La visualisation de la surface captif grande molécules d'ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

L’objectif global de cette procédure est de créer un système d’analyse d’ADN pratique pour un microscope épifluorescent, afin de manipuler l’ADN d’une seule molécule sur des surfaces en verre modifiées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la visualisation de l’ADN. Lors de l’examen de l’ADN lui-même, ainsi que des protéines de liaison à l’ADN et d’autres petites molécules.

Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’observer et d’analyser facilement l’ADN en mouvement. Pour commencer, placez les lamelles en verre sur un support en PTFE et fixez-les en place à l’aide d’un morceau de ruban adhésif en PTFE. Après avoir enveloppé les lamelles, laissez un morceau de ruban de cinq centimètres de long à utiliser pour manipuler le support pendant la procédure de nettoyage.

Dans une hotte, combinez 350 millilitres d’acide sulfurique et 150 millilitres de peroxyde d’hydrogène dans un bécher en verre d’un litre pour obtenir une solution de gravure de piranha. Ensuite, placez le rack de lamelles dans la solution. Au bout de deux heures, videz le bécher et rincez abondamment les lamelles à l’eau déminéralisée.

Continuez à rincer les lamelles jusqu’à ce que le PH de l’eau dans le bécher atteigne un PH neutre. Ensuite, soniser les claquettes de lamelles dans un bécher contenant de l’eau pendant 30 minutes, pour nettoyer et dériver les substrats en verre. Vider l’eau du bécher, juste avant l’aminosilanisation. Pour commencer, préparez la solution d’aminosilanisation, en ajoutant deux millilitres d’alkoxysilane et 10 millilitres d’acide acétique glacial à 200 millilitres d’alcool méthylique dans un récipient propre en polypropylène.

Ensuite, placez les lamelles propres dans la solution. Ensuite, placez les lamelles nettoyées dans la solution préparée et secouez-les à température ambiante et à 100 tr/min pendant 30 minutes. Ensuite, sonicez le récipient avec les lamelles dérivées pendant 15 minutes à 75 watts.

Ensuite, secouez-les à nouveau à température ambiante et à 100 tr/min pendant au moins 30 minutes. Une fois terminé, videz la solution du bécher et rincez soigneusement les lamelles trois fois. Une fois avec de l’alcool méthylique et deux fois avec de l’alcool éthylique.

Après le rinçage final, conservez les lamelles dans de l’alcool éthylique et utilisez-les dans les deux semaines. Tout d’abord, préparez 10 millilitres d’une solution de bicarbonate de sodium de 0,1 molaire et filtrez-la à travers un filtre de seringue de 0,22 micron. Ensuite, dissolvez deux milligrammes de carbonate de biotine PEG succinimidyl et 80 milligrammes de valérate de PEG succinimidyl dans 350 microlitres de solution de bicarbonate de sodium filtrée.

Protégez la solution de la lumière à l’aide d’un tube de protection contre la lumière. Agitez vigoureusement le tube, pendant 10 secondes, puis centrifugez-le à 10 000 x g pendant une minute pour éliminer les bulles. Ensuite, rincez une lame de verre avec de l’acétone suivie d’alcool éthylique.

Une fois rincé, laissez la lame sécher complètement à l’air. Placez une goutte de 50 microlitres de la solution PEG sur la lame de verre propre. Abaissez lentement une lamelle aminés-silanisées sur la gouttelette à un léger angle, afin de ne pas générer de bulles d’air sous la lamelle.

Ensuite, placez les lames dans une chambre plane, sombre et humidifiée pendant au moins trois heures à toute la nuit, à température ambiante. Lorsque vous avez terminé, scellez la solution résiduelle de PEG dans le tube de protection contre la lumière et maintenez-la à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, rincez abondamment les lamelles PEGylées avec de l’eau déminéralisée, puis rangez-les dans un endroit sombre et sec jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.

Afin de créer la chambre d’écoulement, placez des bandes de ruban adhésif double face sur un support acrylique, de sorte qu’il soit aligné perpendiculairement aux trous d’entrée et de sortie et ne perturbe aucun des trous du canal. Ensuite, frottez le ruban, à l’aide d’une pointe de pipette, pour sceller les canaux. Ensuite, placez une lamelle PEGylée, avec le côté PEGylé vers le bas, sur le dessus du ruban pour faire des chambres d’écoulement.

Pour éviter toute fuite de solution, appuyez sur le haut d’une lamelle sur la zone où le ruban adhésif double face est placé. Ensuite, ajoutez une colle époxy à séchage rapide sur les bords des chambres, pour la fixer en place. Ensuite, connectez un morceau de tube de 2,5 centimètres de long à une seringue étanche au gaz et scellez le joint avec de la colle époxy.

Ensuite, connectez un long tube flexible au tube provenant de la seringue. Et encore une fois, scellez le joint avec de la colle époxy. Remplissez le tube relié à la seringue avec de l’eau déminéralisée, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air.

Ensuite, insérez le tube dans le trou de la chambre d’écoulement qui est scellé avec de la colle époxy. Et placez un embout de pipette de 200 microlitres sur l’autre trou, pour l’utiliser comme réservoir. Réglez le débit d’un pousse-seringue à 50 microlitres par minute.

Ensuite, versez 20 microlitres d’une solution protéique d’avidine dans la chambre et maintenez-la là pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 20 microlitres d’oligonucléotides désoxy biotinylés dans une seringue. Faites-le couler dans la chambre et conservez-le là pendant 10 minutes.

Si une transférase terminale est utilisée, évitez la charge des oligonucléotides désoxydésoxy. Ensuite, chargez 20 microlitres d’une solution d’ADN dans une seringue, versez-la dans la chambre à raison de 10 microlitres par minute et maintenez-la là pendant 30 minutes. Après l’incubation de 30 minutes, laver la chambre d’écoulement avec 40 microlitres de tampon 1X TE à 50 microlitres par minute.

Une fois lavé, chargez la chambre avec 40 microlitres du même FP-DBP à une concentration de 80 nano-molaires, dans le 1X TE.To voir toute la gamme d’étirement des molécules d’ADN, appliquez différents débits en fonction des longueurs d’ADN utilisées. Observez l’ADN sous une lentille d’objectif 60X, à l’aide d’un microscope fluorescent. Voici une vidéo de microscope fluorescent montrant des molécules d’ADN lambda de bactériophage, attachées à la surface, étirées par le flux après ligature avec des oligonucléotides complémentaires biotinylés.

Sous écoulement, les molécules d’ADN entièrement allongées mesurent 16,5 microns de longueur. En revanche, le bactériophage T4 DNA momlecules, allongé à une longueur de 56,4 microns, sous écoulement. Cet allongement est réversible et l’ADN peut être étendu et détendu plusieurs fois.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le FP-DBP dans l’analyse d’ADN plus grande et démontrer l’étirement et la relaxation du polymère d’ADN.