Automated Robotic Dispensing Technique d'orientation de surface et Bioprinting de cellules

L’objectif global de cette technique de distribution robotisée automatisée est de créer une surface pour le guidage topographique des cellules, puis de livrer des cellules à ces entités selon un modèle programmé, permettant de contrôler le comportement et la distribution des cellules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie biomédicale, telles que la façon dont les topologies de surface peuvent affecter le comportement cellulaire, à la fois en monoculture et en co-culture. Le principal avantage de cette technique est qu’il faut moins de temps pour programmer et imprimer le modèle de guidage de cellule par rapport aux méthodes plus établies.

Il comprend également une étape de livraison de cellules pour une distribution contrôlée. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé que des motifs 2D de cellules déposées dans des hydrogels pouvaient bénéficier d’un guidage de surface. C’est pourquoi nous avons développé cette technique pour imprimer des hydrogels d’une manière qui correspondait aux caractéristiques de la surface.

Ce protocole décrit l’utilisation d’un système de distribution robotisé assisté par contre-pression comme bio-imprimante basée sur la gravure de surface et l’extrusion. Pour préparer une surface en polystyrène pour la gravure et l’impression, choisissez une feuille de polystyrène d’un millimètre d’épaisseur. Les feuilles plus épaisses s’inclineront davantage.

Ensuite, traitez la feuille avec du plasma d’oxygène. Réglez le régulateur d’oxygène gazeux sur deux bars. Ensuite, allumez la machine à plasma et allumez la pompe à vide.

Procédez à la programmation de la machine pour 150 watts et 30 centimètres cubes standard par minute de débit d’oxygène gazeux, et exposez la feuille à ces conditions pendant 10 minutes. Ensuite, évacuez la chambre et scellez la porte et démarrez le cycle. Ensuite, immergez la feuille traitée dans du sérum de veau fœtal pur et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant deux heures en l’agitant.

Après le traitement sérum, lavez la feuille trois fois avec 1X PBS et stérilisez la feuille. Après le lavage final, laissez le drap dans un four à 37 degrés Celsius pour sécher pendant la nuit pendant environ 12 heures. Préparez d’abord un stylet d’impression pour la gravure.

Avec le plus grand soin, insérez une aiguille textile de 1,5 millimètre de diamètre dans l’embout d’une seringue de distribution jusqu’à ce qu’elle soit coincée et sécurisée. Lorsque vous essayez pour la première fois de créer un arrangement bio-imprimé, esquissez le motif souhaité sur du papier graphique avec des axes numérotés pour générer les coordonnées x, y. Entrez ensuite les coordonnées du motif dans une feuille de calcul.

Ensuite, dans le logiciel d’impression, sélectionnez Programme, Ajouter un programme, puis Modifier, Ajouter un point pour établir le programme. Ensuite, copiez les valeurs des coordonnées x et y de la feuille de calcul dans le logiciel de distribution d’impression. Avant chaque passage, calibrez la hauteur z du robot pour régler la position de contact du stylet.

Tout d’abord, sélectionnez l’option Robot. Ensuite, cliquez sur Changer de mode et activez l’option Mode d’enseignement. Cela active la fonction JOG du robot.

Pour JOG le robot, mettez d’abord le robot dans sa position par défaut en sélectionnant Robot, Meca Initialize. Puis, Robot, JOG. Ensuite, dans les fentes x et y, entrez la distance en millimètres nécessaire pour placer le stylet exactement à l’origine du motif.

Ensuite, également en millimètres, entrez une valeur numérique dans la fente z pour placer le stylet ou la buse en contact avec la surface sans fléchir ou indenter la surface. C’est ce qu’on appelle la valeur de départ de z. La profondeur de chaque rainure peut être modifiée à l’aide de la hauteur z.

Par exemple, les rainures découpées peuvent avoir une profondeur de 40, 80 ou 170 microns. Il faut de la concentration et une observation attentive pour trouver un point de contact tel qu’il n’y ait pas de flexion du stylet ou d’indentation notable sur la surface. Pour assurer le succès, nous vous recommandons de préparer plusieurs feuilles et d’exécuter le programme à différentes hauteurs z pour trouver la position de départ idéale.

L’étape suivante consiste à définir l’instruction d’impression pour chacun des points de coordonnées. Utilisez Début de la distribution de ligne pour définir le premier point et le lancement de l’impression. Utilisez le passage de ligne pour désigner les points intermédiaires, et enfin, utilisez la distribution de fin de ligne pour signaler au robot de terminer le tirage.

Pour communiquer le programme au robot, sélectionnez Robot, Envoyer les données C&T. Ensuite, lancez l’exécution en sélectionnant Robot, Changement de mode, Changer de mode d’exécution et en basculant le paramètre sur Exécuter. Enfin, lancez l’impression.

Pour fabriquer la bio-encre, dissolvez 2 % de gélatine dans Alpha MEM complété par 10 % de FBS et 2 % d’antimycosique antibiotique. Placez le milieu à 60 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre à la gélatine de se dissoudre dans le milieu. Cultivez les cellules pour la bioencre à 70 % de confluence dans des boîtes de 10 centimètres.

Toutes les cellules répondant aux caractéristiques de guidage de surface peuvent être utilisées et elles doivent exprimer une étiquette fluorescente afin qu’elles puissent être vues pendant le processus d’intégration. Libérez les cellules attachées dans la suspension en retirant le milieu, en lavant les cellules avec du PBS et en enrobant les cellules d’une solution de trypsine-EDTA 1X pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir neutralisé la trypsine avec du milieu, rassemblez les cellules dans une suspension et granulez-les à 1 000 g pendant cinq minutes.

Décrivez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 0,5 millilitres de milieu. Après avoir mesuré la densité cellulaire, mélangez la suspension dans la solution de bio-encre refroidie pour obtenir une solution avec cinq millions de cellules par millimètre. Ensuite, versez la bio-encre contenant des cellules dans une seringue d’impression préparée bloquée par un capuchon de leurre.

Réfrigérez la seringue chargée à quatre degrés Celsius afin d’obtenir une viscosité imprimable. Ensuite, retirez la seringue chargée et réfrigérée, retirez le capuchon de la seringue et fixez la buse d’impression. Ensuite, fixez la seringue chargée dans le système de distribution et connectez-la aux conduites de pression d’air.

Afin d’imprimer la bioencre sur le motif préconçu, les bords et les lignes doivent être distincts. Une impression précise est en effet obtenue en optimisant la contre-pression du distributeur et de la jauge de l’aiguille de la buse d’impression. Réglez la contre-pression du distributeur à 0,05 mégapascals pour une seringue de 10 millilitres avec une aiguille conique de calibre 34.

Ensuite, dans le logiciel, réglez la vitesse d’écriture à cinq millimètres par seconde sur une surface de film de polystyrène. Maintenant, en suivant le motif programmé, déposez la bioencre cellularisée sur les rainures prédécoupées. Après avoir déposé les cellules, laissez incuber la feuille pendant 20 minutes à température ambiante.

Plus tard, couvrez l’échafaudage cellulaire imprimé dans le milieu de croissance approprié et incubez les cellules pendant 24 heures afin qu’elles se fixent avant de poursuivre l’expérimentation. Les cellules souches ensemencées par bio-impression dans la bio-encre ont fini par sédimenter à la surface et ont détecté et allongé le long d’une direction des lignes discrètement gravées. Les cellules ensemencées dans un milieu de culture sans bio-impression se sont également alignées dans la direction des caractéristiques.

Cependant, ils couvraient également toute la surface, de sorte que la bio-encre a contraint les cellules à la trace imprimée. Lorsqu’elles étaient ensemencées sur des feuilles sans les caractéristiques gravées, les cellules ne présentaient aucune orientation ou alignement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de graver avec précision des rainures sur la feuille de polystyrène, puis de bio-imprimer avec précision des cellules dans les rainures.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures environ. Il est très utile pour les chercheurs dans le domaine de la bio-ingénierie d’exposer les interactions de surface cellulaire dans des modèles où l’anisotropie et le positionnement cellulaires sont nécessaires. N’oubliez pas que la bio-encre contient des cellules vivantes et qu’il est très important d’utiliser une technique stérile lors de l’impression des feuilles.