Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques

Dans métabolomique contemporains, haut de gamme des techniques de séparation analytique sont utilisées pour analyser un large éventail de classes de métabolites afin d'obtenir un représentant en lecture sur l'état physiologique d'un organisme ^1. L'objectif ultime d'une étude de la métabolomique est d'obtenir une réponse à une question biologique / clinique donnée. À l' heure actuelle, la base de données du métabolome humain est composé de plus de 40.000 entrées de métabolites représentant des composés à la fois endogènes et exogènes (ce dernier provenant de nutriments, microbiote, des médicaments et d' autres sources) ^2. Compte tenu de la grande diversité des propriétés physico-chimiques et la gamme de concentration de ces métabolites, des techniques d'analyse multiples avec des mécanismes de séparation différents doivent être utilisés conjointement afin de profiler comme de nombreux métabolites que possible dans un échantillon biologique donné. Par exemple, Psychogios et al. , Utilise une combinaison de cinq techniques de séparation analytique pour le prof métaboliqueIling de sérum humain résultant de la détection de plus de 4000 chimiquement divers métabolites ^3.

Dans cet article, l' attention sera portée aux stratégies CE-MS récemment mis au point pour le profilage métabolique des échantillons biologiques ^4,5. Dans le CE, électrophorèse plus particulièrement capillaire de zone (CZE, habituellement dénommé CE), les composés sont séparés sur la base de leur rapport charge à la taille et, par conséquent, cette technique d'analyse est très adapté pour l'analyse des métabolites polaires et chargés. Le mécanisme de séparation de C'est fondamentalement différent des techniques basées sur chromatographiques, fournissant ainsi une information complémentaire sur la composition métabolique des échantillons biologiques ^6-8. Soga et ses collègues ont été les premiers à montrer l'utilité de CE-MS pour le profilage global des métabolites dans des échantillons biologiques ^9,10. Jusqu'à présent, la faisabilité et l' utilité des CE-MS pour métabolomique a été largement démontré ^11-15.C'est généralement couplée à MS via une gaine liquide interfaçage technique ^16,17; cependant, en raison de la dilution de l'effluent du capillaire par la gaine-liquide, la sensibilité de détection est intrinsèquement compromise.

Récemment, il a été démontré que l'utilisation d'une interface sans introducteur a considérablement amélioré la couverture de détection de métabolites présents dans divers échantillons biologiques , par rapport à CE-MS en utilisant une interface gaine-liquide classique ^5,18,19. Par exemple, circa 900 caractéristiques moléculaires ont été détectés dans l' urine humaine par introducteur CE-MS alors que près de 300 caractéristiques moléculaires ont été observées avec gaine-liquide CE-MS ^5. L'interface introducteur utilisée était basée sur une pointe émetteur poreuse, qui a été inventé par Moini ^20, permettant l'utilisation efficace de la propriété intrinsèque à faible débit de CE en combinaison avec nano-ESI-MS.

Afin de stimuler l'utilisation de introducteur CE-MS dans le domaine de la métabolomique,un protocole décrivant la façon dont est présentée cette approche peut être utilisée pour l'analyse des métabolites hautement polaires dans des échantillons biologiques, comme le montre l'analyse des extraits de la lignée de cellules de glioblastome. Il est montré que la méthode CE-MS introducteur pour le profilage des métabolites cationiques peuvent également être utilisés pour le profilage de metabolites anioniques en utilisant exactement les mêmes capillaires et de séparation des conditions, ce qui réduit le temps d'analyse et de fournir une plate-forme d'analyse unique pour le profilage global de métabolites chargés. Le protocole décrit également une stratégie pour l'alignement efficace de l'introducteur poreuse pointe émetteur avec l'instrument MS.

NOTE: Le protocole décrit ici pour l'utilisation de introducteur CE-MS pour les études de profilage métabolique est à usage de laboratoire seulement. Les procédures décrites ci - dessous sont basés sur récemment publié ^4,5 de travail. D'autres détails expérimentaux peuvent être trouvés dans ces documents. Avant d'utiliser ce protocole, consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (FS). S'il vous plaît utiliser toutes les procédures de sécurité en laboratoire appropriées, y compris des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire et des gants, lors de la conduite des expériences décrites dans ce protocole.

1. Préparation des réactifs et des échantillons Solutions

1. Préparation de l'électrolyte de base (BGE)
   1. Préparer une nouvelle solution BGE (10% (v / v) d'acide acétique, pH 2,2) tous les jours.
   2. Ajouter 9,0 ml d'eau dans un flacon de 10 ml en verre et ajouter 1,0 ml d'acide acétique à l'eau dans une hotte. Mélanger soigneusement la solution à l'aide d'un vortex.
2. Préparation de métabolite Standard mélange
   1. Dissoudre 50 ul d'un mélange standard de 50 uM de cations contenant 60 métabolites cationiques dans 50 pi d'eau et mélanger soigneusement la solution. Conserver à -80 ° C lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation.
   2. Dissoudre 50 pl d'un anion mélange standard 50 uM contenant 30 métabolites anioniques dans 50 pi d'eau et mélanger soigneusement la solution. Conserver cette solution, en aliquotes pour empêcher les cycles de gel / dégel du même mélange standard, à -80 ° C lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation.
      NOTE: Le métabolite mélanges étalons sont stables pendant 3 mois dans des conditions appropriées à -80 ° C.
3. Préparation des extraits de la lignée de cellules de glioblastome
   1. Laver les cellules adhérentes U-87 MG glioblastome humain trois fois avec 1 ml glacée solution à 0,9% de chlorure de sodium ^21.
   2. Ajouter 2 ml d'une solution glacée de méthanol / eau (2/8, v / v) aux cellules adhérentes et racler à l' aide d' un caoutchouc à bout grattoir à cellules ^21. Recueillir la solution de méthanol / eau dans un tube et ultrasonicate pendant 2 min.
   3. Ajouter le chloroforme à la fraction méthanol / eau (rapport finale 8/8/2, v / v / v) et centrifuger l'échantillon pendant 10 minutes à 16.100 xg et 4 ° C.
   4. Recueillir la phase méthanol / eau et évaporer cette fraction en utilisant un concentrateur sous vide. Reconstituer le matériau séché dans 50 ul d'eau pour analyse par introducteur CE-MS. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation stocker l'échantillon à -80 ° C.

2. Mise en place du CE MS-système introducteur

1. Installation de la cartouche-silice fondue nue avec la pointe émetteur poreuse
   1. Placez une nouvelle cartouche de silice fondue nue avec une pointe émetteur poreuse (longueur 30 um diamètre intérieur x 90 cm au total) dans l'instrument de la CE.
   2. Appliquer un rinçage à l'avant à 50 psi pendant 15 min avec le logiciel de commande de l'instrument EC à l'aide de methanol à 100% et de vérifier visuellement si le liquide coule hors du Capilsortie lary au cours de cette étape de rinçage. Également effectuer un rinçage dans le sens opposé à 50 psi pendant 5 min en utilisant la solution BGE pour examiner visuellement si liquide sortant du capillaire conducteur.
   3. Répétez l'étape 2.1.2 à une pression de 100 psi au cas où aucune formation de gouttes de liquide a été observé à la sortie du capillaire. Installez une nouvelle cartouche de silice fondue nue si aucune formation de gouttes de liquide a été observé au cours de cette étape.
   4. Rincer le capillaire de séparation avec l'eau à 50 psi pendant 10 min, puis du NaOH 0,1 M à 50 psi pendant 10 min, puis par de l'eau à 50 psi pendant 10 min, et enfin avec BGE à 50 psi pendant 10 min.
      REMARQUE: Les étapes 2.1.1 jusqu'à 2.1.4 ne sont requis pour l'installation d'une nouvelle cartouche capillaire.
2. Couplage du capillaire poreux pointe émetteur à ESI-MS
   REMARQUE: Avant le couplage du capillaire de la CE à MS, faire en sorte que l'instrument a été calibré MS et relié au système CE. Régler la tension ESI0. Monter l'instrument avec une source de nanospray MS. Gaz 1, gaz 2 et la température d'interface de chauffage n'a pas été appliquée comme ESI à des débits très faibles se produit simplement en appliquant la tension de pulvérisation d'ions fixé à 1500 V. Réglez le rideau à 5 psi.
   1. Retirer la pointe de pulvérisation de la cartouche en silice fondue à partir du tube de l'eau et l'installer dans l'adaptateur source de nanospray pour coupler à l'instrument MS. Assurez-vous que la hauteur des flacons BGE dans l'instrument de la CE correspond à la hauteur de la pointe du pulvérisateur.
   2. Vérifier l'écoulement de liquide à travers le capillaire conducteur par un rinçage à l'BGE à 50 psi pendant 5 min. Au cours de cette étape de rinçage avec une formation de gouttes à la base de l'aiguille du pulvérisateur ESI doit être observé.
   3. Rincer le capillaire de séparation avec BGE à 50 psi pendant 10 min dans la direction vers l'avant. la formation de goutte doit être observée à la pointe de la pointe émetteur poreuse (pointe du pulvérisateur) lors de cette étape.
   4. Placez la pointe émetteur poreuse à l'entrée de l'entrée MS à une distance de circa 2 à 3 mm.
   5. Appliquer une tension de 30 kV en utilisant un temps de rampe de 1 min et commencer à acquérir des données MS dans la gamme m / z de 65 à 1000 m / z pour les études de profilage métabolique en utilisant d' abord une tension ESI de 0.
      NOTE: Le spectre de masse doit être vide de signal, il ne devrait pas être électrospray.
   6. Régler la tension ESI à 1000 V en poursuivre les données de mesure. Augmenter la tension ESI avec des incréments de 200 V jusqu'à ce qu'un signal de fond constant est observé pendant au moins 15 min.
   7. Optimiser la position poreuse d'émetteur de la pointe par rapport au centre de l'entrée MS en le déplaçant dans le x, y ou z-direction afin de voir quelle position fournit le maximum et le signal de MS plus stable (électrophérogramme ionique total).
   8. Après l'optimisation de la position de la pointe émetteur poreux et déterminer la tension optimale ESI, régler la tension ESI à 0 V et de diminuer la tension de la CE de 30 kV à 1 kV en utilisant un temps de rampe de 5 min.
   9. Créer une méthode MS using la tension optimale ESI et une méthode de CE sur l'instrument de la CE pour l'analyse des normes de métabolites et des échantillons biologiques.

3. Analyse des Métabolite normes et des échantillons biologiques

1. L' évaluation des performances du CE-MS système introducteur
   1. Transférer 20 ul du métabolite mélange standard anionique dans un 100 ul microflacon vide (flacon PCR) qui se loge dans un flacon de CE et de mettre cette fiole dans le plateau d'échantillons d'entrée.
      NOTE: Le volume minimum requis dans le microtube pour une injection fiable est de 2 pl.
      1. Démarrer la méthode du mode d'ions négatifs d'acquisition MS créé lors de l'étape 2.2.9 et commencer ensuite la séquence de la CE à l'aide du logiciel de commande de l'instrument de la CE.
      2. Rincer le capillaire de séparation avec BGE à 50 psi pendant 3 minutes, suivi par une injection de 2,0 psi pendant 60 secondes (20 nl correspondant à 3% du volume capillaire), puis par injection BGE à 1,0 psi pendant 10seconde.
         NOTE: Par la suite, l'acquisition de données MS est déclenchée.
      3. Appliquer une tension de -30 kV avec un temps de rampe de 1,0 min avec une pression de 0,5 psi pendant 30 minutes à l'entrée. Après une séparation électrophorétique 30 min, arrêter l'acquisition de données MS et de diminuer la tension de la CE à -1 kV en utilisant un temps de rampe de 5 min (une diminution progressive de la tension de la CE après la séparation électrophorétique améliore la durabilité de la pointe poreuse capillaire émetteur).
   2. Entre injections échantillons, rincer le capillaire avec de l'eau, 0,1 M d'hydroxyde de sodium, eau et BGE chacun à 30 psi pendant 3 min.
   3. Analyser les données enregistrées par la détermination des temps de migration et l'intensité du signal du mélange métabolite anionique analysé.
   4. Déterminer si les normes de métabolites anioniques apparaissent dans la zone comprise entre 10 et 28 min.
   5. Vérifier si trois isomères de structure apparentée, à savoir, le D-glucose-1-phosphate, du D-glucose-6-phosphate et le D-fructose-6-phosphate sontpartiellement séparé, à savoir, la résolution entre les deux premiers pics est vers 0,75 et des deux derniers sommets est circa 0.50 (voir la figure 1).
      REMARQUE: Une résolution de 1,5 indique une séparation initiale de deux pics adjacents.
   6. Répétez les étapes 3.1.1 et 3.1.2 pour le mélange de métabolite cationique. Assurez-vous que la détection MS est maintenant en mode d'ions positifs et la tension de la C'est de +30 kV.
   7. Analyser les données enregistrées par la détermination des temps de migration et l'intensité du signal du mélange métabolite cationique analysé.
   8. Déterminer si les normes de métabolites cationiques apparaissent dans la zone comprise entre 8 et 22 min. Vérifiez si isoleucine et leucine migrent entre 15 et 15,5 min et déterminer si la résolution est environ 0,5.
2. L' analyse des échantillons biologiques
   1. Répétez les étapes 3.1.1 et 3.1.2 pour le profilage métabolique anionique de l'extrait de la lignée de cellules de glioblastome.
      NOTE: Le con métaboliqueTente obtenue après prétraitement de l'échantillon correspond à une densité cellulaire d'environ 20 cellules / nl, par conséquent, une injection de 20 nl est l'équivalent de 400 cellules par analyse. .
   2. Créer un électrophérogramme d'ions extrait pour l'acide lactique métabolite (m / z 89,0243) en utilisant 5 mDa précision de masse et de vérifier si l'intensité du signal est au- dessus de 100.000 points.
   3. Répétez les étapes 3.1.1 et 3.1.2 pour le profilage métabolique cationique de l'extrait de la lignée de cellules de glioblastome.
      NOTE: Un électrophérogramme ionique total très riche en information doit être observée pour une injection nl 20 dans ce mode.
   4. Après les analyses ou lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation, rincer le capillaire avec de l'eau à 50 psi pendant 15 minutes et stocker la partie d'entrée du capillaire dans un flacon contenant de l'eau et la section poreuse (partie de sortie) dans un tube contenant aussi de l'eau.

Le procédé introducteur CE-MS proposé est capable de fournir très efficace, à savoir les numéros de plaque allant de 60 000 à 400 000, le profil des métabolites actifs anioniques et cationiques , dans des limites de détection nanomolaires à l' aide d' acide acétique à 10% (pH 2,2) en tant que BGE. Les performances de séparation de la méthode pour l'analyse des métabolites actifs anioniques fortement polaires est démontrée pour les trois isomères du phosphate de sucre structurellement apparentées (figure 1). Bien que la séparation de base n'a pas été obtenue pour ces trois analytes, une séparation partielle est suffisante pour permettre leur détection sélective par MS comme ces analytes ont la même masse exacte. Le potentiel du procédé CE-MS introducteur pour le profilage métabolique du nombre limité de cellules, à savoir une injection nl 20 correspond à 400 cellules (densité cellulaire est environ 20 cellules / nl), est démontrée par l'analyse des métabolites cationiques dans un extrait de la lignée de cellules de glioblastome (La figure 2), dans laquelle plus de 300 caractéristiques moléculaires ont été détectés au- dessus d' un rapport S / N ratio ≥ 5.

Figure 1. Analyse des isomères du phosphate de sucre par introducteur CE-MS. Électrophérogramme d'ions extraites pour les trois isomères de phosphate de sucre (25 pM) obtenus avec introducteur CE-MS en mode ion négatif. Conditions expérimentales: BGE, de l'acide acétique à 10% (pH 2,2); Tension de séparation, -30 kV (0,5 livres par pouce carré appliqué à l'entrée du capillaire CE); injection de l'échantillon, 2,0 psi pendant 60 secondes. Reproduit avec la permission 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Analyse de l' isoleucine et la Leucine par introducteur CE-MS. Extrait électrophérogramme d'ions de deux isomères d'acides aminés (25 uM) obtenus avec introducteur CE-MS en mode ion positif. Conditions expérimentales: BGE, de l'acide acétique à 10% (pH 2,2); Tension de séparation, 30 kV; injection de l' échantillon, 2,0 psi pendant 60 secondes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Potentiel d'introducteur CE-MS pour le profilage des métabolites cationiques dans un extrait de lignée cellulaire. Profil métabolique (électrophérogramme ionique total) observée dans un extrait d'une lignée de cellules de glioblastome avec introducteur CE-MS en mode d'ions positifs. Conditions expérimentales: BGE, de l'acide acétique à 10% (pH 2,2); Tension de séparation, 30 kV; injection de l'échantillon, 2,0 psi pendant 60 secondes. Reproduit avec la permission 4 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nous n’avons rien à divulguer.