Article de méthode

Automated Robotic Dispensing Technique d'orientation de surface et Bioprinting de cellules

DOI :

10.3791/54604

⸱

18 novembre 2016

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthodologie de bio-impression utilisant un système de dépôt robotisé automatisé qui intègre des indices de guidage topographique gravés avec le dépôt précis d’une bio-encre en hydrogel portant des cellules. Les cellules imprimées sont directement livrées aux éléments gravés et sont capables de détecter et de s’orienter avec eux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit l'introduction d'éléments de guidage de la cellule, suivie par l'administration directe de cellules à ces caractéristiques dans un bioink d'hydrogel à l'aide d'un système de distribution robotique automatisé. Le bioink particulier a été choisi car il permet aux cellules de sédiments vers et détectent les caractéristiques. Le système de distribution bioprints cellules viables dans bioinks hydrogel en utilisant une contre-pression assistée tête d'impression. Toutefois, le remplacement de la tête d'impression avec un stylet ou d'un scalpel aiguisé, le système de distribution peut également être utilisé pour créer des repères topographiques par gravure de la surface. Le mouvement du stylet peut être programmé par incréments de 10 um dans les directions X, Y et Z. Les rainures modelées ont été capables d'orienter les cellules souches mésenchymateuses, les inciter à adopter une morphologie allongée en alignement avec la direction des rainures. Le motif pourrait être conçu en utilisant un logiciel de traçage dans les lignes droites, des cercles concentriques, et des ondes sinusoïdales. Dans une procédure ultérieure, fibroblastes et les cellules souches mésenchymateuses ont été mises en suspension dans une gélatine bioink 2%, pour bioprinting dans une contre-pression entraînée par extrusion tête d'impression. Le bioink de support de cellule est ensuite imprimée en utilisant les mêmes coordonnées programmées utilisées pour la gravure. Les cellules bioprinted étaient capables de détecter et réagir aux caractéristiques gravées comme démontré par leur orientation allongée selon la direction des rainures gravées.

Introduction

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La structuration délibérée de placement cellulaire permet la formation de cultures qui imitent in vivo organisation cellulaire 1. En effet, la recherche sur l'interaction entre plusieurs types de cellules peut être assisté par l' organisation de leur placement 2,3 spatiale. La plupart des systèmes de mise en forme reposent sur des procédures de modification de surface pour favoriser ou empêcher l'adhérence cellulaire par dépôt de cellules passif subséquente. Bioprinting offre un contrôle spatial et temporel sur les distributions de cellules 1. En plus de ces fonctions, bioprinting a été décrit comme étant un procédé techniquement simple, rapide et rentable pour générer des échafauds géométriquement complexes 4. Il utilise un logiciel de conception assistée par ordinateur et permet l'introduction de cellules dans le procédé de fabrication 4.

Systèmes de Bioprinting ont été classés en fonction de leurs principes de fonctionnement comme laser à base, sur la base d' extrusion-4 sur la base jet d' encre ou. Extrusion bioprinting a été décrit comme la plus prometteuse car elle permet la fabrication de constructions organisées de tailles cliniquement pertinentes dans un laps de temps réaliste 4-6. Elle est réalisée soit par une pression mécanique ou à l'arrière d'extrusion assistée d'un hydrogel bioink de support cellulaire. Dans la méthode présentée ici, la contre-pression a été employée. Comme mentionné précédemment, les cellules sont livrées dans un bioink cytocompatible. Un tel bioink devrait soutenir la fourniture de cellules sans produire de contrainte de cisaillement délétère, et être d'une viscosité suffisante pour maintenir l'intégrité de la trace imprimée, sans effondrement ou de propagation (dénommé «purge d'encre") 7-10.

L'interaction des cellules avec leur surface adhérente est connue pour influencer le comportement cellulaire. La topographie de la surface peut contrôler la forme de la cellule, l' orientation 11, et même le phénotype. En particulier, la fabrication des rainures et des canaux ont été démontrées pour induireune étirée, la morphologie allongée sur plusieurs types de cellules. L'adoption de cette morphologie a été trouvé pour influencer le phénotype des cellules multipotentes et pluripotentes. Par exemple, lorsqu'elles sont alignées sur les rainures, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent la différenciation vers cardiomyocytes 12,13 et les cellules musculaires lisses vasculaires adopter le phénotype contractile sur synthétique 10,14-17.

La cellule alignement des canaux ou des rainures peut être générée sur une surface polymère par un certain nombre de méthodes, par exemple, profonde gravure ionique réactive, lithographie électronique, l' impression directe au laser, laser femtoseconde, photolithographie et gravure plasma sec 18. Ces approches sont souvent longues, nécessitent un appareillage complexe et peut limiter dans la forme du motif généré. En outre, ils ne sont pas synchronisées avec les motifs bioprinting et ne permettent pas de cellularisation immédiat. Le mouvement coordonnée contrôlée d'un automatisésystème de distribution peut suivre des schémas complexes pour le dépôt de solutions. Ici, nous montrons comment le mouvement micrométrique contrôlée peut être exploitée pour créer des canaux pour l'orientation des cellules. Un stylet ou d'un scalpel aiguisé est attaché à la tête d'impression à la place de la seringue d'extrusion et l'équipement peuvent alors graver la surface de polymère sous la direction du logiciel de traçage. La méthode offre une polyvalence dans la conception de modèle et est applicable aux matériaux polymères couramment utilisés en bioingénierie tels que le polystyrène, le PTFE et polycaprolactone. Comme une étape ultérieure à la gravure, les cellules peuvent être directement bioprinted aux rainures rayées. La bioink de gélatine utilisée ici a été en mesure à la fois de maintenir la trace et permettre aux cellules déposées pour détecter les caractéristiques gravées. Les cellules souches mésenchymateuses bioprinted aux rainures gravées ont été démontrées pour allonger le long de ces lignes dans distincts.

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Protocole

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Remarque: Ce protocole décrit l'utilisation d'une contre-pression du système de distribution robotique assistée (Figure 1A) une gravure superficielle (figure 1B) et à base bioprinter extrusion (figure 1C) 10.

1. La modification d'une surface de polystyrène

  1. Utilisez 1 feuilles mm de polystyrène depuis des plaques de culture de tissus de polystyrène ont tendance à incliner vers le haut dans le centre, ruinant la cohérence de la hauteur à la fois la gravure et l'impression.
    Remarque: Comme les feuilles de polystyrène ne sont pas modifiées pour l'adhérence cellulaire, le traitement au plasma est effectué.
  2. traitement au plasma d'oxygène.
    1. Tout d'abord, sélectionner une pression de 2 bars sur le régulateur de la bouteille d'oxygène relié à la machine à plasma. Mettez ensuite la machine à plasma et à saisir les conditions suivantes dans le panneau de commande de l'appareil: 150 W, 30 sscm d'oxygène, 10 min (pour l'alimentation, le débit de gaz et le temps respectivement).
    2. Placer le polystyrène substratee dans la chambre à plasma, sceller la porte et appuyez sur le bouton de démarrage sur le panneau de commande. Faire tremper le plasma d'oxygène du polystyrène traité substrat dans du sérum bovin foetal et laisser incuber à 37 ° C pendant 2 heures avant de laver trois fois le phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS).

2. Programmation Imprimer Patterns

  1. Utilisez le programme First Etch la surface avec un stylet ou Scalpel.
    1. Lors de l'utilisation d'un stylet, d'insérer une aiguille textile diamètre de 1,5 mm (à partir de l'intérieur avec le plus grand soin) dans la buse d'une seringue de distribution (5 ou 10 ml) jusqu'à ce qu'elle soit calée et fixée. Si l'on utilise un scalpel, pour choisir un scalpel rond manipulé de sorte qu'il peut être fixé dans le mécanisme de serrage du bras d'impression.
      NOTE: Le stylet décape motifs incurvés mieux que la lame de scalpel.
    2. Lors de la première tentative de création d'un arrangement bioprinted, esquisser le motif désiré sur du papier millimétré avec axes numérotés pour générer les coordonnées XY. Alors jenput les coordonnées du motif gravé / bioprinted dans le logiciel de feuille de calcul (figure 2).
      NOTE: Le «motif désiré» peut être dans de nombreuses formes telles que linéaire, en forme de S, ou circulaire. Le choix dépend du modèle expérimental nécessaire, telles que les lignes linéaires parallèles pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses à cardiomyocytes comme démontré ici. La fonction graphique de dispersion permet la visualisation du motif de tracé proposé.
    3. Ouvrez l'impression / logiciel de distribution. Sélectionnez "Programme> Ajouter un programme" suivi par "Edition> Ajouter un point" de mettre en place le programme. Export de la coordonnées x et y des valeurs obtenues à partir de la feuille de calcul dans l'impression / distribution de logiciels en utilisant le "copier et coller" fonction.
    4. Calibrer le "z" hauteur du robot avant chaque course afin de placer la buse stylet / d'impression sur la surface.
      1. Dans l'impression / logiciel de distribution, sélectionnez l'option "Robot", cliquez sur "Changer de mode &# 34; et activez l'option "mode d'enseignement». Une fois sélectionné, le logiciel permet la fonction "Jog" du robot.
      2. Pour Jog, d'abord initialiser le robot à sa position par défaut en sélectionnant les commandes suivantes dans la barre de menu; "Robot> Meca Initialize", puis sélectionnez "Robot> Jog". Entrez les valeurs numériques (en mm) dans les "X et Y fentes" nécessaires pour placer le stylet exactement sur l'origine du motif.
      3. Ensuite, l'entrée d'une valeur numérique (en mm) dans la "fente Z" pour placer le stylet ou l'impression de buse en contact avec la surface, mais pas fléchir ou en retrait de la surface. Ce point est désigné comme "Z" valeur de départ.
        REMARQUE: La profondeur de chaque rainure peut varier facilement grâce à la hauteur Z du système. Gorges 40, 80 et 170 um sont mises en évidence à couper dans la surface de 1 mm d' épaisseur des feuilles de polystyrène (figure 4 et tableau 1).
    5. Sélectionnez le pinstruction rint pour chacun des points de coordonnées, à savoir, "Début de ligne Dispense" pour définir le premier point et imprimer initiation, "Line Passing" pour désigner les points intermédiaires et "End of Line Dispense" pour signaler au robot de mettre fin à la tirage.
    6. Communiquer le programme du robot en sélectionnant les commandes de suivi de la barre de menu en haut: "Robot> Envoyer C & T Data".
    7. Initier la gravure / tirage, en changeant le robot en mode "Run". Ne en sélectionnant «Robot> Modification du mode> Switch Mode Run" dans la barre de menu du haut.
    8. Commencez la procédure d'impression en appuyant sur le bouton "start" vert sur la console robot distributeur.

3. Préparation et impression de Gelatin Bioink contenant Cell-

  1. Dissoudre 2% de gélatine dans un milieu essentiel minimum alpha Moyen (aMEM) (complété avec 10% de FBS et 2% d'antibiotique / antimycotic) à 60 ° C pendant 2 heures pour préparer les solutions de bioink.
  2. Pré-culture de la protéine fluorescente rouge exprimant Cellules souches mésenchymateuses (DP-MSCs) à 70% de confluence dans 10 cm des boîtes de culture tissulaire en utilisant aMEM / 10% de FBS. Relâchez les cellules attachées en suspension en retirant le milieu et le revêtement avec 1x solution de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
  3. Pellet les cellules par centrifugation à 1000 xg pendant 5 minutes et retirer le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 ml de 1 x PBS et compter la densité des cellules en utilisant un hémocytomètre.
  4. Après avoir laissé le bioink refroidir à la température ambiante, mélanger doucement dans un volume suffisant pour la suspension de la DP-MSC dans le bioink pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 6 cellules ml - 1.
  5. Verser le bioink de support de cellule dans une seringue d'impression avec la buse étanche. Refroidir la seringue chargée à 4 ° C afin d'obtenir une viscosité d'impression.
  6. Placez la seringue chargée sur le automatisésystème de distribution robotique et fixer les lignes de pression d'air. Retirer le joint Luer de la seringue et fixer la buse d'impression.
  7. Extruder les bioinks cellularisées en lignes minces en utilisant 0,05 MPa-pression, à 5 mm / s vitesse d'écriture à partir d'une seringue de 10 ml par une 27 aiguille G / buse (conique recommandé plus cylindrique) sur une surface de film de polystyrène, après le dépôt pré-programmé schéma décrit à l'étape 2.1 pour placer le bioink cellularisée sur les rainures pré-gravées.
  8. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, on ajoute 10 ml de milieu de croissance (supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques) et on incube les cellules pendant 24 heures (pour permettre aux cellules pour détecter et réagir aux caractéristiques gravées) avant la visualisation à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence au grossissement 10X.

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Résultats

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Les résultats représentatifs montrent que le système de distribution robotique de contre - pression assistée peut être utilisé comme la base bioprinter par extrusion pour réaliser une gravure à la fois de la surface et l' impression bioink (figure 1 A). Il peut être utilisé pour la génération de rainures gravées dans la couche superficielle de polymère, et à imprimer ensuite une bioink de support de cellule directement aux caractéristiques (figure 1 B et C).

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Discussion

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L'étape critique de cette procédure est la livraison de bioprinting réelle des cellules souches comme le processus doit permettre la sédimentation des cellules aux caractéristiques, imprimer sans bioink propagation / saignements, livrer des cellules sans cisaillement mort cellulaire du stress et ne pas déclencher la différenciation vers la lignée non désirée.

Si l'alignement cellulaire attendu ne se produit pas, alors la viscosité de bioink doit être évalué pour son aptitude à l'...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

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Les travaux présentés ici sont soutenus par la Fondation nationale pour la recherche de Singapour dans le cadre du programme CREATE (NRF-Technion) : The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program et par le Public Sector Funding (PSF) 2012 du Science and Engineering Research Council (SERC) sous l’égide de l’Agence pour la science, la technologie et la recherche (A*STAR).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Equipment
Système de distribution robotiséJanome2300N
Machine à plasmaFemto ScienceCovance
USB Microscope
Microscope optiqueOlympusIX71
Name Entreprise Numéro de catalogueComments
Software
SpreadsheetExcel
Excel Printing Co-ordinate SoftwareJanomeJR C-Points
Imaging SoftwareNational Institutes of Health (NIH)ImageJ
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Equipment
Stylus (Blade)OLFAAK-5
5 ml seringue d’impressionSan-ei TechSH10LL-B
30 G aiguille d’impressionSan-ei TechSH30-0.25-B
polystyrène de 1 mmAcheté localement
Sérum de veau fœtalInvitrogen  ;10270-098
Solution saline tamponnée au phosphateGélatine Invitrogen
de peau de porc, force du gel 300, type ASigma Aldrich9000-70-8
&alpha ; MEMInvitrogen41061-029
Antibiotc antimycosiqueSigma AldrichA5955-100ML
Cellules souches mésenchymateuses à protéine fluorescente rouge (RFP-MSCs)Cyagen Biosciences IncorporationRASMX-01201
Feuilles de

Références

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Mots-clés

Gravure de surfaceBio impression de cellulesBio encre hydrogelAssist e par contre pressionSurface de polystyr neTraitement au plasma d oxyg neS rum f tal bovinBio encre de g latineCellules souches m senchymateuses

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