La visualisation de la surface captif grande molécules d'ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

Summary

Nous présentons une approche pour visualiser de grandes molécules d’ADN colorées par des peptides de liaison à l’ADN de protéines fluorescentes (FP-DBP) attachées sur la surface de verre recouverte de polyéthylène glycol (PEG) et d’avidine et étirées avec des écoulements de cisaillement microfluidique.

Abstract

Les grandes molécules d’ADN attachées à la surface du verre fonctionnalisé ont été utilisées en physique des polymères et en biochimie, en particulier pour étudier les interactions entre l’ADN et ses protéines de liaison. Ici, nous rapportons une méthode qui utilise la microscopie fluorescente pour visualiser de grandes molécules d’ADN attachées à la surface. Tout d’abord, les lamelles en verre sont biotinylées et passivées par revêtement de polyéthylène glycol biotinylé, qui se lie spécifiquement à l’ADN biotinylé via des liants protéiques d’avidine et réduit considérablement la liaison indésirable due à des interactions non spécifiques de protéines ou de molécules d’ADN à la surface. Deuxièmement, les molécules d’ADN sont biotinylées par deux méthodes différentes en fonction de leurs terminaisons. L’ADN à extrémité émoussée est marqué avec du dUTP biotinylé à son extrémité hydroxyle 3', par la transférase terminale, tandis que l’ADN à extrémité collante est hybridé avec des oligonucléotides complémentaires biotinylés par l’ADN ligase. Enfin, un écoulement de cisaillement microfluidique fait étirer des molécules d’ADN uniques sur toute leur longueur après avoir été colorées avec un peptide de liaison protéine-ADN fluorescent (FP-DBP).

Introduction

Visualisation de grandes molécules d'ADN attachés sur des surfaces de verre ou de perles a été utilisé pour étudier les interactions ADN-protéine, la dynamique des protéines sur le substrat d'ADN, de ^1,2 et la physique des polymères ^3,4 . Une plate - forme unique asservies de grandes molécules d'ADN a peu distincte avantages par rapport à d' autres méthodes d' ADN d'immobilisation. ⁵ d' abord, une grande molécule d'ADN attaché à la surface a une naturelle conformation aléatoire bobine sans un flux de cisaillement, ce qui est très important pour une protéine de liaison à l' ADN à reconnaître son site de liaison. En second lieu, il est très facile de changer l'environnement chimique dans les molécules d'ADN d'une série de réactions enzymatiques dans une chambre d'écoulement. En troisième lieu , un flux de cisaillement induit microfluidique ADN moléculaire d' étirage allant jusqu'à 100% de la longueur totale du contour, ce qui est très difficile à réaliser en utilisant les autres élongation d'ADN approches telles que l' immobilisation de la surface de confinement ⁶ et nanocanal. ⁷ Une entièrement stretched molécule d'ADN contient également des informations de position qui peuvent être utiles pour surveiller les mouvements enzymatiques sur la carte génomique.

Néanmoins, l'approche de l'ADN d'attache a une lacune critique en ce que le intercalant colorant tel que YOYO-1 provoque généralement des molécules d'ADN attachés à être facilement brisées par la lumière d'excitation de fluorescence. En règle générale, les grandes molécules d'ADN doivent être colorées avec un colorant fluorescent pour la visualisation sous un microscope à fluorescence. A cet effet, YOYO-1 ou d' autres colorants de la série de TOTO sont principalement utilisés parce que ces colorants fluorescents seulement quand ils intercalent ADN double brin. ⁸ Cependant, il est bien connu que les bis-intercalation colorant provoque l' ADN induite par la lumière photo-clivage parce de l'intercalation de fluorophores. ⁹ en outre, les molécules d'ADN colorées par fluorescence attachés à la surface sont plus fragiles car les flux de cisaillement peuvent exercer des forces de rupture se déplacer librement sur ​​des molécules d'ADN. Par conséquent, nous avons développé FP-DBP comme un roman DNA-coloration des protéines de colorant pour former une image de grandes molécules d'ADN attachés à la surface. L'avantage de l' utilisation de FP-DBP est qu'il ne provoque pas de photo-clivage des molécules d'ADN auquel il se lie. ¹⁰ En outre, FP-DBP ne pas augmenter la longueur du contour de l' ADN, tandis que les bis-colorants intercalants augmentent la longueur du contour d'environ 33%.

Cette méthode vidéo présente l'approche expérimentale pour attacher les grandes molécules d'ADN sur une surface PEG-biotine. La figure 1 illustre les différentes approches de attacher l' ADN avec des extrémités franches et des extrémités cohésives. Ainsi, cette méthode de coloration peut être appliquée à tout type de molécule d'ADN. La figure 2 illustre une représentation schématique de l'ensemble de chambre de débit qui peut être commandé par une pompe à seringue pour générer des flux de cisaillement pour étirer les molécules d'ADN ainsi que pour charger chimique et enzymatique des solutions. la figure 3 montre des micrographies de molécules d'ADN complètement étirées attachés sur la PEGylatsurface ed ¹¹ et colorées avec FP-DBP.

Protocol

1. ADN biotinylation

1. Biotinylation d'ADN à extrémités franches en utilisant Terminal transférase (TdT)
   Remarque: L'utilisation d'ADN T4 (166 kpb), qui est un ADN à extrémités franches.
   1. Ajouter 5 ul de 2,5 mM _CoCl2, 5 pi de 10 x tampon de réaction, 0,5 pi de 10 mM de biotine-11-dUTP, 0,5 ul d' une transferase terminale (10 unités) et 0,5 pi de T4 ADN (0,5 pg / pl) au mélange réactionnel. Faire un volume final de 50 ul en ajoutant 38,5 pi d'eau.
   2. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 1 heure.
      Remarque: le temps de réaction prolongée peut donner l' ADN double-tethered, à savoir, il est possible que biotine sont marquées aux deux extrémités.
   3. Arrêter la réaction en ajoutant 5 ul d'EDTA 0,5 M pH 8.
   4. Garder le tube à 4 ° C.
2. Biotinylation de l' ADN à extrémité collante utilisant l' ADN ligase
   Remarque: L'utilisation de l'ADN (48,5 kbp), qui est un ADN collant fin.
   1. Ajouter 1 pi de ligase d'ADN T4, 5 pi de 10 x tampon de ligature, 1 pl de 25 ng / ul d'ADN de phage λ et ajouter 43 ul d'eau pour obtenir un volume final de 50 ul.
   2. Garder le tube à 4 ° C.

2. fonctionnalisés dérivatisation de surface

. Remarque: Afin d'attacher une extrémité d'une molécule d'ADN sur une surface de verre, un groupe amine primaire est silanisée sur une lamelle couvre -objet, suivie par un revêtement de biotine-PEG comme représenté sur la figure 1 Ce processus de pégylation est important pour l' imagerie d'ADN simple molécule parce qu'il peut diminuer de façon significative le bruit aléatoire créé par l'attachement des molécules indésirables sur la surface.

1. Piranha Nettoyage
   Remarque: Les solutions Piranha réagissent vigoureusement avec des matières organiques, il doit donc être manipulé avec soin, en suivant les directives de sécurité appropriées.
   1. Lieu sur un lamelles de polytétrafluoroéthylène (PTFE) rack, et maintenez-les by PTFE Ruban d'étanchéité de fil de la longueur, la moitié sur le bord des surfaces et à moitié sur le rack. Après emballage, laisser une pièce longue (environ 5 cm) de bande pour manipuler la crémaillère pendant l'opération de nettoyage.
   2. Remplir un bécher de 1 L en verre avec 350 ml de H ₂ SO ₄ et 150 ml de H ₂ O ₂ pour rendre la solution piranha dans une hotte. Placer la grille dans une solution piranha pendant 2 heures.
   3. solution Empty piranha du bêcher, et des lamelles de rinçage avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que le pH de l'eau dans le bécher atteint neutre. Utiliser des bandes de papier pH.
   4. Soniquer les grilles de lamelles de couverture dans le bécher contenant de l'eau, pendant 30 min. Vider l'eau du bécher juste avant amino silanisation. Utiliser 75 W de puissance de traitement par ultrasons pour nettoyer et transformer en dérivés des substrats en verre.
2. Aminosilanization sur verre Surface
   1. Ajouter 2 ml de N - [3- (triméthoxysilyl) propyl] éthylènediamine et 10 ml d'acide acétique glacial à 200 mld'alcool méthylique dans un récipient en polypropylene propre pour préparer la solution de aminosilanization.
   2. Placer les lamelles nettoyées dans le récipient de polypropylène. Secouez à 100 rpm et la température ambiante pendant 30 min.
   3. Soniquer le bécher avec des lamelles dérivatisés pendant 15 min à 75 W. Secouez eux à 100 tours par minute et la température ambiante pendant au moins 30 min.
   4. Vider la solution dans le bêcher, puis rincer soigneusement les lamelles, une fois avec de l'alcool méthylique, et deux fois avec de l'alcool éthylique. des lamelles de Stocker dans l'alcool éthylique et les utiliser dans les deux semaines.
3. La PEGylation de la lamelle
   1. Faire 10 ml de 0,1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO _3). On filtre la solution avec un filtre à seringue de 0,22 um.
   2. Dissoudre 2 mg de carbonate biotine-PEG-succinimidyle (biotine-PEG-SC) et 80 mg de PEG-succinimidyle valérate (mPEG-SVG) dans 350 pi de NaHCO _3. Utilisez un tube de protection contre la lumière.
   3. Vortex vigoureusement le tube pendant 10 sec, et centrifuger à 10000 × g pendant 1 min pour éliminer les bulles.
   4. Rincer une lame de verre avec de l'acétone, suivie d'un rinçage à l'alcool éthylique. Laisser la lame sécher à l'air complètement.
   5. Déposer une goutte (50 pi) de solution PEG sur la lame de verre propre. Couvrir la gouttelette doucement avec un amino silanisé lamelle, sans générer de bulles.
   6. Placer les lames pendant 3 heures pour la nuit dans un endroit sombre, bien nivelées chambre humide à température ambiante. Utilisez un support de pointe de la pipette vide comme la chambre, avec de l'eau au fond. Sceller solution résiduelle PEG dans le tube et le maintenir à 4 ° C.
   7. Rincer la lamelle pégylé abondamment avec de l'eau déminéralisée. Conservez-la dans un endroit sombre et sec jusqu'à utilisation.

3. Assembler une chambre de débit

1. Fabriquer un support acrylique perforé, comme sur la figure 2. Assurez -vous que le diamètre de l'insert de tube est de 0,762 mm, et de désigner un trou est un orifice d' entrée et l'autre estune sortie (Figure 2).
2. Placer double face collant des bandes de ruban (largeur de 5-6 mm) sur un support acrylique (figure 2), perpendiculairement à l' alignement d' un trou d'entrée et de sortie, sans perturber les trous de canal. Utilisez ces bandes de ruban comme des murs multi-canaux pour faire des chambres. Frotter la bande à l'aide d'une pointe de pipette.
3. Placez une lamelle pégylé sur le dessus pour faire des chambres d'écoulement, avec le côté pégylé facedown.
4. Pour éviter toute solution de fuir, appuyez sur le sommet d'une lamelle sur la zone où les bandes double face sont placés. Ajouter de la colle époxy à séchage rapide pour fermer les bords de la chambre en haut et en bas (de couleur jaune dans la figure 2).
5. Connectez une courte pièce (2,5 cm) d'un tube (diamètre extérieur, OD, 0,042 ") à une seringue étanche aux gaz et sceller le joint avec de la colle époxy.
6. Connecter un long tube flexible (DO: 0,03 ") pour le tube relié à la seringue et l'étanchéité du joint avec de la colle époxy.
7. Remplissez le tubing liée à la seringue avec de l'eau DI. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air.
8. Insérer le tube dans le trou de la chambre d'écoulement scellée avec de la colle époxy.
9. Placez une pointe jaune (200 pi pointe) de l'autre trou comme un réservoir.

4. Echantillon Chargement en chambre de débit

Remarque: neutravidine peut être remplacée par d'autres protéines telles que l'avidine streptavidine. Toutes les réactions peuvent être effectuées à la température ambiante, à moins qu'elle ne soit mentionnée. Prenez solution d'échantillon dans une pointe jaune, et installer la pointe avec la solution sur le trou du support acrylique (Figure 2b).

1. Régler le débit de la pompe de la seringue d'écoulement à 50 pi / min. Charge 20 pi de protéine avidine (25 ug / ml dans une solution T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8) et la maintenir pendant 10 minutes.
2. Charge 20 pi de oligodésoxynucléotides biotinylé (100 uM dans 1 x TE), et le garder pendant 10 min. Si transférase terminal est utilisé, passez le chargementdes oligodésoxynucléotides.
3. Charge 20 pi de solution d'ADN de l'étape 1 dans la chambre d'écoulement à un débit de 10 ul / min, et le garder pendant 30 min.
4. Laver la chambre d'écoulement avec 1 x TE et on charge 40 pi de FP-DBP ¹⁰ (~ 80 nM).
5. ADN observer au microscope à fluorescence avec un écoulement continu des molécules de coloration dans 1 x TE à un objectif 60X. Utilisez 488 nm laser à état solide pour l'excitation de FP (eGFP) -dbp. Pour la pleine étendue de molécules d'ADN, appliquer des débits différents en fonction des longueurs d'ADN utilisées. Par exemple, appliquer 50 pl / min 48,5 kbp d'ADN λ, et 100 pi / min pour 166 kbp de T4 ADN.
   1. Pour le recyclage du support acrylique, trempez chambres d'écoulement assemblés dans une solution de détergent ménager ^12. Retirer les bandes et les époxy avec une lame de rasoir et frotter avec les mains pour prendre complètement les. Déboucher les trous avec des aiguilles de seringues. Gardez les supports dans de l'eau déminéralisée jusqu'à utilisation ultérieure.

Results

La figure 1 montre deux méthodes d' ADN d'attache différentes en fonction des structures terminales de la molécule d'ADN. La figure 1a montre comment les molécules d'ADN à extrémités cohésives sont hybridés avec des oligonucléotides biotinylés complémentaires, qui sont immobilisés sur la surface de PEG revêtues d' avidine. La figure 1b montre l'addition de biotinylé ddNTP ou dNTP à un groupe hydroxyle 3 'd'un ADN à extrémités franches pa...

Discussion

Ici, nous présentons une plate-forme de visualisation de longues molécules d'ADN biotinylées pour l'ancrage sur les surfaces. Nous avons rapporté une approche pour les molécules d'ADN attachés sur une surface protéine avidine revêtue d'biotinylé sérum - albumine bovine. ⁶ Dans la première approche, nous avons trouvé un problème crucial de l' ADN photo-clivage provoqué par les colorants bis-intercalation qui tachent les molécules d'ADN attaché sur la surface. Etant donné que ces fluorop...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Biotinylation de l’ADN
1.1) Biotinylation de l’ADN émoussé à l’aide de la transférase terminale (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Fourni avec un tampon de réaction 10x, 2,5 mM de chlorure de cobalt
Biotine-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP est également disponible
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation de l’ADN collant à l’aide de l’ADN Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Fourni avec un tampon de réaction 10x
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Également disponible chez New England Biolabs
2. Dérivatisation de surface fonctionnalisée
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior 0101050		22 mm x 22 mm, n° 1 Épaisseur
téflon			Fabrication sur mesure
Ruban d’étanchéité de fil PTFE	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Téflon&Ruban commercial
Acide sulfurique	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, pureté à 95 %
Peroxyde d’hydrogène	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35 % dans l’eau
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Nettoyeur
2.2) Aminosilanisation sur surface en verre
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] éthylènediamine	Sigma-Aldrich	104884
Acide acétique glacial	Duksan Chemicals	414	Pureté à 99 %
Alcool méthylique	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	de pureté 99,9 %
	Qorpak	PLC-04907
Alcool éthylique	Jin Chemical Co., Ltd.	A300202	99,9 % de pureté
2.3) PEGylation de la lamelle
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Seringue Filter	Sartorius	16534----------K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acétone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	d’une pureté de 99 %
	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1  ; mm
3. Assemblage d’une chambre d’écoulement
Support			Fabrication sur mesure
Ruban adhésif double face	3M		Type
transparent Époxy à séchage rapide
	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Étanche aux gaz 250 & micro ; l Seringue	Hamilton	81165
Pompe à seringue	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Chargement de l’échantillon dans la chambre d’écoulement
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Base Tris	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	base Trizma
Olympus		IX70
EMCCD Caméra	Q Imaging	Rolera EM-C2
Laser à semi-conducteurs (488  ; nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.