Name: La visualisation de la surface captif grande molécules dADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez la visualisation de grandes molécules d'ADN marquées avec des peptides de liaison fluorescents sur des surfaces de verre modifiées. Cette méthode microfluidique permet d'étirer et d'observer l'ADN en mouvement en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par la bourse de recherche de l’Université Sogang de 201410036.

1. ADN biotinylation <ol><li> Biotinylation d&#39;ADN à extrémités franches en utilisant Terminal transférase (TdT) Remarque: L&#39;utilisation d&#39;ADN T4 (166 kpb), qui est un ADN à extrémités franches. <ol><li> Ajouter 5 ul de 2,5 mM CoCl2, 5 pi de 10 x tampon de réaction, 0,5 pi de 10 mM de biotine-11-dUTP, 0,5 ul d&#39; une transferase terminale (10 unités) et 0,5 pi de T4 ADN (0,5 pg / pl) au mélange réactionnel. Faire un volume final de 50 ul en ajoutant 38,5 pi d&#39;eau. </li><li> Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: le temps de réaction prolongée peut donner l&#39; ADN double-tethered, à savoir, il est possible que biotine sont marquées aux deux extrémités. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 5 ul d&#39;EDTA 0,5 M pH 8. </li><li> Garder le tube à 4 ° C. </li></ol></li><li> Biotinylation de l&#39; ADN à extrémité collante utilisant l&#39; ADN ligase Remarque: L&#39;utilisation de l&#39;ADN (48,5 kbp), qui est un ADN collant fin. &lt;ol&gt; <li> Ajouter 1 pi de ligase d&#39;ADN T4, 5 pi de 10 x tampon de ligature, 1 pl de 25 ng / ul d&#39;ADN de phage λ et ajouter 43 ul d&#39;eau pour obtenir un volume final de 50 ul. </li><li> Garder le tube à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. fonctionnalisés dérivatisation de surface . Remarque: Afin d&#39;attacher une extrémité d&#39;une molécule d&#39;ADN sur une surface de verre, un groupe amine primaire est silanisée sur une lamelle couvre -objet, suivie par un revêtement de biotine-PEG comme représenté sur la figure 1 Ce processus de pégylation est important pour l&#39; imagerie d&#39;ADN simple molécule parce qu&#39;il peut diminuer de façon significative le bruit aléatoire créé par l&#39;attachement des molécules indésirables sur la surface. <ol><li> Piranha Nettoyage Remarque: Les solutions Piranha réagissent vigoureusement avec des matières organiques, il doit donc être manipulé avec soin, en suivant les directives de sécurité appropriées. <ol><li> Lieu sur un lamelles de polytétrafluoroéthylène (PTFE) rack, et maintenez-les by PTFE Ruban d&#39;étanchéité de fil de la longueur, la moitié sur le bord des surfaces et à moitié sur le rack. Après emballage, laisser une pièce longue (environ 5 cm) de bande pour manipuler la crémaillère pendant l&#39;opération de nettoyage. </li><li> Remplir un bécher de 1 L en verre avec 350 ml de H 2 SO 4 et 150 ml de H 2 O 2 pour rendre la solution piranha dans une hotte. Placer la grille dans une solution piranha pendant 2 heures. </li><li> solution Empty piranha du bêcher, et des lamelles de rinçage avec de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à ce que le pH de l&#39;eau dans le bécher atteint neutre. Utiliser des bandes de papier pH. </li><li> Soniquer les grilles de lamelles de couverture dans le bécher contenant de l&#39;eau, pendant 30 min. Vider l&#39;eau du bécher juste avant amino silanisation. Utiliser 75 W de puissance de traitement par ultrasons pour nettoyer et transformer en dérivés des substrats en verre. </li></ol></li><li> Aminosilanization sur verre Surface <ol><li> Ajouter 2 ml de N - [3- (triméthoxysilyl) propyl] éthylènediamine et 10 ml d&#39;acide acétique glacial à 200 mld&#39;alcool méthylique dans un récipient en polypropylene propre pour préparer la solution de aminosilanization. </li><li> Placer les lamelles nettoyées dans le récipient de polypropylène. Secouez à 100 rpm et la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Soniquer le bécher avec des lamelles dérivatisés pendant 15 min à 75 W. Secouez eux à 100 tours par minute et la température ambiante pendant au moins 30 min. </li><li> Vider la solution dans le bêcher, puis rincer soigneusement les lamelles, une fois avec de l&#39;alcool méthylique, et deux fois avec de l&#39;alcool éthylique. des lamelles de Stocker dans l&#39;alcool éthylique et les utiliser dans les deux semaines. </li></ol></li><li> La PEGylation de la lamelle <ol><li> Faire 10 ml de 0,1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO 3). On filtre la solution avec un filtre à seringue de 0,22 um. </li><li> Dissoudre 2 mg de carbonate biotine-PEG-succinimidyle (biotine-PEG-SC) et 80 mg de PEG-succinimidyle valérate (mPEG-SVG) dans 350 pi de NaHCO 3. Utilisez un tube de protection contre la lumière. </li><li> Vortex vigoureusement le tube pendant 10 sec, et centrifuger à 10000 × g pendant 1 min pour éliminer les bulles. </li><li> Rincer une lame de verre avec de l&#39;acétone, suivie d&#39;un rinçage à l&#39;alcool éthylique. Laisser la lame sécher à l&#39;air complètement. </li><li> Déposer une goutte (50 pi) de solution PEG sur la lame de verre propre. Couvrir la gouttelette doucement avec un amino silanisé lamelle, sans générer de bulles. </li><li> Placer les lames pendant 3 heures pour la nuit dans un endroit sombre, bien nivelées chambre humide à température ambiante. Utilisez un support de pointe de la pipette vide comme la chambre, avec de l&#39;eau au fond. Sceller solution résiduelle PEG dans le tube et le maintenir à 4 ° C. </li><li> Rincer la lamelle pégylé abondamment avec de l&#39;eau déminéralisée. Conservez-la dans un endroit sombre et sec jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li></ol> 3. Assembler une chambre de débit <ol><li> Fabriquer un support acrylique perforé, comme sur la figure 2. Assurez -vous que le diamètre de l&#39;insert de tube est de 0,762 mm, et de désigner un trou est un orifice d&#39; entrée et l&#39;autre estune sortie (Figure 2). </li><li> Placer double face collant des bandes de ruban (largeur de 5-6 mm) sur un support acrylique (figure 2), perpendiculairement à l&#39; alignement d&#39; un trou d&#39;entrée et de sortie, sans perturber les trous de canal. Utilisez ces bandes de ruban comme des murs multi-canaux pour faire des chambres. Frotter la bande à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette. </li><li> Placez une lamelle pégylé sur le dessus pour faire des chambres d&#39;écoulement, avec le côté pégylé facedown. </li><li> Pour éviter toute solution de fuir, appuyez sur le sommet d&#39;une lamelle sur la zone où les bandes double face sont placés. Ajouter de la colle époxy à séchage rapide pour fermer les bords de la chambre en haut et en bas (de couleur jaune dans la figure 2). </li><li> Connectez une courte pièce (2,5 cm) d&#39;un tube (diamètre extérieur, OD, 0,042 &quot;) à une seringue étanche aux gaz et sceller le joint avec de la colle époxy. </li><li> Connecter un long tube flexible (DO: 0,03 &quot;) pour le tube relié à la seringue et l&#39;étanchéité du joint avec de la colle époxy. </li><li> Remplissez le tubing liée à la seringue avec de l&#39;eau DI. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air. </li><li> Insérer le tube dans le trou de la chambre d&#39;écoulement scellée avec de la colle époxy. </li><li> Placez une pointe jaune (200 pi pointe) de l&#39;autre trou comme un réservoir. </li></ol> 4. Echantillon Chargement en chambre de débit Remarque: neutravidine peut être remplacée par d&#39;autres protéines telles que l&#39;avidine streptavidine. Toutes les réactions peuvent être effectuées à la température ambiante, à moins qu&#39;elle ne soit mentionnée. Prenez solution d&#39;échantillon dans une pointe jaune, et installer la pointe avec la solution sur le trou du support acrylique (Figure 2b). <ol><li> Régler le débit de la pompe de la seringue d&#39;écoulement à 50 pi / min. Charge 20 pi de protéine avidine (25 ug / ml dans une solution T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8) et la maintenir pendant 10 minutes. </li><li> Charge 20 pi de oligodésoxynucléotides biotinylé (100 uM dans 1 x TE), et le garder pendant 10 min. Si transférase terminal est utilisé, passez le chargementdes oligodésoxynucléotides. </li><li> Charge 20 pi de solution d&#39;ADN de l&#39;étape 1 dans la chambre d&#39;écoulement à un débit de 10 ul / min, et le garder pendant 30 min. </li><li> Laver la chambre d&#39;écoulement avec 1 x TE et on charge 40 pi de FP-DBP 10 (~ 80 nM). </li><li> ADN observer au microscope à fluorescence avec un écoulement continu des molécules de coloration dans 1 x TE à un objectif 60X. Utilisez 488 nm laser à état solide pour l&#39;excitation de FP (eGFP) -dbp. Pour la pleine étendue de molécules d&#39;ADN, appliquer des débits différents en fonction des longueurs d&#39;ADN utilisées. Par exemple, appliquer 50 pl / min 48,5 kbp d&#39;ADN λ, et 100 pi / min pour 166 kbp de T4 ADN. <ol><li> Pour le recyclage du support acrylique, trempez chambres d&#39;écoulement assemblés dans une solution de détergent ménager 12. Retirer les bandes et les époxy avec une lame de rasoir et frotter avec les mains pour prendre complètement les. Déboucher les trous avec des aiguilles de seringues. Gardez les supports dans de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
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<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
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<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons une plate-forme de visualisation de longues molécules d&#39;ADN biotinylées pour l&#39;ancrage sur les surfaces. Nous avons rapporté une approche pour les molécules d&#39;ADN attachés sur une surface protéine avidine revêtue d&#39;biotinylé sérum - albumine bovine. 6 Dans la première approche, nous avons trouvé un problème crucial de l&#39; ADN photo-clivage provoqué par les colorants bis-intercalation qui tachent les molécules d&#39;ADN attaché sur la surface. Etant donné que ces fluorop...

Visualisation de grandes molécules d&#39;ADN attachés sur des surfaces de verre ou de perles a été utilisé pour étudier les interactions ADN-protéine, la dynamique des protéines sur le substrat d&#39;ADN, de 1,2 et la physique des polymères 3,4 . Une plate - forme unique asservies de grandes molécules d&#39;ADN a peu distincte avantages par rapport à d&#39; autres méthodes d&#39; ADN d&#39;immobilisation. 5 d&#39; abord, une grande molécule d&#39;ADN attaché à la surface a une naturelle conformation aléatoire bobine sans un flux de cisaillement, ce qui est très important pour une protéine de liaison à l&#39; ADN à reconnaître son site de liaison. En second lieu, il est très facile de changer l&#39;environnement chimique dans les molécules d&#39;ADN d&#39;une série de réactions enzymatiques dans une chambre d&#39;écoulement. En troisième lieu , un flux de cisaillement induit microfluidique ADN moléculaire d&#39; étirage allant jusqu&#39;à 100% de la longueur totale du contour, ce qui est très difficile à réaliser en utilisant les autres élongation d&#39;ADN approches telles que l&#39; immobilisation de la surface de confinement 6 et nanocanal. 7 Une entièrement stretched molécule d&#39;ADN contient également des informations de position qui peuvent être utiles pour surveiller les mouvements enzymatiques sur la carte génomique. Néanmoins, l&#39;approche de l&#39;ADN d&#39;attache a une lacune critique en ce que le intercalant colorant tel que YOYO-1 provoque généralement des molécules d&#39;ADN attachés à être facilement brisées par la lumière d&#39;excitation de fluorescence. En règle générale, les grandes molécules d&#39;ADN doivent être colorées avec un colorant fluorescent pour la visualisation sous un microscope à fluorescence. A cet effet, YOYO-1 ou d&#39; autres colorants de la série de TOTO sont principalement utilisés parce que ces colorants fluorescents seulement quand ils intercalent ADN double brin. 8 Cependant, il est bien connu que les bis-intercalation colorant provoque l&#39; ADN induite par la lumière photo-clivage parce de l&#39;intercalation de fluorophores. 9 en outre, les molécules d&#39;ADN colorées par fluorescence attachés à la surface sont plus fragiles car les flux de cisaillement peuvent exercer des forces de rupture se déplacer librement sur ​​des molécules d&#39;ADN. Par conséquent, nous avons développé FP-DBP comme un roman DNA-coloration des protéines de colorant pour former une image de grandes molécules d&#39;ADN attachés à la surface. L&#39;avantage de l&#39; utilisation de FP-DBP est qu&#39;il ne provoque pas de photo-clivage des molécules d&#39;ADN auquel il se lie. 10 En outre, FP-DBP ne pas augmenter la longueur du contour de l&#39; ADN, tandis que les bis-colorants intercalants augmentent la longueur du contour d&#39;environ 33%. Cette méthode vidéo présente l&#39;approche expérimentale pour attacher les grandes molécules d&#39;ADN sur une surface PEG-biotine. La figure 1 illustre les différentes approches de attacher l&#39; ADN avec des extrémités franches et des extrémités cohésives. Ainsi, cette méthode de coloration peut être appliquée à tout type de molécule d&#39;ADN. La figure 2 illustre une représentation schématique de l&#39;ensemble de chambre de débit qui peut être commandé par une pompe à seringue pour générer des flux de cisaillement pour étirer les molécules d&#39;ADN ainsi que pour charger chimique et enzymatique des solutions. la figure 3 montre des micrographies de molécules d&#39;ADN complètement étirées attachés sur la PEGylatsurface ed 11 et colorées avec FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Biotinylation de l’ADN</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Biotinylation de l’ADN émoussé à l’aide de la transférase terminale (TdT)</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Fourni avec un tampon de réaction 10x, 2,5 mM de chlorure de cobalt</td></tr><tr><td>Biotine-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP est également disponible</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">1.2) Biotinylation de l’ADN collant à l’aide de l’ADN Ligase</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Fourni avec un tampon de réaction 10x</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Également disponible chez New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4"><fort>2. Dérivatisation de surface fonctionnalisée </td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Piranha Cleaning</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior 0101050</td><td></td><td>22 mm x 22 mm, n° 1 Épaisseur</td></tr> Support <tr>en<td>téflon</td><td></td><td></td><td>Fabrication sur mesure</td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité de fil PTFE</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Téflon&Ruban commercial</td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H2SO4, pureté à 95 %</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H2O2, 35 % dans l’eau</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Nettoyeur</td></tr><tr> à ultrasons de table<td colspan="4">2.2) Aminosilanisation sur surface en verre</td></tr><tr><td>N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] éthylènediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>Pureté à 99 %</td></tr><tr><td>Alcool méthylique</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td> Récipient en polypropylène <td>de pureté 99,9 %</td></tr><tr><td></td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300202</td><td>99,9 % de pureté</td></tr><tr><td colspan="4">2.3) PEGylation de la lamelle</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td> lames de microscope <td>d’une pureté de 99 %</td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&nbsp ; mm</td></tr><tr><td colspan="4">3. Assemblage d’une chambre d’écoulement </solide></td></tr> <tr><td>Support</td><td></td><td></td> acrylique <td>Fabrication sur mesure</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td><td>3M</td><td></td><td>Type</td></tr><tr><td>transparent Époxy à séchage rapide</td><td></td> Tube en polyéthylène 3M <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Étanche aux gaz 250 & micro ; l Seringue</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>4. Chargement de l’échantillon dans la chambre d’écoulement </td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td> Microscope à <td>base Trizma</td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Caméra</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Laser à semi-conducteurs (488&nbsp ; nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la visualisation de la surface captif grande molécules d&#39;adn avec un adn fluorescent protein peptide de liaison

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Les grandes molécules d’ADN attachées à la surface du verre fonctionnalisé ont été utilisées en physique des polymères et en biochimie, en particulier pour étudier les interactions entre l’ADN et ses protéines de liaison. Ici, nous rapportons une méthode qui utilise la microscopie fluorescente pour visualiser de grandes molécules d’ADN attachées à la surface. Tout d’abord, les lamelles en verre sont biotinylées et passivées par revêtement de polyéthylène glycol biotinylé, qui se lie spécifiquement à l’ADN biotinylé via des liants protéiques d’avidine et réduit considérablement la liaison indésirable due à des interactions non spécifiques de protéines ou de molécules d’ADN à la surface. Deuxièmement, les molécules d’ADN sont biotinylées par deux méthodes différentes en fonction de leurs terminaisons. L’ADN à extrémité émoussée est marqué avec du dUTP biotinylé à son extrémité hydroxyle 3', par la transférase terminale, tandis que l’ADN à extrémité collante est hybridé avec des oligonucléotides complémentaires biotinylés par l’ADN ligase. Enfin, un écoulement de cisaillement microfluidique fait étirer des molécules d’ADN uniques sur toute leur longueur après avoir été colorées avec un peptide de liaison protéine-ADN fluorescent (FP-DBP).

La figure 1 montre deux méthodes d&#39; ADN d&#39;attache différentes en fonction des structures terminales de la molécule d&#39;ADN. La figure 1a montre comment les molécules d&#39;ADN à extrémités cohésives sont hybridés avec des oligonucléotides biotinylés complémentaires, qui sont immobilisés sur la surface de PEG revêtues d&#39; avidine. La figure 1b montre l&#39;addition de biotinylé ddNTP ou dNTP à un groupe hydroxyle 3 &#39;d&#39...

Nous présentons une approche pour visualiser de grandes molécules d’ADN colorées par des peptides de liaison à l’ADN de protéines fluorescentes (FP-DBP) attachées sur la surface de verre recouverte de polyéthylène glycol (PEG) et d’avidine et étirées avec des écoulements de cisaillement microfluidique.

La visualisation de la surface captif grande molécules d&#39;ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

L'objectif général de cette procédure est de concevoir un système pratique d'analyse d'ADN pour microscope épifluorescent, afin de manipuler des molécules d'ADN uniques sur des surfaces de verre modifiées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la visualisation de l'ADN, notamment lors de l'examen de l'ADN lui-même, ainsi que des protéines et d'autres petites molécules se liant à l'ADN.Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité d'observer et d'analyser facilement l'ADN en mouvement. Pour commencer, placez des lamelles en verre sur un support en PTFE et fixez-les en place à l'aide d'un morceau de ruban d'étanchéité en PTFE. Après avoir enveloppé les lamelles, laissez une extrémité de ruban de cinq centimètres de long afin de faciliter la manipulation du support durant la procédure de nettoyage.Dans une hotte, mélanger 350 millilitres d'acide sulfurique et 150 millilitres de peroxyde d'hydrogène dans un bécher en verre d'un litre pour préparer une solution de gravure piranha. Ensuite, placer le porte-lames contenant les lamelles dans la solution. Après deux heures, vider le bécher et rincer soigneusement les lamelles avec de l'eau déionisée.Continuer à rincer les lamelles jusqu'à ce que le pH de l'eau dans le bécher atteigne un pH neutre. Ensuite, soniquer les supports de lamelles dans un bécher contenant de l'eau pendant 30 minutes, afin de nettoyer et de fonctionnaliser les substrats de verre. Éliminer l'eau du bécher juste avant l'aminosilanisation. Pour commencer, préparer la solution d'aminosilanisation en ajoutant deux millilitres d'alkoxysilane et 10 millilitres d'acide acétique glacial à 200 millilitres de méthanol dans un récipient propre en polypropylène.Placer ensuite les lamelles propres dans la solution. Puis, mettre les lamelles nettoyées dans la solution préparée et agiter à température ambiante et à 100 tr/min pendant 30 minutes. Ensuite, soniquer le récipient contenant les lamelles dérivatisées pendant 15 minutes à 75 watts.Ensuite, agitez-les à nouveau à température ambiante et à 100 tr/min pendant au moins 30 minutes. Une fois terminé, videz la solution du bécher et rincez les lamelles trois fois, soigneusement : une fois avec de l'alcool méthylique et deux fois avec de l'alcool éthylique.Après le rinçage final, conserver les lamelles dans de l'alcool éthylique et les utiliser dans les deux semaines. Préparer d'abord 10 millilitres d'une solution de bicarbonate de sodium à 0,1 molaires et la filtrer à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 micron. Ensuite, dissoudre deux milligrammes de carbonate de PEG succinimidyle biotiné et 80 milligrammes de valérate de PEG succinimidyle dans 350 micro litres de la solution filtrée de bicarbonate de sodium.Protégez la solution de la lumière en utilisant un tube de protection contre la lumière. Vortexez vigoureusement le tube pendant 10 secondes, puis centrifugez-le à 10 000 x g pendant une minute afin d'éliminer les bulles. Ensuite, rincez une lame de verre à l'acétone, suivie d'alcool éthylique.Une fois rincée, laissez sécher complètement la lame à l'air. Déposez une goutte de 50 microlitres de la solution de PEG sur la lame en verre propre. Abaissez lentement une lamelle aminosilantisée sur la goutte selon un léger angle, de manière à ne pas générer de bulles d'air sous la lamelle.Ensuite, placer les lames dans une chambre horizontale, sombre et humidifiée, pendant au moins trois heures jusqu’à toute une nuit, à température ambiante. Une fois terminé, sceller la solution résiduelle de PEG dans un tube de protection contre la lumière et la conserver à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, rincer soigneusement les lamelles PEGylées avec de l’eau déionisée, puis les stocker dans un endroit sombre et sec jusqu’à leur utilisation.Pour créer la chambre à écoulement, placer des bandes de ruban adhésif double face sur un support en acrylique, de manière à ce qu'elles soient alignées perpendiculairement aux orifices d'entrée et de sortie et ne perturbent aucun des orifices du canal. Ensuite, frotter le ruban avec la pointe d'une pipette pour sceller les canaux. Puis, poser une lame couvre-objet PEGylée, côté PEGylé vers le bas, sur le dessus du ruban afin de former les chambres à écoulement.Pour éviter toute fuite de solution, appuyez le haut d'une lame couvre-objet sur la zone où est placée l'adhésive double face. Ensuite, ajoutez une colle époxy rapide sur les bords des chambres afin de la fixer en place. Puis, reliez un morceau de tube de 2,5 centimètres de long à une seringue étanche aux gaz et scellez l'assemblage avec de la colle époxy.Ensuite, reliez un tube long et flexible au tuyau provenant de la seringue. Scellez à nouveau le raccord avec de la colle époxy. Remplissez le tuyau relié à la seringue avec de l’eau déionisée, en veillant à ce qu’il n’y ait aucune bulle d’air.Ensuite, insérez le tube dans le trou de la chambre d'écoulement scellé avec de la colle époxy. Placez une pointe de pipette de 200 microlitres sur l'autre orifice, qui servira de réservoir. Réglez le débit de la pompe à seringue à 50 microlitres par minute.Ensuite, faites circuler 20 microlitres d'une solution de protéine d'avidine dans la chambre et laissez-la en place pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 20 microlitres d'oligonucléotides désoxyribonucléiques biotinylés dans une seringue. Faites-les circuler dans la chambre et laissez-les en place pendant 10 minutes.Si une transférase terminale est utilisée, omettez la charge des oligonucléotides désoxy. Ensuite, chargez 20 microlitres d'une solution d'ADN dans une seringue, faites-la circuler dans la chambre à un débit de 10 microlitres par minute et laissez-la en place pendant 30 minutes. Après l'incubation de 30 minutes, lavez la chambre d'écoulement avec 40 microlitres de tampon TE 1X à un débit de 50 microlitres par minute.Une fois lavé, charger la chambre avec 40 microlitres du même FP-DBP à une concentration de 80 nano-molaire, dans du tampon 1X TE. Pour observer la plage complète d'élongation des molécules d'ADN, appliquer différents débits en fonction des longueurs d'ADN utilisées. Observer l'ADN à l'aide d'un objectif 60X, en utilisant un microscope à fluorescence. Voici une vidéo de microscope à fluorescence montrant des molécules d'ADN de bactériophage lambda, fixées à la surface, qui sont étirées par un flux après ligature avec des oligonucléotides complémentaires biotinylés.Sous écoulement, les molécules d'ADN entièrement étirées mesurent 16,5 micromètres de longueur. En revanche, les molécules d'ADN du bactériophage T4 s'étirent jusqu'à une longueur de 56,4 micromètres sous écoulement. Cet étirement est réversible, et l'ADN peut être étendu et relâché plusieurs fois.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser le FP-DBP dans des analyses d'ADN plus complexes, ainsi que savoir démontrer l'étirement et la relaxation d'un polymère d'ADN.

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