Name: Acquisition rapide des Images 3D Utilisation de haute résolution épiscopique Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Apprenez l'acquisition d'images 3D haute résolution d'embryons de souris par microscopie épiscopique. Cette méthode permet une analyse morphométrique détaillée des structures embryonnaires avec un équipement standard.

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Nous remercions les Drs Yichen Huang, Chunming Guo et Zhenfang Zhou pour leur soutien technique. Cette recherche a été financée par le NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) et l’American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Toutes les utilisations des animaux sont approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation des animaux institutionnels à l&#39;Hôpital pour enfants de Boston. Préparation 1. Echantillon <ol><li> accouplement Timed <ol><li> Placez un C57BL6 type sauvage mâle et une femelle dans la même cage. </li><li> Vérifiez la formation d&#39;un bouchon d&#39;accouplement tôt le lendemain matin. La fiche d&#39;accouplement (aka, vaginale ou la prise de copulation) est un dépôt gélatineux durci qui bloque le vagin. </li><li> Réglez la date de prise de jour embryonnaire 0,5 (E0.5). </li></ol></li><li> L&#39; isolement d&#39;embryons de souris <ol><li> Euthanasier femmes enceintes par le CO 2 asphyxie. </li><li> Mettez la souris sur le dos sur un tampon absorbant et pulvériser région abdominale avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Soulevez la peau et faire une incision de 5 mm initiale à la région abdominale caudale en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Couper et enlever la peau abdominale pour exposer pleinement les organes internes </li><li> Couper près vagina pour enlever tout l&#39;utérus. </li><li> Couper entre les sites d&#39;implantation le long de la corne utérine. Chaque segment ou conceptus devraient avoir un seul embryon à l&#39;intérieur. </li><li> Gardez les segments de l&#39;utérus en 1x phosphate glacée solution saline tamponnée (PBS). </li></ol></li><li> Embryo dissection <ol><li> Placez chaque conceptus dans un plat séparé avec PBS glacé sous un stéréoscope. </li><li> Retirer les tissus utérins, le placenta et puis membranes fœtales utilisant séquentiellement fines pinces à dissection. </li><li> Transférer l&#39;embryon disséqué dans un tube de 50 ml avec 1 x PBS glacé en utilisant une grande pipette de transfert. Évitez ramasser embryon directement avec une pince pour minimiser les lésions tissulaires. </li></ol></li><li> Fixation <ol><li> Fixer les embryons disséqués dans 10% neutre solution formaline tamponnée à 4 ° C pendant plus de 24 heures avec au moins 10 volumes de fixateur de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Prétraitement <ol><li> Préparer la solution de compensation: 4M d&#39;urée, 10% de glycerol, 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l&#39;eau bidistillée. </li><li> Remplacer le fixateur avec la solution de compensation. </li><li> Tournez doucement l&#39;échantillon sur une bascule à la température ambiante pendant 1 - 2 semaines. Remplacez la solution de compensation une fois sur le deuxième et le troisième jour. L&#39;échantillon devient lentement clair et translucide. </li><li> Remplacer la solution d&#39;échange avec 10% de formaline et de laisser sur une bascule pendant 2 jours. </li></ol></li><li> déshydration <ol><li> Laver les échantillons prétraités avec 1 x PBS 3 fois pendant 5 min à chaque fois. </li><li> Déshydrater les échantillons dans une série d&#39;éthanol ascendant à la température ambiante sur une bascule douce. Pour les embryons E15.5, utiliser une série ascendante d&#39;éthanol comprenant 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% d&#39;éthanol, 2 h chaque étape. Pour les embryons plus âgés, le temps d&#39;incubation doit être augmentée. </li></ol></li><li> tachant <ol><li> Préparer Coloration Solution: ajoutez 0,1375 grammes de Eosine Y sel disodique et 0,0275 grammes d&#39;acridine orange hémi (chlorure de zinc), le sel de 50 ml d&#39;éthanol à 100%. Agiter pendant 2 heures. Filtrer avec un filtre en papier. Stocker à température ambiante et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Transférer l&#39;échantillon de la solution de coloration pendant 1 heure. </li><li> Remplacer avec la solution de coloration fraîche et tache pendant la nuit. </li></ol></li><li> Infiltration <ol><li> Préparer Infiltration Solution: combiner 100 ml de solution A de JB-4 kit d&#39;encastrement, 1,25 g de catalyseur C, 0,275 g de Eosine Y disodique Sel et 0,055 g de Acridine orange hémi (chlorure de zinc) de sel. Bien mélanger (200 rpm) dans un seau à glace pendant 2 heures, puis filtrer avec le papier filtre. </li><li> Conservez la solution de Infiltration à 4 ° C et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Transférer les embryons Infiltration Solution: Solution de coloration (1: 1), et incuber pendant au moins 3 heures sur une bascule à 4 ° C. </li><li> Transférer les embryons à l&#39;infiltration Solution et incuber pendant 3 hr sur une bascule dans une chambre froide. </li><li> Remplacez Infiltration Solution une fois par jour, et laisser dans une chambre froide sur une bascule douce pendant trois jours. </li></ol></li></ol> 2. Embedding <ol><li> Gardez Solution B et Infiltration Solution sur la glace. </li><li> Faire Embedding Solution (1:25 de la solution B et Infiltration Solution) immédiatement avant l&#39;intégration. </li><li> Orient l&#39;échantillon dans un moule enrobage, puis verser la solution d&#39;enrobage à froid dans le moule intégration en douceur. Réorienter avec une épingle si nécessaire. </li><li> Utilisez une épingle d&#39;examiner si la solution Embedding est solidifié. Poussez le bloc d&#39;échantillons, et les garnitures si nécessaire. </li><li> Réorienter le bloc d&#39;échantillons à l&#39;aide du moule séparé pour obtenir une orientation transversale. </li><li> Mettre un porte-bloc sur le dessus du moule enrobage. Verser délicatement Embedding Solution dans le moule jusqu&#39;à ce que le moule et le support de bloc sont submergés par incorporation Solution. </li><li> Gardez l&#39;échantillon dans un récipient secondaire et laissersur la glace pendant 3 - 4 heures dans une hotte. </li><li> Conserver les échantillons solidifiés dans un 4 ° C. </li><li> Décollez le moule enrobage. Mettez le bloc sous le stéréomicroscope avec éclairage oblique pour inspecter la position de l&#39;échantillon dans le bloc. Sur la face du bloc, marque quadrillage autour de l&#39;échantillon. </li><li> Coupez le bloc pour retirer le montant de l&#39;accès du matériau d&#39;enrobage en utilisant les lignes de quadrillage marquées comme références. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Fixer le bloc de spécimen à l&#39;microtome et obtenir une surface fraîchement coupée. Épaisseur de la section Set (par exemple, e9.5-10.5, 1,5 pm; e11.5-12.5, 2,0 um; e13.5-15.5, 2,5 um; E16,5-âgés, 3 pm). Gardez l&#39;échantillon / bloc à la position de la maison de microtome. </li><li> Monter le microscope zoom stéréo face horizontalement la surface du bloc de l&#39;échantillon. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur et d&#39;un microscope, et démarrer le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Visualiser et concentrer l&#39;optique au bloc-facesous le mode &quot;live view&quot; du logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Alignez microscope et microtome si nécessaire pour que le bloc-face est au centre du viseur. </li><li> Ajuster le zoom de telle sorte que l&#39;ensemble du bloc-face est dans le viseur. </li><li> Sélectionnez la protéine fluorescente verte (GFP) filtre (excitation 470 ± 20 nm, dichroïque 495 nm, émission 525 ± 25 nm) et de recentrer si nécessaire. </li><li> Mesurer et régler le temps d&#39;exposition manuellement (par exemple, 80-400 mini - sec). </li><li> Acquérir les images du bloc-face après chaque coupe fraîche et enregistrer automatiquement les images si possible. </li><li> Enregistrez des paramètres importants, y compris la résolution, l&#39;épaisseur de coupe et le zoom. </li><li> Après avoir terminé l&#39;échantillon entier, l&#39;exportation et convertir tous les fichiers d&#39;image au format JPEG si nécessaire. </li><li> Inversez toutes les images originales en utilisant un logiciel de traitement d&#39;image, et d&#39;ajuster la luminosité et le contraste. </li><li> Enregistrer toutes les images traitées dans un dossier séparé. </li></ol> 4. 3DVisualisation <ol><li> Téléchargez toutes les images traitées à un logiciel de visualisation 3D en suivant les instructions. </li><li> Résolution d&#39;entrée et de l&#39;épaisseur de coupe pour convertir toutes les images à des données volumétriques (taille de voxel) et enregistrez le fichier 3D. </li><li> Aligner toutes les images en utilisant le mode automatique. Régler les images individuelles manuellement si nécessaire. </li><li> Enregistrez l&#39;image aligné à un nouveau nom de fichier. </li><li> Analyser les caractéristiques morphométriques de l&#39;échantillon à l&#39;aide du logiciel de visualisation 3D. </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29, 700-711 (2013).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+model+mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).</li>
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<li>Anderson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+intrapericardial+arterial+trunks+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice.</a> Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).</li>
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<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un protocole modifié à l&#39;aide du matériel de laboratoire de routine pour acquérir des images de MEHR série qui sont compatibles pour la visualisation 3D rapide et l&#39;analyse morphométrique de structures complexes. Parce que les images à haute résolution sont prises directement à partir de la face du bloc au lieu des sections individuelles, les caractéristiques morphologiques fines sont préservés et reconstruits rapidement numériquement dans un programme de visualisation 3D. <p class="jove...

L’avènement des technologies d’imagerie 3D a ouvert la possibilité d’une analyse systémique des caractéristiques morphologiques détaillées au cours du développement fœtal. Une variété de modalités d’imagerie 3D est maintenant disponible, notamment l’imagerie par résonance micromagnétique (micro-IRM), la microtomographie assistée par ordinateur, l’échographie à haute fréquence, la tomographie par cohérence optique, la tomographie de projet optique et la microscopie épiscopique1-4. Chaque modalité a ses propres caractéristiques uniques en termes de résolution, de contraste, de vitesse, de coût, de capacité in utero et de disponibilité.
La capture d’images par fluorescence épiscopique (EFIC) et la microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) sont des méthodes d’imagerie par microscopie épiscopique4. Ici, des images en série haute résolution sont capturées en continu à partir de la face du bloc au lieu de coupes de tissus. Les images résultantes reflètent fidèlement les caractéristiques morphologiques détaillées avec une distorsion tissulaire minimale ou nulle. Les données volumétriques acquises sont facilement converties en images 3D haute résolution adaptées à une analyse morphométrique précise. En raison de leur coût relativement faible et de leur haute résolution, HREM et EPIC sont devenus les alternatives supérieures pour l’évaluation systémique des modèles murins de malformations congénitales humaines2,4-8.
Les méthodes EFIC et HREM nécessitent toutes deux que les échantillons soient enrobés dans le milieu approprié. L’EFIC détecte l’autofluorescence émise par le tissu incrusté. Pour cette raison, il est limité aux échantillons émettant des niveaux élevés d’autofluorescence, mais pas à ceux avec une autofluorescence relativement faible, comme les embryons à un stade précoce9. Pour surmonter la dépendance de l’autofluorescence, les échantillons sont colorés avec un colorant fluorescent tel que l’éosine pour l’imagerie HREM. Les choix de colorants et de méthodes de coloration rendent également les HREM plus compatibles pour détecter les signaux moléculaires dans le contexte de l’architecture et de la morphologie des tissus4,10.
Dans cet article, nous présentons un protocole HREM amélioré adapté à l’évaluation du corps entier des embryons de souris à un stade avancé. Pour faciliter la coloration, nous incluons une étape de prétraitement pour augmenter la pénétration tissulaire, permettant ainsi l’imagerie HREM d’embryons de souris plus âgés.

<table><tbody><tr><td>Souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, Absolu, ACS/USP/Kosher</td></tr><tr><td>Grade Formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Solution de clarification</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>Solution de clarification</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Solution de clarification</td></tr><tr><td>Éosine Y Sel disodique</td><td>Fisher scientific</td><td>BP241925</td><td>Solution d’infiltration</td></tr><tr><td>Acridine Orange hemi (chlorure de zinc) sel</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Solution d’infiltration</td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Kit d’intégration - Solution A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Solution d’infiltration</td></tr><tr><td>JB-4 Kit d’encastrement - Solution B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Solution d’enrobage</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp ; Kit d’intégration - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Solution</td></tr><tr><td>d’infiltration Moules d’enrobage Polysciences</td><td>, Inc.</td><td>23185-1</td><td></td></tr><tr><td>Moules d’encastrement Peel-A-Way Sharp 16</td> x 8 mm <td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>Carré de 22 mm x 22 mm, tronqué à 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp ; Porte-blocs en plastique</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Tuyaux de transfert gradués jetables</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Boîte Petrl VWR</td><td></td><td>25384-088</td><td>Dissection d’embryons</td></tr><tr><td>Pince Inox Tip</td><td>&nbsp ; ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Dissection d’embryons</td></tr><tr><td>Graefe Pince à tissus</td><td> ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Dissection d’embryons</td></tr><tr><td>Ciseaux opératoires délicats</td><td>&nbsp ; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Dissection d’embryons</td></tr><tr><td>14 ml Tubes à fond rond en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Seau à glace</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3,4 oz) Pesée en polystyrène antistatique</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11,2 oz) Peseuses en polystyrène antistatique</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>solution PBS</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Solution PBS</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Solution PBS</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>Solution PBS</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréo à zoom stéréo</td><td>de fluorescence Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse à fibre optique</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microtome jetable</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur à bord unique</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira Logiciel 3D</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>Dell T7600, 2 disques durs SAS de 900 Go et mémoire</td><td></td><td></td>DDR3 RDIMM de 64 Go</tr><tr><td>Agitateurs de plate-forme à bascule VWR</td><td></td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à plaque chauffante standard</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

acquisition rapide des images 3d utilisation de haute résolution épiscopique microscopie

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

La technologie de microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) permet l’acquisition rapide de données morphométriques volumétriques et tridimensionnelles (3D) numériques à haute résolution. Nous décrivons ici le protocole détaillé permettant d’imager l’ensemble de l’embryon de souris. Le protocole se compose de quatre sections principales : la préparation des échantillons, l’intégration, l’acquisition d’images et enfin, la visualisation 3D. La technologie exige que les échantillons soient colorés avec un colorant fluorescent, ce qui peut être problématique pour les échantillons de grande taille ou denses. Pour surmonter cette limitation, nous avons amélioré le protocole existant afin d’améliorer la pénétration tissulaire du colorant en prétraitant l’échantillon avec une solution contenant de l’urée et du dodécylsulfate de sodium. Le protocole n’utilise que des équipements et des réactifs de laboratoire de routine pour une adaptation facile dans des environnements de laboratoire standard. Nous montrons que les images 3D à haute résolution qui en résultent récapitulent fidèlement les caractéristiques morphologiques détaillées des organes internes des embryons de souris, permettant ainsi des analyses morphométriques. Ensemble, nous présentons un protocole détaillé et amélioré utilisant des équipements de laboratoire standard pour acquérir des images 3D haute résolution de spécimens de petite et grande taille.

Nous avons rapporté des images de MEHR de haute qualité d&#39;embryons de souris entre E9.5 et E13.5 8. qualité des embryons en retard par étapes de l&#39;image, cependant, est considérablement compromise en raison de la pénétration tissulaire limitée de l&#39;éosine de colorant fluorescent. Pour augmenter l&#39;efficacité de coloration, nous avons testé plusieurs méthodes de prétraitement qui sont compatibles avec l&#39; imagerie de fluorescence 11. Plus précisémen...

Nous décrivons un protocole détaillé utilisant la microscopie épiscopique à haute résolution pour acquérir des images tridimensionnelles (3D) d’embryons de souris. Ce protocole amélioré utilise une méthode modifiée de préparation des tissus pour améliorer la pénétration du colorant fluorescent, permettant ainsi l’analyse morphométrique d’échantillons de petite et de grande taille.

Acquisition rapide des Images 3D Utilisation de haute résolution épiscopique Microscopie

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

L'objectif général de ce protocole est d'acquérir rapidement des images numériques 3D de haute résolution de spécimens biologiques en utilisant du matériel de laboratoire standard. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie du développement grâce à la visualisation et à l'analyse des dynamiques des caractéristiques morphologiques complexes. Les principaux avantages de cette technique résident dans l'utilisation de matériel de laboratoire courant et dans le fait qu'elle exige une expérience préalable minimale.La procédure sera démontrée par Jungang Huang, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Après la dissection et la fixation de l'embryon conformément au protocole décrit dans le texte, remplacez le fixateur par la solution de clarification et faites tourner doucement l'échantillon sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant une à deux semaines. À la fin de l'incubation, transférez l'échantillon dans du formol à 10 % et laissez-le sur l'agitateLe troisième jour, laver l'échantillon dans du PBS en effectuant trois lavages de cinq minutes chacun. Ensuite, déshydrater les échantillons dans une série croissante d'éthanol à température ambiante, sur un agitateur doux pendant deux heures par concentration. Après la déshydratation à 100 % d'éthanol, transférer l'échantillon dans la solution de coloration pendant une heure, à l'abri de la lumière.Ensuite, remplacez la solution par une solution de marquage fraîche pour une étiquetage nocturne de l'échantillon. Le lendemain matin, immergez l'échantillon dans un mélange volume à volume de 1:1 de solutions fraîchement préparées d'infiltration et de marquage pendant au moins trois heures sur un agitateur à quatre degrés Celsius. À la fin de l'incubation, transférez l'embryon dans la solution d'infiltration pour une incubation supplémentaire de trois heures avec agitation.Ensuite, remplacez le surnageant par une solution d'infiltration fraîche pendant trois jours supplémentaires d'agitation à quatre degrés Celsius. Le quatrième jour, orientez l'embryon dans un moule d'inclusion et placez le moule sur de la glace. Mélangez la solution B avec la solution d'infiltration, puis immergez délicatement le moule dans la solution d'inclusion froide à quatre degrés Celsius.Après environ trois heures, utilisez une pointe pour vérifier que la solution est solidifiée, puis extrayez l'échantillon du moule. Supprimez tout excès de matériau d'encapsulation, puis réorientez le bloc d'échantillon dans un nouveau moule selon une orientation croisée. Ensuite, placez l'ensemble sur de la glace dans une hotte aspirante.Ajouter délicatement la solution d'encapsulation dans le nouveau moule jusqu'à ce que le moule soit immergé. Ensuite, placer un support de bloc sur le dessus du moule. Après trois à quatre heures, retirer délicatement le moule d'encapsulation et placer le bloc sous un microscope stéréo avec un éclairage oblique afin de déterminer la position de l'échantillon à l'intérieur du bloc.Sur la surface du bloc, tracer des lignes de quadrillage autour de l'échantillon et utiliser ces lignes comme guide pour découper l'excès de matériau d'inclusion. Pour imager l'échantillon, fixer d'abord le bloc sur un microtome et réaliser une coupe fraîche de la surface de l'échantillon. Puis monter un microscope stéréo à zoom horizontalement, orienté vers la surface du bloc de l'échantillon, et allumer le microscope ainsi que l'ordinateur associé.Ensuite, lancez le logiciel d'acquisition d'images et utilisez le mode de visualisation en direct dans le logiciel d'imagerie pour focaliser les optiques sur la surface du bloc. Ajustez le microscope et le microtome selon les besoins afin que la surface du bloc se trouve au centre du viseur. L'une des étapes les plus critiques de cette procédure consiste à acquérir des images à la position fixe de repos du microtome.Réglez le zoom pour vous assurer que toute la surface du bloc se trouve dans le viseur. Ensuite, sélectionnez le filtre de la protéine fluorescente verte. Procédez à la coupe préliminaire du bloc jusqu'à ce que le tissu de l'échantillon apparaisse, et recentrez l'image selon les besoins.Après avoir mesuré et réglé manuellement le temps d'exposition, acquérez et enregistrez des images de la surface du bloc après chaque coupe fraîche, et notez les paramètres importants d'acquisition d'images. À la fin de la séance d'acquisition, exportez et convertissez tous les fichiers d'image au format JPEG, puis utilisez le logiciel de traitement d'image approprié pour inverser toutes les images originales, en ajustant la luminosité et le contraste des images selon les besoins. Téléversez toutes les images traitées vers un logiciel de visualisation 3D, en suivant les instructions.Alignez toutes les images en utilisant le mode automatique, puis affichez les résultats en 3D et en 2D. Cette image représentative montre une vue de surface en montage entier d’un embryon de souris au jour embryonnaire 15,5, préparé et imagé comme vient de l’être démontré. Les caractéristiques morphologiques détaillées de la peau, notamment les bourrelets des vibrisses et les follicules pileux en développement, peuvent être observées.Il est important de noter que la résolution de la vue en coupe virtuelle d'un spécimen de jour embryonnaire 15,5, obtenu par cette méthode, est comparable à celle d'une coupe histologique standard. Une fois maîtrisée, l'ensemble de la procédure peut être réalisé en une semaine après le prétraitement avec la solution de clarification, à condition qu'elle soit correctement exécutée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de garder la solution de coloration protégée de la lumière à quatre degrés pendant les étapes d'infiltration et d'encapsulation.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme la coloration à l'échelle, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les profils de distribution spécifiques des types cellulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser du matériel de laboratoire pour acquérir des images 3D haute résolution d'échantillons biologiques destinés à leur analyse morphométrique. N'oubliez pas que l'utilisation de solutions de fixation, de coloration et d'infiltration peut être extrêmement dangereuse, et que des précautions telles que le travail sous hotte chimique et le port de gants doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro ordinateur (TAO).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Les informations spatio-temporelles sur les protéines dynamiques à l’intérieur des cellules vivantes sont cruciales pour comprendre la biologie. Un type de microscopie à super-résolution appelé microscopie à illumination rapide structurée en 3D (f3D-SIM) révèle des informations uniques sur l’anneau cytocinétique Z chez les bactéries : à la fois son apparence en forme de perle et la dynamique rapide de FtsZ à l’intérieur de l’anneau.

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Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l'exocytose.

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Récemment, nous avons cartographié les emplacements de spatiales en trois dimensions (3D) de voies de transport pour différentes protéines translocation à l’intérieur des cils primaires dans des cellules vivantes. Ici ce détails papier expérimental, le processus d’échantillons biologiques et les analyses de données pour la fluorescence 3D Super-resolution imaging approche nouvellement appliqués en live cils primaires.

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