La visualisation de la surface captif grande molécules d'ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

L'objectif général de cette procédure est de concevoir un système pratique d'analyse d'ADN pour microscope épifluorescent, afin de manipuler des molécules d'ADN uniques sur des surfaces de verre modifiées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la visualisation de l'ADN, notamment lors de l'examen de l'ADN lui-même, ainsi que des protéines et d'autres petites molécules se liant à l'ADN.

Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité d'observer et d'analyser facilement l'ADN en mouvement. Pour commencer, placez des lamelles en verre sur un support en PTFE et fixez-les en place à l'aide d'un morceau de ruban d'étanchéité en PTFE. Après avoir enveloppé les lamelles, laissez une extrémité de ruban de cinq centimètres de long afin de faciliter la manipulation du support durant la procédure de nettoyage.

Dans une hotte, mélanger 350 millilitres d'acide sulfurique et 150 millilitres de peroxyde d'hydrogène dans un bécher en verre d'un litre pour préparer une solution de gravure piranha. Ensuite, placer le porte-lames contenant les lamelles dans la solution. Après deux heures, vider le bécher et rincer soigneusement les lamelles avec de l'eau déionisée.

Continuer à rincer les lamelles jusqu'à ce que le pH de l'eau dans le bécher atteigne un pH neutre. Ensuite, soniquer les supports de lamelles dans un bécher contenant de l'eau pendant 30 minutes, afin de nettoyer et de fonctionnaliser les substrats de verre. Éliminer l'eau du bécher juste avant l'aminosilanisation. Pour commencer, préparer la solution d'aminosilanisation en ajoutant deux millilitres d'alkoxysilane et 10 millilitres d'acide acétique glacial à 200 millilitres de méthanol dans un récipient propre en polypropylène.

Placer ensuite les lamelles propres dans la solution. Puis, mettre les lamelles nettoyées dans la solution préparée et agiter à température ambiante et à 100 tr/min pendant 30 minutes. Ensuite, soniquer le récipient contenant les lamelles dérivatisées pendant 15 minutes à 75 watts.

Ensuite, agitez-les à nouveau à température ambiante et à 100 tr/min pendant au moins 30 minutes. Une fois terminé, videz la solution du bécher et rincez les lamelles trois fois, soigneusement : une fois avec de l'alcool méthylique et deux fois avec de l'alcool éthylique.

Après le rinçage final, conserver les lamelles dans de l'alcool éthylique et les utiliser dans les deux semaines. Préparer d'abord 10 millilitres d'une solution de bicarbonate de sodium à 0,1 molaires et la filtrer à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 micron. Ensuite, dissoudre deux milligrammes de carbonate de PEG succinimidyle biotiné et 80 milligrammes de valérate de PEG succinimidyle dans 350 micro litres de la solution filtrée de bicarbonate de sodium.

Protégez la solution de la lumière en utilisant un tube de protection contre la lumière. Vortexez vigoureusement le tube pendant 10 secondes, puis centrifugez-le à 10 000 x g pendant une minute afin d'éliminer les bulles. Ensuite, rincez une lame de verre à l'acétone, suivie d'alcool éthylique.

Une fois rincée, laissez sécher complètement la lame à l'air. Déposez une goutte de 50 microlitres de la solution de PEG sur la lame en verre propre. Abaissez lentement une lamelle aminosilantisée sur la goutte selon un léger angle, de manière à ne pas générer de bulles d'air sous la lamelle.

Ensuite, placer les lames dans une chambre horizontale, sombre et humidifiée, pendant au moins trois heures jusqu’à toute une nuit, à température ambiante. Une fois terminé, sceller la solution résiduelle de PEG dans un tube de protection contre la lumière et la conserver à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, rincer soigneusement les lamelles PEGylées avec de l’eau déionisée, puis les stocker dans un endroit sombre et sec jusqu’à leur utilisation.

Pour créer la chambre à écoulement, placer des bandes de ruban adhésif double face sur un support en acrylique, de manière à ce qu'elles soient alignées perpendiculairement aux orifices d'entrée et de sortie et ne perturbent aucun des orifices du canal. Ensuite, frotter le ruban avec la pointe d'une pipette pour sceller les canaux. Puis, poser une lame couvre-objet PEGylée, côté PEGylé vers le bas, sur le dessus du ruban afin de former les chambres à écoulement.

Pour éviter toute fuite de solution, appuyez le haut d'une lame couvre-objet sur la zone où est placée l'adhésive double face. Ensuite, ajoutez une colle époxy rapide sur les bords des chambres afin de la fixer en place. Puis, reliez un morceau de tube de 2,5 centimètres de long à une seringue étanche aux gaz et scellez l'assemblage avec de la colle époxy.

Ensuite, reliez un tube long et flexible au tuyau provenant de la seringue. Scellez à nouveau le raccord avec de la colle époxy. Remplissez le tuyau relié à la seringue avec de l’eau déionisée, en veillant à ce qu’il n’y ait aucune bulle d’air.

Ensuite, insérez le tube dans le trou de la chambre d'écoulement scellé avec de la colle époxy. Placez une pointe de pipette de 200 microlitres sur l'autre orifice, qui servira de réservoir. Réglez le débit de la pompe à seringue à 50 microlitres par minute.

Ensuite, faites circuler 20 microlitres d'une solution de protéine d'avidine dans la chambre et laissez-la en place pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 20 microlitres d'oligonucléotides désoxyribonucléiques biotinylés dans une seringue. Faites-les circuler dans la chambre et laissez-les en place pendant 10 minutes.

Si une transférase terminale est utilisée, omettez la charge des oligonucléotides désoxy. Ensuite, chargez 20 microlitres d'une solution d'ADN dans une seringue, faites-la circuler dans la chambre à un débit de 10 microlitres par minute et laissez-la en place pendant 30 minutes. Après l'incubation de 30 minutes, lavez la chambre d'écoulement avec 40 microlitres de tampon TE 1X à un débit de 50 microlitres par minute.

Une fois lavé, charger la chambre avec 40 microlitres du même FP-DBP à une concentration de 80 nano-molaire, dans du tampon 1X TE. Pour observer la plage complète d'élongation des molécules d'ADN, appliquer différents débits en fonction des longueurs d'ADN utilisées. Observer l'ADN à l'aide d'un objectif 60X, en utilisant un microscope à fluorescence. Voici une vidéo de microscope à fluorescence montrant des molécules d'ADN de bactériophage lambda, fixées à la surface, qui sont étirées par un flux après ligature avec des oligonucléotides complémentaires biotinylés.

Sous écoulement, les molécules d'ADN entièrement étirées mesurent 16,5 micromètres de longueur. En revanche, les molécules d'ADN du bactériophage T4 s'étirent jusqu'à une longueur de 56,4 micromètres sous écoulement. Cet étirement est réversible, et l'ADN peut être étendu et relâché plusieurs fois.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser le FP-DBP dans des analyses d'ADN plus complexes, ainsi que savoir démontrer l'étirement et la relaxation d'un polymère d'ADN.