 10 ml de microglia- et OPC contenant un surnageant dans des boîtes de Petri de 100 mm et incuber dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes à 37 ° C. La microglie joindra aux boîtes de Petri, tandis que les OPC et les astrocytes restent dans le surnageant.
   6. Secouer doucement les boîtes de Pétri droite et à gauche (5 fois chacun) dans une hotte de culture cellulaire. Sortez seulement quelques boîtes de Pétri à la fois de la culture cellulaire incubateur (microglie va commencer délogeant de Petplats ri quand on les secoue vigoureusement dans un milieu plus frais).
   7. Recueillir et combiner le surnageant contenant OPC en tubes de 50 ml. En option, ajouter un milieu de culture à des boîtes de Pétri pour une utilisation dans des expériences spécifiques à la microglie.
   8. Eventuellement, pour augmenter encore la pureté des cultures OPC répéter les étapes 5.6.5 et 5.6.6 une fois avec des plats frais de Pétri pour réduire l'ampleur de la microglie dans les préparations OPC.
   9. Isoler enrichi surnageant contenant OPC dans la centrifugeuse pendant 5 min à 250 xg, 4 ° C. Aspirer doucement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Laisser 3 ml du surnageant au-dessus de la pastille et commencer la remise en suspension par OPCs doigt pichenette (10 fois).
   10. Broyez doucement OPC amas de cellules en utilisant une pipette de 10 ml (5 - 10 fois).
   11. Compter les cellules et la plaque 50.000 OPCs par 25 mm lamelle de verre (PDL-enduit) dans une flaque de milieu de croissance de 400 ul dans un plat à 6 puits et laisser les cellules se fixent pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire (5% de CO _2, 376; C). Ajouter délicatement 2 ml de milieu de prolifération chaude (voir le tableau 1) à chaque puits. PDL revêtu des boîtes de culture cellulaire de 60 mm, la plaque 1 - 1500000 OPCs dans 3 ml de milieu de prolifération.
   12. remplacer soigneusement FBS contenant milieu de prolifération avec un milieu de prolifération frais 3 h après étalement des OPCs (assurez-vous que les OPC attachés correctement et ne déloge pas pendant le changement moyen). milieu d'échange tous les deux jours.
       Note: cultures Rat OPC préparés en utilisant ce protocole sont généralement pur à 90% avec la microglie comme le principal type de cellules contaminantes, suivie par les astrocytes.

5. Immunocytochimie Utilisation HIgM12 dans les cellules gliales primaires

1. Immunofluorescence Triple-étiquette en utilisant HIgM12, anti-PSA mAb, et le type de cellules marqueurs spécifiques dans les cellules gliales primaires de WT et NCAM KO Souris
   1. Dans des conditions de cellules vivantes, l'étiquette 60% confluentes souris mélangé cultures gliales de souris WT et NCAM KO cultivées sur PDL-enduit25 mm, les lamelles de verre avec HIgM12 (10 pg / ml) et un mAb anti-PSA (clone 2-2B) (10 pg / ml) dans du PBS additionné de FBS à 10% à 4 ° C pendant 30 min.
   2. Laver les cellules à trois reprises pendant 20 secondes chacun avec du PBS glacé supplémenté avec 10% de FBS et fixer avec 4% de paraformaldehyde dans du PBS, pH 7,4 pendant 15 min à 25 ° C.
   3. Laver les cellules fixées à deux reprises pendant 1 min chacun avec du PBS supplémenté avec 10% de FBS et perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X100 dans du PBS, pH 7,4 pendant 2 min à 25 ° C. Laver les cellules deux fois pendant 1 min et l'étiquette avec des marqueurs gliales GFAP (astrocytes) ou IBA-1 (microglie) (1 pg / ml) dans du PBS additionné de 10% de FBS pendant une nuit à 4 ° C dans la chambre froide.
   4. Procéder à des conditions d'immunofluorescence standard , y compris DAPI milieu contenant ³¹ montage.
      Note: L' utilisation de Fab marqué par fluorescence ₂ fragments que des anticorps secondaires pour l' homme (HIgM12) et la souris (anti-PSA mAb, clone 2 - 2B) IgM est fortement recommandé.
   5. Prenez flimages uorescentes à 60X ou 100X. Utilisez les mêmes réglages de l'appareil pour toutes les images et les images de processus identique.
2. Immunofluorescence Étiquetage des ENDO-NF-traitées cellules WT Glie utilisant HIgM12 comme un anticorps primaire
   1. La culture WT souris mélangé glie cultivé pendant 3 jours dans un Neurobasal additionné de 10% de FBS et B27 complément (1:50) sur PDL revêtues de 25 mm, les lamelles de verre. Ajouter ENDO-NF (30 pg / ml) à 1 ml de milieu de culture et mettre à incuber pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO _2).
   2. cellules d'étiquetage vivent dans le froid avec HIgM12 interne et astrocytaire marqueur GFAP après fixation et perméabilisation comme décrit dans les étapes 5.1.1 à 5.1.5. Prenez des images fluorescentes à 60X ou 100X. Utilisez les mêmes réglages de l'appareil pour toutes les images et traiter de manière identique.

Résultats

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus par l'étude de PSA-antigènes spécifiques d'IgM humaines dans le système nerveux central. L'utilisation d'anticorps IgM humains contenant des chaînes légères spécifiques dans Vk paramètres biochimiques et par immunocytochimie fluorescent est représenté.

HIgM12 immunoprécipite son antigène à partir de lysats cérébraux du cerveau et agit en tant qu'agent (anticorps primaire), la détection dans des Western blots. Ni l' anticorps témoin isotypique ni L billes d' agarose immunoprécipitent un antigène similaire, ce qui démontre la spécificité de la tirer vers le bas (figure 1). Western blots en utilisant des lysats du système nerveux central de souris WT et KO NCAM démontrent la spécificité de liaison à HIgM12 contenant du PSA-NCAM (figure 2A). La digestion enzymatique du tissu du SNC de souris WT utilisant ENDO-NF identifie PSA attaché à NCAM que l'épitope de liaison spécifique pour HIgM12 (figure 2B). Utilisation de la méthode décrite ici, sont obtenus chez le rat IBA-1 positif cultures microgliales de haute pureté (Figure 3). Disponible dans le commerce anticorps anti-PSA (clone 2-2B) n'étiquette surface cellulaire ou des pools de PSA internes fixées et perméabilisées cellules microgliales IBA-1 positifs par microscopie à fluorescence. En accord avec la littérature publiée antérieurement, qui ne signale aucune expression de surface cellulaire de PSA-NCAM dans la microglie ^16,41 HIgM12 ne marque pas les antigènes de surface cellulaire dans les cellules microgliales de rat purifiés. Fait intéressant, l' étiquetage HIgM12 des résultats fixes et perméabilisées microglie dans un intracellulaire, motif périnucléaire qui ne sont pas limités à des organites spécifiques (figure 3). Les résultats sont en contraste avec ceux obtenus en utilisant un anticorps IgG anti-PSA (clone 735) , ²⁶ qui cible PSA SynCAM dans la microglie au niveau de l'appareil de Golgi ^41.

Contrairement à la microglie, HIgM12et des antigènes de surface des cellules cibles dans des cultures A2B5 OPC de rat hautement enrichis dans des conditions de cellules vivantes (figure 4). Les cultures OPC contiennent environ 5% contaminant les cellules microgliales. La figure 5 illustre un schéma pratiquement identique à la surface cellulaire de coloration entre HIgM12 et Acm anti-PSA (clone 2-2B) dans les astrocytes GFAP-positifs (figure 5A). Marquage immunofluorescent des astrocytes WT ENDO-NF-digérée par rapport au tampon astrocytes WT contrôle traités à l' aide HIgM12 démontre la présence de PSA astrocytaire (figure 5B). La présence d'astrocytes PSA positif in vivo doit encore être confirmé.

Figure 1: HIgM12 agit comme un "pull-down" Agent immunoprécipitations immunoprécipitations de lysat total du cerveau des souris de trois mois vieux utilisant HIgM12, isotype contrôle humain HIGM.126 ou agarose L perles uniquement comme agents "tirer vers le bas". Les protéines éluées ont été exécutées dans les Western blots avec des membranes sondées contre HIgM12. Les poids moléculaires des protéines éluées à partir des billes revêtues HIgM12 étaient dans la gamme de 160-200 kDa, en plus de la chaîne lourde IgM (~ 65-73 kDa). Ce chiffre a été modifié depuis J. Neurochem. ^15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: HIgM12 Cibles l'acide sialique (PSA) Moitié sur NCAM. A. homogénats de cerveau de P7, P13, P16 et P27 NCAM au total des souris KO et les contrôles de même portée hétérozygotes ont été exécutés dans les Western blots avec des membranes sondées contre HIgM12, PSA et β-actine comme témoin de chargement. J. Neurochem. ^15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: L'absence de PSA sur le Rat microglies se reflète par un manque de HIgM12 Étiquetage microglie Rat ont été cultivées pendant 48 h sur enduit poly-D-lysine lamelles de verre et soit étiqueté en direct sur ​​la glace avec HIgM12 ou après fixation avec HIgM12 ou anti. -PSA mAb (clone 2-2B). Les cellules ont été triple marqué avec microglie marqueur IBA-1 (vert), HIgM12 / PSA (rouge) et DAPI (bleu). Images montrent le manque de surface cellulaire microgliale liaison utilisant HIgM12 (rangée du haut) et le manque d'anti-PSA de liaison (clone 2-2B) à la surface cellulaire et les magasins internes dans la microglie de rat primaire (ligne inférieure). Sur la base de la morphologie bipolaire et absence d'IBA-1 coloration, la petite cellule de PSA-positive (rangée inférieure) a été suggéré d'être un OPC. Dans les cellules fixes, HIgM12 coloration a entraîné une punctated, motif périnucléaire qui n'a pas été limité aux organites spécifiques et a été considéré comme une liaison non spécifique (rangée du milieu). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: HIgM12 Cibles de surface cellulaire PSA-NCAM sur Rat OPCs OPCs Rat et microglie étaient cultu.rouge pendant 4 jours dans un milieu de prolifération sur des lamelles de verre revêtu de poly-D-lysine et triple marqués en direct sur la glace avec HIgM12 ou A2B5 (vert), interne macrophage / monocyte marqueur CD68 (clone ED-1) (rouge) et DAPI (bleu) . Images montrent des populations de cellules majorly positif pour le marqueur OPC A2B5 (rangée du haut) et HIgM12 (rangée du bas) avec quelques microglie CD68-positif (~ 5%). Phase contraste et des images DAPI ont été ajoutées pour révéler l' intégrité des cellules et le nombre de cellules pour chaque population. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: HIgM12 et anti-PSA mAb co-étiqueter une sous - population astrocytaire dans Souris mixte Glia. A. Souris cellules gliales mixtes de WT et NCAM au total des animaux KO contenant des astrocytes, des cellules oligodendrocytes lignée et microglia ont été cultivées pendant 3 jours et étiqueté en direct sur la glace avec HIgM12 (vert), anti-PSA mAb (clone 2-2B) (rouge) et ensuite pour le marqueur astrocytaire GFAP (violet) et DAPI (bleu). HIgM12 et anti-PSA révèlent un schéma de coloration identique virtuelle sur astrocytes WT GFAP-positifs, mais le manque de liaison aux astrocytes en culture de souris NCAM KO. Ce chiffre a été modifié depuis J. Neurochem. ^15. B. glie mixtes ont été cultivées de manière identique , comme décrit sous A. et traités pendant la nuit avec endoneuraminidase-NF (aimablement fourni par le Dr Martina Muehlenhoff) ou le contrôle PBS. Les cellules ont été marquées en direct sur la glace avec HIgM12 (vert) et ensuite colorées pour les marqueurs GFAP interne (rouge) et DAPI (bleu). HIgM12 cible les antigènes de surface cellulaire sur PBS-contrôle traités cultures gliales mixtes mais pas endoneuraminidase-NF traités glie mixte. Ce chiffre a été modifié depuis JNSCI ^16. Plfacilité cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Toutes les images ont été prises à 60X grossissement en utilisant les mêmes réglages de l'appareil et traitées de manière identique.

Tableau 1:. Buffer et Solution Recettes S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

	tissu du SNC	ENDO-NF / PBS	Le tampon de lyse	Volume total
1. WT souris	67 ug (0,45 ul)	2 ul (12 ug) ENDO-NF	7,55 pi	10 ul
2. WT souris	67 ug (0,45 ul)	2 pl de PBS	7,55 pi	10 ul
3. WT souris	67 ug (0,45 ul)	pas de PBS ou ENDO-NF	9,55 pi	10 ul
4. NCAM souris KO	67 ug (0,45 ul)	2 ul (12 ug) ENDO-NF	7,55 pi	10 ul
5. NCAM souris KO	67 ug (0,45 ul)	2 pl de PBS	7,55 pi	10 ul
6. NCAM souris KO	67 ug (0,45 ul)	pas de PBS ou ENDO-NF	9,55 pi	10 ul

Tableau 2: ENDO-NF digestion du tissu du SNC de souris P7 WT et NCAM KO.

Discussion

Autoanticorps IgM naturelles humaines sont attrayants pour les candidats immunothérapies et ont démontré un potentiel thérapeutique pour le traitement de diverses maladies , y compris le cancer et les troubles du SNC ^1-7. Avantageusement, ces anticorps ne sont pas provoquer une réponse immunitaire dans lequel la génération d'anticorps neutralisants réduit considérablement la dose thérapeutique efficace et l'efficacité. Surtout, tous les anticorps ayant un potentiel thérapeutique ont été de l'isotype IgM et appartiennent au répertoire NAb ^{3-5,8,9,37,40,42-45.} Un obstacle majeur à l'application clinique potentielle des anticorps IgM est l'identification de leurs antigènes, qui sont indéterminés dans de nombreux cas. Les techniques standard utilisées pour les anticorps IgG ne sont souvent pas applicable pour identifier l'antigène d'un IgM.

Ce protocole décrit la détermination de PSA-NCAM comme antigène pour l'anticorps IgM humaine de régénération HIgM12, efficace dans des modèles animauxde la SP et la SLA ^15-18. La méthodologie utilisée est principalement applicable à tous les anticorps humains avec des chaînes légères Vk spécifiques VκI, VκIII et VκIV et des anticorps de souris avec des chaînes légères VκI, quel que soit le isotype de l'anticorps.

L'étape la plus critique de ce protocole est l'utilisation d'anticorps IgM dans des applications de Chromatographie d'affinité. Plus précisément, les anticorps retenus doivent agir en tant qu'agents pull-down dans immunoprécipitations d'isoler ou d'enrichir un antigène de tissu ou de culture cellulaire lysats complexes. Les fractions enrichies de l'antigène peuvent être comparés à des immunoprécipitations provenant d'anticorps de contrôle d'isotype et analysés par la suite les différences par spectrométrie de masse. Une exigence ou la limitation de cette étape essentielle est la présence de l'anticorps correcte Vk chaîne légère et l'hôte (humain, souris) pour permettre la liaison à la protéine L agarose anticorps. L'utilisation de la protéine de liaison au mannane lié à agarose (également callelectine d liant le mannose) au lieu de la protéine L agarose est une alternative potentielle à immunoprécipiter IgM sans chaînes spécifiques de lumière Vk. Cependant, comme indiqué par Arnold et al. , ^35, IgM lié à l' antigène ne se lient pas à la protéine de liaison au mannane, comme les glycanes cibles semblent devenir inaccessibles une fois que l'IgM est lié à son antigène. Sur la base de ces résultats mannane protéine ne peut pas être utilisée comme matrice de liaison à immunoprécipiter un antigène chargé par les molécules d' IgM ^35. D' autres solutions de rechange potentielles pourraient être l'utilisation d'agarose lié des anticorps anti-IgM IgG secondaires ^46,47 ou utilisation de billes magnétiques activées en surface ^48. Les anticorps IgG dirigés contre les IgM peuvent être réticulés chimiquement à de l'agarose ou un agarose G dans le but de réduire l'ampleur de l'anticorps élue conjointement avec l'antigène d'intérêt. Une comparaison valable entre les différentes variantes de immunoprécipitation IgM par rapport à des antigènes identifiés avec succès is difficile parce que la plupart des immunoprécipitations ont été effectuées pour isoler ou épuiser les IgM sans intérêt pour leurs antigènes. En outre, les immunoprécipitations utilisant IgM ont été principalement utilisés pour confirmer un seul antigène déjà connu ou attendu avec une exposition d'anticorps à des antigènes purifiés ^49. Un inconvénient d'IgG d'agarose couplées à l' encontre IgM humaine est un très faible rendement (10-15%) des molécules d' IgM sériques immunoprécipité par rapport à la matière de départ ^50. En revanche, les billes magnétiques activées en surface ont été appliqués avec succès à des anticorps de différents isotypes IgM , y compris pour immunoprécipiter fibrilles associées à la tremblante ^48. Ce procédé ne se limite pas à kappa spécifique (Vk) ou lambda (λ) des chaînes ou d'un hôte particulier et peut sensiblement élargir le spectre d'anticorps IgM utilisés dans les immunoprécipitations.

Une autre étape importante dans le protocole est la capacité de l'anticorps à fonctionner en tant que detète anticorps (anticorps primaire) dans Western blots ou d'autres plates-formes de dépistage. des anticorps choisis doivent cibler leur antigène avec une affinité suffisamment élevée pour permettre la liaison d'antigène, en présence de détergents non ioniques ou éventuellement ioniques. anticorps de haute affinité sont fréquents chez les anticorps IgG affinité maturée, mais moins fréquent chez les anticorps de l'isotype IgM, qui est l'une des raisons pour lesquelles il y a relativement peu d'anticorps IgM disponibles dans le commerce en tant qu'agents de détection dans les paramètres biochimiques. Haute affinité de liaison des anticorps est une exigence pour les immunoprécipitations d'antigènes moléculaires et pour le transfert de Western. Abaisser les concentrations de détergent ou de l'absence totale de détergents dans des tampons IP et les tampons de lyse permet à l'antigène cible par des anticorps de faible affinité via son domaine Fab. En revanche, la capacité de l'anticorps à la protéine cible d'agarose L par l'intermédiaire de sa partie Fc est substantiellement pas affectée chez les témoins isotypiques sur une gamme de différentes concen détergentestrations. Toutefois, une faible concentration de détergent dans le tampon de lyse et un tampon IP empêche la perturbation de la membrane cellulaire et à l'isolement de molécules spécifiques. De même, une faible concentration de détergent dans Western blot tampons de lavage (par exemple, PBS-T) permet la liaison des anticorps de faible affinité antigène , mais en même temps augmente la liaison non spécifique et est donc pas une option.

La présence d'un noyau de protéine d'antigène est une autre exigence pour cette méthode. Les protéines avec des modifications post - traductionnelles (par exemple, les glycoprotéines, les lipoprotéines) et des protéines non modifiées, mais pas les lipides ou les glucides seuls, sont détectables dans les Western blots. Il est impossible d'immunoprécipiter des lipides (par exemple, des sphingolipides) à partir de lysats de tissus ou de cellules en présence ou en l' absence de détergents. Les propriétés physico-chimiques des détergents et des lipides sont trop similaires pour permettre des interactions lipide-anticorps sélectifs, alors que dans le même temps les détergents sont essentiels pour perturberLes membranes de manière à permettre l'isolement sélectif de molécules spécifiques. À notre connaissance, seul immunoprécipitations comprenant des hydrates de carbone, en l'absence d'un noyau de protéine, n'a pas été précédemment rapporté. Cela devient particulièrement pertinent parce que les anticorps IgM ciblent fréquemment des glucides et des glycolipides, qui ne sont pas nécessairement liés à une unité de protéines. D'autres techniques chromatographiques sont nécessaires pour la séparation et l'identification immunologique des lipides et des hydrates de carbone en l'absence d'un noyau de protéine. Par exemple, la Chromatographie sur couche mince (CCM) des lipides cellulaires avec la détection d'anticorps ultérieure sur la plaque de CCM (Chromatographie sur couche mince immuno-) peut être mis en œuvre ^51,52.

D'autres anticorps anti-PSA ont été décrits dans des études antérieures et les résultats ont été comparés avec HIgM12 ainsi que disponible dans le commerce anti-PSA IgM (clone 2-2B). L'anticorps le plus couramment utilisé dans le domaine de PSA est un anticorps IgG (clone 735) disponible en tant que Monoc de la sourisun anticorps polyclonal de lapin lonal ou ^53. Cet anticorps IgG anti-PSA PSA détecte le SynCAM et NCAM sur différents types de cellules du système nerveux central incluant les cellules microgliales ^41. Par contraste avec l'anticorps anti-PSA IgG, IgM humains HIgM12, HIgM42 et l'anticorps anti-PSA IgM de souris (clone 2-2B) ne sont pas capables de cibler le PSA SynCAM (mais NCAM) à divers stades embryonnaires et post-natales précoces chez des souris , tandis que SynCAM non polysialylés est facilement détectable ^15. Les anticorps IgM utilisés sont également pas en mesure de détecter PSA sur les cellules microgliales (figures 3 + 4). Une explication possible pour les différences observées entre les isotypes d'anticorps peuvent être des niveaux de PSA-SynCAM bas par rapport aux niveaux de PSA-NCAM combiné avec l'affinité de liaison potentiellement plus faible d'anticorps IgM par rapport à l'IgG anti-PSA. Pour tester cette hypothèse, nous avons effectué des immunoprécipitations chez les animaux NCAM KO au stade embryonnaire E17 avec de vastes quantités de SynCAM présent et utilisé HIgM12 comme un «agent pull-down" ^{15. Dans littermate E17 WT commande le HIgM12 immunoprécipitée PSA-NCAM dans une mesure qui a montré des intensités similaires de la «tirée vers le bas" PSA-NCAM par rapport à la chaîne lourde IgM telle que détectée par densitométrie en Western Blot ultérieure en utilisant des antigènes élués. Ce résultat a suggéré au moins une affinité suffisante de HIgM12 à son PSA cible. Contrairement à WT littermate contrôle HIgM12 n'a pas détecté PSA attaché à SynCAM chez les animaux NCAM KO. Des résultats identiques ont été obtenus en utilisant des immunoprécipitations anti-PSA HIgM42 IgM humaine. HIgM12 et HIgM42, ainsi que la souris anti-PSA IgM (clone 2-2B) ont été incapables de cibler PSA sur SynCAM en Western blots de WT et NCAM KO animaux à des stades de développement embryonnaire et postnatal. Compte tenu de la faible quantité de HIgM12 requise (0,1 pg / ml) pour détecter spécifiquement PSA attaché à la NCAM dans des Western blots en utilisant de petites quantités de tissu du système nerveux central (SNC 0,1 ug de tissu par puits) , 15 il semble peu probable que de faibles affinités seulesresponsable de l'absence totale de détection PSA-SynCAM par HIgM12 dans trois méthodes différentes.}

Nous concluons qu'il existe des différences significatives entre les anticorps anti-PSA IgM et l'anticorps anti-PSA IgG fréquemment publié (clone 735). On ne sait pas pourquoi les anticorps anti-PSA IgM disponibles dans le commerce ne sont pas utilisés plus fréquemment dans le passé pour confirmer les résultats obtenus avec antiPSA anticorps IgG 735. Ceci est particulièrement intéressant parce HIgM12 a déjà prouvé leur efficacité dans des modèles de maladies différentes. Alors que d'autres anticorps anti-PSA IgM peuvent avoir des effets thérapeutiques similaires, il reste difficile de savoir si l'anticorps anti-PSA IgG (clone 735) a un résultat thérapeutique similaire dans les modèles de sclérose en plaques et la SLA.

En bref, les méthodes décrites ici ont été principalement utilisés pour identifier l'antigène des HIgM12 d'anticorps humains régénératrices pour soutenir les essais cliniques potentiels pour MS et éventuellement d'autres maladies neurodégénératives. L'identification des fourmisigens pour les anticorps ayant une activité biologique est l'étape comme essentielle pour comprendre leur mécanisme d'action. Cela devient particulièrement pertinent dans le contexte de nombreux anticorps monoclonaux actuellement testés pour la sécurité et l'efficacité dans des essais humains. Alors que le nombre d'anticorps IgM cliniquement testés à ce jour est faible, les progrès récents dans la technologie des hybridomes ainsi qu'un nombre croissant d'études mettant en évidence le potentiel thérapeutique de cette classe d'anticorps ^{1-10,37,40,42-45} exhorte le développement de nouvelles ou méthodes modifiées applicables à identifier les antigènes IgM non protéiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Fisher Scientific	MT-10-013-CVRF	Glycémie élevée, avec glutamine, avec pyruvate de sodium, 500 ml
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml, L-glutamine, pyruvate de sodium, haute teneur
en glucose Pénicilline-Streptomycine	Life Technologies	15140-122	10 000 U/ml, 100 ml
Supplément N-2 (100x)	Life Technologies	17502-048	5 ml
B-27 Supplement (50x)	Life Technologies	17504-044	sans sérum, 10 ml
Sérum fœtal bovin - Optima	Atlanta Biologicals	S12450	500 ml
Eau stérile pour l’irrigation	Baxter Healthcare	#2F7114	USP-1 000 ml, 12/CA
Bromhydrate de poly-D-lysine	Sigma	P7886-50MG	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · ; xHBr, poids moléculaire 30 000-70 000 g/mol, 50 mg
d’albumine sérique bovine fraction V	Sigma	A-3294-100G	, fraction de choc thermique, sans protéase, pH 7, pureté 98 %, 100 g
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767-500G	C6H12O6, Poids moléculaire : 180,16 g/mol, réactif ACS, 500 g
de trypsine du pancréas bovin	Sigma	T9935-100mg	essentiellement sans sel, poudre lyophilisée, 9 000 unités BAEE/mg
de protéine désoxyribonucléase I du pancréas bovin Sigma		D5025-150KU	Type IV, poudre lyophilisée, 2 000 unités Kunitz/mg de protéine
de rat recombinant FGF basic Protein	R& D systems	3339-FB-025	BSA en tant que protéine porteuse, 25 µ ; g, lyophilisé, > 95 %, 16,2 kDa
& Protéine de rat recombinant PDGF-AA	D systems	1055-AA-50	sans porteur, 50 µ ; g, lyophilisé, > 97 %, E. coli-dérivé, 12,5 kDa
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 ml, sans glutamine, sans acide aspartique, sans acide glutamique
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148-1KG	cristallin, 1 kg, qualité réactif, poids moléculaire 30,03 g/mol (sous forme de monomère)
Tris[hydroxyméthyl]aminométhane (Tris bas	Biorad	#1610719	1 kg, 99,8 % pur, poudre
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Biorad	#1610302	1 kg, poudre
Glycine	Fisher Scientific	BP-381-5	C2H5NO2, Poids moléculaire : 75,07 g/mol, Poudre cristalline blanche, 5 kg
Chlorure de sodium	Sigma	S7653-5KG	NaCl, Poids moléculaire : 58,44 g/mol, 5 kg
de phosphate de sodium monobasique	Sigma	S0751-500G	NaH2PO4, Poids moléculaire : 119,98 g/mol, 500 g
Solution tamponnée au phosphate 1x (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	sans calcium ni magnésium, 6 x 500 ml
Falcon 60 mm TC-treated TC-Culture Dish	Corning Life Sciences	#353002	Boîte de culture cellulaire de 60 mm, polystyrène traité TC, 20/paquet, stérile
Boîte de Pétri Falcon 60 mm x 15 mm	Corning Life Sciences	#351007	Boîte de Pétri bactériologique non traitée TC, 20/paquet
Plaques de culture cellulaire à 6 puits	Corning Costar	CLS3516	6 puits, fond plat (emballé individuellement), irradié aux rayons gamma, surface de croissance 9,5 c
75 cm² ; flacon de culture tissulaire	Corning Life Sciences	430720U	75 cm² ; Fiole de culture cellulaire à col incliné en forme de U avec bouchon d’étanchéité
Pierce & commerce ; Protéine L Plus Agarose	ThermoFisher Scientific	#20520	2 ml, réticulé 6 % agarose perlée (CL-6B), capacité de liaison : 10 à 20 mg IgG
4 - 20 % Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	456-1094	10 puits, 50 & micro ; l, pour une utilisation avec les cellules d’électrophorèse Mini-PROTEAN
Immobilon-P Membrane	Millipore	IPVH00010	PVDF, 0,45 & micro ; m, rouleau de 26,5 cm x 3,75 m
Anticorps anti-acide polysialique-NCAM, clone	Millipore	MAB5324	50 microlitres, Hôte : souris, monoclonal IgM
4x Laemmli Sample Buffer	Biorad	#1610747	10 ml, 4x tampon d’échantillon de protéines prémélangées
2-mercaptoethanol	Biorad	#1610710	25 ml, 98 % pur, 14,2 M
Endoneuraminidase-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50 microlitres, 200 & micro ; g/ml, 3 500 U/mg
Lamelles de verre de 25 mm	Fisher Scientific	12-545-102	Cercles n° 1 ; Epaisseur : 0,13 à 0,17 mm ; Taille : 25 mm
HEPES solution tampon	ThermoFisher Scientific	15630-080	100 ml, 1 M
Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	500 ml, sans calcium, magnésium, phénol rouge
Papaïne	Worthington Coopération biochimique	LS003119	poudre lyophilisée, 100 mg
Magnesiumsulfate	Sigma	M-2643-500G	poudre, 500 g
de L-Glutamine	Gibco	#25030-081	100 ml, 200 mM  ;