Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l'étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Adhérence des lymphocytes T médiatise un certain nombre de processus distincts dans un système immunitaire sain, ³ jouant un rôle essentiel dans le trafic des lymphocytes T et la présentation de l' antigène. Que ce soit lors de la surveillance immune ou une réponse immunitaire active ces deux tâches d'adhérence sont critiques. ⁴ Les événements de signalisation physiologiques des interactions cellulaires de cellules endothéliales T sont distinctes des cellules T cellule présentatrice d' antigène (APC) des interactions, et donc nécessitent des méthodes distinctes de étude pour comprendre mieux les cascades de signalisation impliquées. L'adhérence ferme d'une cellule T à une paroi du vaisseau sanguin pendant l'extravasation des lymphocytes nécessite une activation rapide et dynamique intégrine. L'interaction étroite entre une intégrine et d' adhérence des molécules d'État actifs le long de l'endothélium conduit à résistant à l'écoulement du sang adhérence, qui permet aux cellules T à ramper le long de la surface à la recherche d'une zone permissive au passage cellulaire. ⁵ L'exploration d'un bi cellulaire T -directionally alonga paroi du vaisseau sanguin est tributaire de l' adhésion polarisée, avec une extrémité avant adhésive distincte de la cellule T. ⁶ Plus important encore , l' adhésion ferme et la transmigration exigent une résistance à la force de cisaillement générée par la circulation du flux sanguin.

Lors de la conception des expériences pour étudier l'adhérence des lymphocytes, l'attention devrait être accordée à la relance d'intérêt spécifique. Bien que l'activation des intégrines est un composant commun et critique de toutes les formes de T adhésion cellulaire, les cascades d'activation sont susceptibles d'être unique en aval des récepteurs individuels et co-récepteurs. De même, les paires d'intégrine et la molécule d'adhésion en fonction des micro-environnements spécialisés et sur des sous-populations spécifiques. De cette façon, ces paires peuvent être réglées différemment. Le modèle présenté ici est idéal pour l'étude des cascades conduisant à l' activation qui se déroule dans des conditions de contrainte de cisaillement intégrine de signalisation. ⁷ Ces interactions ne peuvent être compris de manière adéquate dans un ADHESI statiquesur le système en raison de l'impact a été démontré que ces forces d'avoir directement sur ​​le comportement des cellules T. ⁸ Bien que présenté ici avec des cellules T et CHO (ovaire de hamster chinois) , les cellules modifiées pour exprimer (cellules CHO-ICAM) ICAM-1 humain , le système peut facilement être modifié pour étudier différentes populations leucocytaires ou des molécules d'adhésion.

Cet essai fournit un procédé pour quantifier adhésivité des cellules T et l'activation de l'intégrine en utilisant une contrainte de cisaillement, en fournissant un modèle pour la phase solide d'adhérence de leucocyte extravasation. Grâce à l'utilisation de cellules CHO-ICAM l'affinité de LFA-1 pour son ligand dans les cellules vivantes peuvent être examinées en temps réel en réponse à divers stimuli d'intérêt. Cette technique nécessite facilement obtenu, disponibles dans le commerce des chambres micro-flux en combinaison avec une pompe seringue, grandement simplifier l'équipement nécessaire pour modéliser le flux sanguin et la contrainte de cisaillement par rapport aux autres modèles. ⁹ Un autre avantage majeur de cette analyse est que la signalisation spécifiquecascades et l'état d'activation résultant des intégrines individuelles peuvent être étudiées proprement grâce à l'utilisation de cellules CHO modifiées exprimant des molécules d'adhésion humaines d'intérêt. En outre, la combinaison des données quantitatives avec l'imagerie des cellules vivantes est un avantage important de cette méthode. Dans l'ensemble, tandis qu'un certain nombre d'essais de statique adhérence des cellules T ont été décrit que bien modéliser les interactions des cellules T-APC, ces modèles ne sont pas suffisantes pour capturer le processus dynamique de T adhérence de cellules épithéliales. Pour cette raison, lors du choix d'un test d'adhérence du stimulus en question doit être envisagée.

1. Placage les cellules CHO-ICAM

Remarque: Le but de cette étape est de plaquer les cellules CHO-ICAM dans les chambres d'écoulement pour la croissance durant la nuit dans le but de générer une monocouche confluente.

1. Maintenir les cellules CHO-ICAM dans 10 cm de culture de tissus traités boîtes de culture dans 10 ml de milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (CHO-ICAM milieu de culture complet) à 37 ° C avec 5% CO _2.
2. Pour recueillir les cellules, ajouter 1 ml de 0,5% de trypsine-EDTA, et on incube à température ambiante pendant 1 min avec agitation douce. Neutraliser la trypsine avec 4 ml de milieu.
3. Compter les cellules CHO-ICAM en utilisant un hématimètre et calculer 0,75 x 10 ⁵ cellules par chambre. Remarque: Dans cette expérience: 2,25 x 10 ⁵ cellules seront nécessaires pour ensemencer 3 chambres.
4. Centrifugeuse 0,75 x 10 ⁵ cellules CHO-ICAM par chambre pendant 5 min à 500 x g, température ambiante et à remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 pl par la chambre de CHOICAM milieu complet de culture.
   Remarque: Dans cette expérience, 90 pi seront nécessaires pour ensemencer 3 chambres.
5. ajouter lentement les cellules dans un réservoir de la chambre d'écoulement. Laisser les cellules sédimenter pendant 5 min dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% de CO _2.
6. Ajouter 200 ul de milieux de culture complets sur les deux réservoirs de chaque chambre. additions alterner entre les deux pour éviter le mouvement des cellules que le système équilibrant.
7. Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO _2.

2. Préparation des cellules T

Remarque: Ce test peut être effectué avec des cellules T humaines primaires ou d'une lignée de lymphocytes T. Un protocole sur l' isolement à partir du sang des cellules T a été décrit précédemment. ¹⁰ Si l' aide de cellules T humaines primaires utilisent des cellules fraîchement isolées pour de meilleurs résultats. Si l'on utilise une lignée de cellules T, suivre le protocole de culture spécifiée par la source des cellules. Afin de détecter les cellules sur une microsco fluorescentepe les cellules T sont marquées avec un ester de succinimidyle carboxy-fluorescéine (CFSE).

1. Compter les cellules T en utilisant un hématimètre et calculer 2 x 10 ⁶ cellules par chambre. Note: Dans cette expérience, 6 x 10 ⁶ cellules seront nécessaires pour 3 chambres.
2. Centrifugation de 2 x 10 ⁶ cellules T par la chambre pendant 5 min à 500 x g, température ambiante et à remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 1% de glucose ou 2% de FBS.
3. Ajouter CFSE à 1: 1000 dilution (actions faite à 5 mM). Couvrir de la lumière et incuber pendant 8 min à température ambiante
4. Spin à 500 xg pendant 5 min, RT.
5. Resuspendre le culot cellulaire avec 240 pi par condition (voir la section 4 "Note") de sérum manquant RPMI médiatique. Dans cette expérience, resuspendre le culot cellulaire dans 720 pi de RPMI. Diviser les cellules dans 1,5 ml vides tubes étiquetés pour chaque chambre, 240 pl par tube. Gardez les cellules dans un bloc C de chaleur 37 ° jusqu'à utilisation.

3. Mise en place d'ee Input / Hosing de sortie et seringue

1. Réchauffer la chambre d'imagerie en direct de microscope à 37 ° C.
2. Préparer le tuyau d'entrée:
   1. Remplir une bouteille en verre de 500 ml avec de l'eau et faire 2 trous dans le couvercle. Marquez les trous "dans" et "out". Ceci agira comme un bain d'eau de chauffage pour le support d'entrée.
   2. Exécuter l'entrée de jet d' eau à travers les trous dans le couvercle et dans le bain d'eau. Assurez -vous que le côté du jet d' eau qui se connecte à la seringue vient à travers la "dans" trou et le côté qui va se connecter au réservoir d'entrée vient à travers le trou "out".
   3. Rincer l'entrée hosing avec 60 ml d'eau pour éliminer tout l' air du système.
   4. Premier entrée hosing avec un milieu RPMI sans sérum chauffé à 37 ° C. Remplir une seringue de 60 ml et pousser à travers les médias jusqu'à ce que le tuyau est complètement apprêté et sans bulles d'air.
      Remarque: Selon le length de tube utilisé le volume requis pour amorcer variera.
      1. Calculer le volume de supports requis pour l'expérience en multipliant le débit d'écoulement (ici 0,3 ml / min) par le nombre de minutes (5 min) en fonction du nombre de chambres dans l'expérience (ici 3); dans cette expérience, utiliser 4,5 ml médias. Note: Nous recommandons d'avoir 5 ml de volume supplémentaire (ici un total de 9,5 ml) restant dans la seringue après l'amorçage.
   5. Placez la configuration d'entrée entière dans l'enceinte de l' imagerie en direct du microscope pour maintenir 37 ° C. Exécutez le tuyau et la seringue hors de l'enceinte et de charger la seringue dans la pompe seringue.
3. Préparer le tuyau de sortie:
   1. Faire un trou dans le couvercle d'une bouteille de 250 ml à utiliser en tant que déchets de sortie.
   2. Faire fonctionner le tube de sortie à travers le trou et dans la bouteille. Librement fixer le couvercle, ne pas fermer tout le chemin.
   3. Placez la configuration de sortie dans l'enceinte d'imagerie en direct de la microscope.
4. Calculer le débit (ml / min) nécessaire pour générer la contrainte de cisaillement souhaitée (dynes / ^cm2). La contrainte de cisaillement varie dans les différents compartiments vasculaires, donc prendre en compte le modèle global, y compris les types de cellules à étudier et les traitements au moment de décider sur un niveau de contrainte de cisaillement.
   Note: Ces expériences sont menées à 0,4 dyn / cm ² pour imiter étroitement un cadre de petite veine.
   1. Prenez les dimensions de la chambre en compte lors du calcul de la contrainte de cisaillement. Utilisez la formule suivante (fournie par le fabricant ¹¹⁾ pour les chambres d'écoulement utilisées ici (voir le tableau des matériaux): T = η * 176.1 * ø où le stress T = cisaillement, η = viscosité dynamique, ø = débit. Remarque: La viscosité dynamique du milieu RPMI à 37 ° C est de 0,007.

4. Chargement des Chambres de débit et de stimulation des cellules

Remarque: Afin d'initier l'adhésion,les cellules T doivent être stimulés. Dans l'expérience suivante , les cellules seront soit rester ou non stimulées sont stimulées par SDF-1α ¹² ou phorbol myristate acétate (PMA; contrôle positif) ^13. Pour une bonne présentation des chimiokines à des lymphocytes T, des cellules CHO-ICAM sont préincubées avec le SDF-1α (suivie par des lavages en série), permettant la présentation sur la surface cellulaire. La PMA est un ester de phorbol qui est structurellement similaire au second messager diacyle glycérol (DAG); Ici, il est utilisé comme témoin positif. Les cellules T sont directement traitées avec du PMA avant le chargement dans la chambre d'écoulement.

1. Placer la lame de la chambre d'écoulement sur le microscope et définir le plan focal de la monocouche des cellules CHO-ICAM en utilisant l'objectif 20X.
2. Gardez les cellules T CFSE colorées pour toutes les autres conditions dans le bloc C de chaleur 37 °. Préparer les cellules CHO-ICAM ou T comme suit immédiatement avant l'essai pour cette condition:
   1. Pour la condition non stimulées (chambre 1), gardez un tube / flux chambre non traité, pour servir de témoin négatif pour la stimulation.
   2. Pour PMA stimulation (chambre 2), stimuler un tube de cellules T avec PMA (10 ng / ml) pour servir comme témoin positif; traiter immédiatement avant le chargement dans la chambre d'écoulement.
   3. Pour la stimulation SDF-1α, (chambre 3), de stimuler la chambre d'écoulement troisième avec le SDF-1α (100 ng / ml) en enlevant 70 ul à la fois 3 fois depuis le réservoir supérieur (réservoir de sortie), puis en ajoutant 70 ul de SDF -1α (100 ng / ml) dans le réservoir inférieur (réservoir d'entrée). Incuber pendant 5 min.
3. Retirer et jeter 70 pi à un moment 3 fois à partir du réservoir de sortie d'une chambre.
4. Ajouter 70 pi de suspension pré-traitée (selon le cas) cellules T dans le réservoir d'entrée 3 fois. Attendez 5 min pour permettre aux cellules de se déplacer de l'entrée de la chambre ( "In"), et d'atteindre la sortie proximale ( "Out") de la chambre.
5. Pendant ce temps, l'image 5champs pour les cellules T CFSE colorées. Choisir des champs qui sont dispersés dans tout le centre de la chambre (figure 1). Utiliser les conditions d'excitation / émission suivantes: excitation longueur d'onde du laser: 488 nm; émission filtre de collection: 500 - 540 nm. Ces images serviront les comptages de cellules pré-flux.
6. Attacher la tubulure d'entrée et de sortie simultanément dans les réservoirs de la chambre d'écoulement.
   Remarque: Fixation du tube simultanément est essentiel afin de ne pas introduire de bulles d'air dans la chambre et le maintien de l'équilibre global dans la chambre.
7. Commencez débit à 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm ²⁾ tout en visualisant les cellules T CFSE colorées. Comme l'écoulement commence, surtout avec la première chambre, il y a souvent un décalage entre initier l'écoulement et l'observation de roulement des cellules T, commencent donc le moment 5 min au début du mouvement des cellules T.
8. Terminate écoulement après 5 min, et l'image 5 champs dans le canal CFSE. Choisissez les champs dispersés au hasard throughout le centre de la chambre d'écoulement (figure 1). Ces images serviront les comptages de cellules post-flux.

5. Déterminer le pourcentage de cellules adhérentes

Note: La détermination du nombre de cellules dans les images acquises est réalisé de manière objective avec un logiciel automatisé. Pour nos études, nous avons utilisé le logiciel Volocity (Version 6.2.1), mais d'autres logiciels tels que ImageJ (version 1.48V) sont également applicables.

1. Déterminer le nombre de cellules par champ pré-flux pour chaque condition. La moyenne des champs 5 est le "nombre moyen des cellules pré-flux." ⁷
2. Déterminer le nombre de cellules par champ post-flux pour chaque condition. La moyenne des champs 5 est le "nombre moyen des cellules post-flux." ⁷
3. Calculer le pourcentage de cellules adhérentes à l' aide de la formule suivante: Pourcentage de cellules adhérentes = (nombre de cellules moyenne post-débit) / (nombre de cellules moyenne pré-débit) x 100%.

Les résultats représentatifs sont présentés dans le test d'adhérence de l' écoulement à l' aide de Jurkat et des cellules T CD3 + humaines primaires, comme indiqué, stimulées par le SDF-1α. Les contrôles négatifs dans toutes les expériences présentées sont des cellules non stimulées. Un seuil de base pour cent l'adhésion des cellules non stimulées est comprise entre 5 - 10%; adhérence de base, notamment au-dessus de cette fourchette indique une expérience problématique et suggère la population de départ des lymphocytes T ont été pré-activé de manière non spécifique en préparation. Pliez augmentation du nombre de cellules adhérentes post-débit dans chaque condition par rapport à celle des cellules non stimulées peut être calculé en plus du calcul de pour cent adhérence. Les données représentant ces deux méthodes de calcul est inclus ici.

La figure 2A montre des images représentatives de champs à l' intérieur de la chambre d'écoulement pour chaque condition pré- et post-écoulement. Avant l'expérience, Jurkat (shown sur la figure 2A) ou des cellules T CD3 + humaines primaires sont purifiés, comptées, et marquées avec du CFSE. Pour chaque condition expérimentale 2 x 10 6 cellules ont été marquées. Les cellules T non stimulées ont été chargées dans les chambres de flux contenant des cellules CHO-ICAM en présence ou en l'absence de SDF-1α. Les cellules T ont été autorisés à se déplacer et accumuler dans la chambre pendant 5 min, et pendant ce temps, les images ont été capturées pour déterminer les comptages de pré-écoulement. Un nombre comparable de cellules pré-flux entre les différentes stimulations est essentielle pour assurer des conditions expérimentales uniformes. Après 5 min de la contrainte de cisaillement continue générée par l'écoulement, des images ont à nouveau été capturés pour déterminer les chiffres post-flux. Il est évident, au travers de ces images représentatives que le SDF-1α augmente le nombre de lymphocytes T capables d'adhérer aux cellules CHO-ICAM sous contrainte de cisaillement.

La figure 2B montre le facteur de changement de T adhésion cellulaire comme calculé sur la base du nombre de cellules T Jurkat avant et après l'écoulement soit non stimulés, soit en présence de SDF-1α. Pour chaque condition, les comptes moyens de cellules de 5 champs pré-débit et 5 champs post-flux ont été déterminés, et une comparaison de la stimulation SDF-1α à non stimulées est utilisé pour calculer facteur de changement de T adhésion cellulaire. Comme le montre ici, SDF-1α induit une augmentation de 2 fois près de l'adhérence par rapport à non stimulées.

La figure 2C illustre une autre méthode de calcul de données. Ici , le pour cent l' adhésion des cellules primaires humaines CD3 + T en présence ou en absence de SDF-1α est déterminée en déterminant d' abord les chiffres de cellules T pré et post-débit moyen, puis en divisant la moyenne post-débit par la moyenne pré-débit et en multipliant par 100. par ce calcul l'ensemble de la population pré-flow représente 100% d'adhérence. Comme on le voit ici, 15% des cellules T non stimulées adhérer sous cisaillement stress par rapport à 50% des cellules T stimulées avec le SDF-1α.

Figure 1. Il est important d'analyser seulement dans des zones exposées à un écoulement homogène. Représentation schématique des chambres d'écoulement utilisées avec une indication de l' endroit où les champs doivent être imagées. Selon les informations fournies par les fabricants de chambre, le débit prédéfini est atteint que par le centre des chambres, indiquée par l'orange dans ce schéma. Plus près des frontières de la chambre le débit diminue de taux et ne devrait pas être inclus dans l' imagerie ou l' analyse expérimentale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. <strong> SDF-1α T induit l' adhérence cellulaire ICAM-1 sous une contrainte de cisaillement. A. Des cellules T Jurkat ont été marquées avec du CFSE à une concentration de 5 uM. Ensuite, les cellules ont été chargées dans les chambres d'écoulement qui ont été prétraitées avec le SDF-1α (100 ng / ml) ou non stimulé et mis en place sur le microscope confocal et on le laisse se déplacer et accumuler dans la chambre pendant 5 min. En variante, les cellules T Jurkat ont été prétraitées avec du PMA (10 ng / ml) avant l'addition aux chambres d'écoulement. Tout au long de ces images pré-flux 5 min ont été capturés. Débit a ensuite été initiée à 0,4 dyn / cm 2 pour créer une contrainte de cisaillement pendant 5 min. À la fin, les images post-flux ont été capturés. Des images représentatives de cellules T Jurkat sont présentés, barre d'échelle de 50 pm. B. changement Fold dans l' adhésion des cellules T Jurkat a été calculé en déterminant d' abord le nombre de cellules pré et post-débit moyen pour chaque condition et en divisant le nombre moyen de post-débit par la co moyenne pré-débitunt individuellement pour chaque condition. Ce quotient d'adhérence pour chaque condition de stimulation, ici SDF-1α ou PMA, est ensuite divisé par l'adhésion quotient non stimulé pour déterminer le facteur de changement d'adhérence. Les barres représentent la moyenne de 3 expériences ± SEM. C. Pourcentage adhérence des cellules T CD3 + humaines primaires a été calculé en déterminant d' abord les pré moyennes et post-écoulement du nombre de cellules pour chaque condition. Pour chaque condition, le nombre moyen de post-débit est divisé par le nombre moyen de pré-débit et multiplié par 100. L'adhérence pour cent résultant est basée sur le nombre de cellules pré-écoulement étant de 100% d'adhérence. Les barres représentent la moyenne de 5 expériences ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. TLes cellules accumulent premier circulent ensuite sur la monocouche des cellules CHO-ICAM. Des cellules T Jurkat ont été marquées avec du CFSE à une concentration de 5 uM. Ensuite, les cellules ont été chargées dans les chambres d'écoulement qui ont été prétraitées avec le SDF-1α (100 ng / ml) et mis en place sur le microscope confocal et on le laisse se déplacer et accumuler dans la chambre pendant 5 min. Tout au long de ces 5 images min ont été capturés comme une série time-lapse; images fixes (A). Débit a ensuite été initiée à 0,4 dyn / cm 2 pour créer une contrainte de cisaillement pendant 5 min. Tout au long de ces 5 images min ont été capturés comme une série time-lapse; images fixes (B). Le sens de circulation dans ces images est de bas en haut, et le plan focal est fixé à la monocouche CHO-ICAM. Les cellules T peuvent être classés en 3 groupes:, lignes horizontales courtes (1) des cellules T roulant le long de la monocouche au débit sont visualisés en mouvement de bas en haut à travers le champ, car ils se déplacent rapidement tout en étant imagé. (2) T cellules crawling le long de la monocouche. Ces cellules sont fermement collées sur la base de la résistance à l'écoulement, et sont susceptibles rampent à la recherche d'une zone favorable au passage cellulaire, qui n'a pas observé dans ce modèle. (3) des cellules T qui adhèrent fermement à la monocouche, sont résistants à l'écoulement, mais sont immobiles. Ces cellules ne sont pas rouler ou ramper le long de la monocouche activement. Une analyse plus poussée peut être effectuée sur la base des objectifs de l'étude, à l'aide d'un script d'ImageJ conçu pour disséquer ces populations cellulaires pour la quantification ou la caractérisation supplémentaire. Echelle barres 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Des cellules CHO-ICAM doivent former une monocouche confluente. Représentant l' image d'un confluentes CHO-ICAM monolayer intérieur d'une chambre d'écoulement. Barre d' échelle 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.