Acquisition rapide des Images 3D Utilisation de haute résolution épiscopique Microscopie

Résumé

Nous décrivons un protocole détaillé utilisant la microscopie épiscopique à haute résolution pour acquérir des images tridimensionnelles (3D) d’embryons de souris. Ce protocole amélioré utilise une méthode modifiée de préparation des tissus pour améliorer la pénétration du colorant fluorescent, permettant ainsi l’analyse morphométrique d’échantillons de petite et de grande taille.

Résumé

La technologie de microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) permet l’acquisition rapide de données morphométriques volumétriques et tridimensionnelles (3D) numériques à haute résolution. Nous décrivons ici le protocole détaillé permettant d’imager l’ensemble de l’embryon de souris. Le protocole se compose de quatre sections principales : la préparation des échantillons, l’intégration, l’acquisition d’images et enfin, la visualisation 3D. La technologie exige que les échantillons soient colorés avec un colorant fluorescent, ce qui peut être problématique pour les échantillons de grande taille ou denses. Pour surmonter cette limitation, nous avons amélioré le protocole existant afin d’améliorer la pénétration tissulaire du colorant en prétraitant l’échantillon avec une solution contenant de l’urée et du dodécylsulfate de sodium. Le protocole n’utilise que des équipements et des réactifs de laboratoire de routine pour une adaptation facile dans des environnements de laboratoire standard. Nous montrons que les images 3D à haute résolution qui en résultent récapitulent fidèlement les caractéristiques morphologiques détaillées des organes internes des embryons de souris, permettant ainsi des analyses morphométriques. Ensemble, nous présentons un protocole détaillé et amélioré utilisant des équipements de laboratoire standard pour acquérir des images 3D haute résolution de spécimens de petite et grande taille.

Introduction

L’avènement des technologies d’imagerie 3D a ouvert la possibilité d’une analyse systémique des caractéristiques morphologiques détaillées au cours du développement fœtal. Une variété de modalités d’imagerie 3D est maintenant disponible, notamment l’imagerie par résonance micromagnétique (micro-IRM), la microtomographie assistée par ordinateur, l’échographie à haute fréquence, la tomographie par cohérence optique, la tomographie de projet optique et la microscopie épiscopique^1-4. Chaque modalité a ses propres caractéristiques uniques en termes de résolution, de contraste, de vitesse, de coût, de capacité in utero et de disponibilité.

La capture d’images par fluorescence épiscopique (EFIC) et la microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) sont des méthodes d’imagerie par microscopie épiscopique⁴. Ici, des images en série haute résolution sont capturées en continu à partir de la face du bloc au lieu de coupes de tissus. Les images résultantes reflètent fidèlement les caractéristiques morphologiques détaillées avec une distorsion tissulaire minimale ou nulle. Les données volumétriques acquises sont facilement converties en images 3D haute résolution adaptées à une analyse morphométrique précise. En raison de leur coût relativement faible et de leur haute résolution, HREM et EPIC sont devenus les alternatives supérieures pour l’évaluation systémique des modèles murins de malformations congénitales humaines^2,4-8.

Les méthodes EFIC et HREM nécessitent toutes deux que les échantillons soient enrobés dans le milieu approprié. L’EFIC détecte l’autofluorescence émise par le tissu incrusté. Pour cette raison, il est limité aux échantillons émettant des niveaux élevés d’autofluorescence, mais pas à ceux avec une autofluorescence relativement faible, comme les embryons à un stade précoce⁹. Pour surmonter la dépendance de l’autofluorescence, les échantillons sont colorés avec un colorant fluorescent tel que l’éosine pour l’imagerie HREM. Les choix de colorants et de méthodes de coloration rendent également les HREM plus compatibles pour détecter les signaux moléculaires dans le contexte de l’architecture et de la morphologie des tissus^4,10.

Dans cet article, nous présentons un protocole HREM amélioré adapté à l’évaluation du corps entier des embryons de souris à un stade avancé. Pour faciliter la coloration, nous incluons une étape de prétraitement pour augmenter la pénétration tissulaire, permettant ainsi l’imagerie HREM d’embryons de souris plus âgés.

Protocole

Toutes les utilisations des animaux sont approuvés par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels à l'Hôpital pour enfants de Boston.

Préparation 1. Echantillon

1. accouplement Timed
   1. Placez un C57BL6 type sauvage mâle et une femelle dans la même cage.
   2. Vérifiez la formation d'un bouchon d'accouplement tôt le lendemain matin. La fiche d'accouplement (aka, vaginale ou la prise de copulation) est un dépôt gélatineux durci qui bloque le vagin.
   3. Réglez la date de prise de jour embryonnaire 0,5 (E0.5).
2. L' isolement d'embryons de souris
   1. Euthanasier femmes enceintes par le CO ₂ asphyxie.
   2. Mettez la souris sur le dos sur un tampon absorbant et pulvériser région abdominale avec 70% d'éthanol.
   3. Soulevez la peau et faire une incision de 5 mm initiale à la région abdominale caudale en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Couper et enlever la peau abdominale pour exposer pleinement les organes internes
   4. Couper près vagina pour enlever tout l'utérus.
   5. Couper entre les sites d'implantation le long de la corne utérine. Chaque segment ou conceptus devraient avoir un seul embryon à l'intérieur.
   6. Gardez les segments de l'utérus en 1x phosphate glacée solution saline tamponnée (PBS).
3. Embryo dissection
   1. Placez chaque conceptus dans un plat séparé avec PBS glacé sous un stéréoscope.
   2. Retirer les tissus utérins, le placenta et puis membranes fœtales utilisant séquentiellement fines pinces à dissection.
   3. Transférer l'embryon disséqué dans un tube de 50 ml avec 1 x PBS glacé en utilisant une grande pipette de transfert. Évitez ramasser embryon directement avec une pince pour minimiser les lésions tissulaires.
4. Fixation
   1. Fixer les embryons disséqués dans 10% neutre solution formaline tamponnée à 4 ° C pendant plus de 24 heures avec au moins 10 volumes de fixateur de l'échantillon.
5. Prétraitement
   1. Préparer la solution de compensation: 4M d'urée, 10% de glycerol, 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l'eau bidistillée.
   2. Remplacer le fixateur avec la solution de compensation.
   3. Tournez doucement l'échantillon sur une bascule à la température ambiante pendant 1 - 2 semaines. Remplacez la solution de compensation une fois sur le deuxième et le troisième jour. L'échantillon devient lentement clair et translucide.
   4. Remplacer la solution d'échange avec 10% de formaline et de laisser sur une bascule pendant 2 jours.
6. déshydration
   1. Laver les échantillons prétraités avec 1 x PBS 3 fois pendant 5 min à chaque fois.
   2. Déshydrater les échantillons dans une série d'éthanol ascendant à la température ambiante sur une bascule douce. Pour les embryons E15.5, utiliser une série ascendante d'éthanol comprenant 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% d'éthanol, 2 h chaque étape. Pour les embryons plus âgés, le temps d'incubation doit être augmentée.
7. tachant
   1. Préparer Coloration Solution: ajoutez 0,1375 grammes de Eosine Y sel disodique et 0,0275 grammes d'acridine orange hémi (chlorure de zinc), le sel de 50 ml d'éthanol à 100%. Agiter pendant 2 heures. Filtrer avec un filtre en papier. Stocker à température ambiante et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d'aluminium.
   2. Transférer l'échantillon de la solution de coloration pendant 1 heure.
   3. Remplacer avec la solution de coloration fraîche et tache pendant la nuit.
8. Infiltration
   1. Préparer Infiltration Solution: combiner 100 ml de solution A de JB-4 kit d'encastrement, 1,25 g de catalyseur C, 0,275 g de Eosine Y disodique Sel et 0,055 g de Acridine orange hémi (chlorure de zinc) de sel. Bien mélanger (200 rpm) dans un seau à glace pendant 2 heures, puis filtrer avec le papier filtre.
   2. Conservez la solution de Infiltration à 4 ° C et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d'aluminium.
   3. Transférer les embryons Infiltration Solution: Solution de coloration (1: 1), et incuber pendant au moins 3 heures sur une bascule à 4 ° C.
   4. Transférer les embryons à l'infiltration Solution et incuber pendant 3 hr sur une bascule dans une chambre froide.
   5. Remplacez Infiltration Solution une fois par jour, et laisser dans une chambre froide sur une bascule douce pendant trois jours.

2. Embedding

1. Gardez Solution B et Infiltration Solution sur la glace.
2. Faire Embedding Solution (1:25 de la solution B et Infiltration Solution) immédiatement avant l'intégration.
3. Orient l'échantillon dans un moule enrobage, puis verser la solution d'enrobage à froid dans le moule intégration en douceur. Réorienter avec une épingle si nécessaire.
4. Utilisez une épingle d'examiner si la solution Embedding est solidifié. Poussez le bloc d'échantillons, et les garnitures si nécessaire.
5. Réorienter le bloc d'échantillons à l'aide du moule séparé pour obtenir une orientation transversale.
6. Mettre un porte-bloc sur le dessus du moule enrobage. Verser délicatement Embedding Solution dans le moule jusqu'à ce que le moule et le support de bloc sont submergés par incorporation Solution.
7. Gardez l'échantillon dans un récipient secondaire et laissersur la glace pendant 3 - 4 heures dans une hotte.
8. Conserver les échantillons solidifiés dans un 4 ° C.
9. Décollez le moule enrobage. Mettez le bloc sous le stéréomicroscope avec éclairage oblique pour inspecter la position de l'échantillon dans le bloc. Sur la face du bloc, marque quadrillage autour de l'échantillon.
10. Coupez le bloc pour retirer le montant de l'accès du matériau d'enrobage en utilisant les lignes de quadrillage marquées comme références.

3. Image Acquisition

1. Fixer le bloc de spécimen à l'microtome et obtenir une surface fraîchement coupée. Épaisseur de la section Set (par exemple, e9.5-10.5, 1,5 pm; e11.5-12.5, 2,0 um; e13.5-15.5, 2,5 um; E16,5-âgés, 3 pm). Gardez l'échantillon / bloc à la position de la maison de microtome.
2. Monter le microscope zoom stéréo face horizontalement la surface du bloc de l'échantillon.
3. Allumez l'ordinateur et d'un microscope, et démarrer le logiciel d'acquisition d'image.
4. Visualiser et concentrer l'optique au bloc-facesous le mode "live view" du logiciel d'imagerie.
5. Alignez microscope et microtome si nécessaire pour que le bloc-face est au centre du viseur.
6. Ajuster le zoom de telle sorte que l'ensemble du bloc-face est dans le viseur.
7. Sélectionnez la protéine fluorescente verte (GFP) filtre (excitation 470 ± 20 nm, dichroïque 495 nm, émission 525 ± 25 nm) et de recentrer si nécessaire.
8. Mesurer et régler le temps d'exposition manuellement (par exemple, 80-400 mini - sec).
9. Acquérir les images du bloc-face après chaque coupe fraîche et enregistrer automatiquement les images si possible.
10. Enregistrez des paramètres importants, y compris la résolution, l'épaisseur de coupe et le zoom.
11. Après avoir terminé l'échantillon entier, l'exportation et convertir tous les fichiers d'image au format JPEG si nécessaire.
12. Inversez toutes les images originales en utilisant un logiciel de traitement d'image, et d'ajuster la luminosité et le contraste.
13. Enregistrer toutes les images traitées dans un dossier séparé.

4. 3DVisualisation

1. Téléchargez toutes les images traitées à un logiciel de visualisation 3D en suivant les instructions.
2. Résolution d'entrée et de l'épaisseur de coupe pour convertir toutes les images à des données volumétriques (taille de voxel) et enregistrez le fichier 3D.
3. Aligner toutes les images en utilisant le mode automatique. Régler les images individuelles manuellement si nécessaire.
4. Enregistrez l'image aligné à un nouveau nom de fichier.
5. Analyser les caractéristiques morphométriques de l'échantillon à l'aide du logiciel de visualisation 3D.

Résultats

Nous avons rapporté des images de MEHR de haute qualité d'embryons de souris entre E9.5 et E13.5 ^8. qualité des embryons en retard par étapes de l'image, cependant, est considérablement compromise en raison de la pénétration tissulaire limitée de l'éosine de colorant fluorescent. Pour augmenter l'efficacité de coloration, nous avons testé plusieurs méthodes de prétraitement qui sont compatibles avec l' imagerie de fluorescence ^11. Plus précisément, les embryons de s...

Discussion

Ici, nous présentons un protocole modifié à l'aide du matériel de laboratoire de routine pour acquérir des images de MEHR série qui sont compatibles pour la visualisation 3D rapide et l'analyse morphométrique de structures complexes. Parce que les images à haute résolution sont prises directement à partir de la face du bloc au lieu des sections individuelles, les caractéristiques morphologiques fines sont préservés et reconstruits rapidement numériquement dans un programme de visualisation 3D.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris	The Jackson Laboratory	C57BL6
Alcool éthylique	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolu, ACS/USP/Kosher
Grade Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Solution de clarification
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	Solution de clarification
Dodécylsulfate de sodium	Invitrogen	15525-017	Solution de clarification
Éosine Y Sel disodique	Fisher scientific	BP241925	Solution d’infiltration
Acridine Orange hemi (chlorure de zinc) sel	Sigma	A6014	Solution d’infiltration
Papier Whatman	GE	3030-153
JB-4 Kit d’intégration - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Solution d’infiltration
JB-4 Kit d’encastrement - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Solution d’enrobage
JB-4  ; Kit d’intégration - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Solution
d’infiltration Moules d’enrobage Polysciences	, Inc.	23185-1
Moules d’encastrement Peel-A-Way Sharp 16	Polysciences, Inc.	18986-1	Carré de 22 mm x 22 mm, tronqué à 12 mm x 12 mm
JB-4  ; Porte-blocs en plastique	Polysciences, Inc.	15899
Tuyaux de transfert gradués jetables	VWR	414004-014
Boîte Petrl VWR		25384-088	Dissection d’embryons
Pince Inox Tip	; ROBOZ	RS-5015	Dissection d’embryons
Graefe Pince à tissus	ROBOZ	RS-5153	Dissection d’embryons
Ciseaux opératoires délicats	; ROBOZ	RS-6700	Dissection d’embryons
14 ml Tubes à fond rond en polypropylène	Falcon	352059
50 ml Tubes coniques en polypropylène	Falcon	352098
Seau à glace	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3,4 oz) Pesée en polystyrène antistatique	VWR	89106-766
330 ml (11,2 oz) Peseuses en polystyrène antistatique	VWR	89106-770
Chlorure de sodium	MP Biomedicals	102892	solution PBS
Chlorure de potassium	Sigma	P0662	Solution PBS
Phosphate de potassium monobasique	Sigma	P5405	Solution PBS
Phosphate de sodium dibasique heptahydraté	Sigma-Aldrich	S9390	Solution PBS
Appareil photo numérique	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminateur	Carl Zeiss	HXP 200C
Microscope stéréo à zoom stéréo	de fluorescence Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Microscope	Olympus	SZX16
Source lumineuse à fibre optique	Leica	KL 1500 LCD
Lame de microtome jetable	VWR	95057-832
Distributeur à bord unique	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira Logiciel 3D	Visage Imaging	5.4
Ordinateur	Dell T7600, 2 disques durs SAS de 900 Go et mémoire
Agitateurs de plate-forme à bascule VWR		40000-304
Agitateur à plaque chauffante standard	VWR	12365-382
Balance analytique	Mettler Toledo	AB54-S