Acquisition rapide des Images 3D Utilisation de haute résolution épiscopique Microscopie

L’objectif global de ce protocole est d’acquérir rapidement des images numériques 3D haute résolution d’échantillons biologiques à l’aide d’un équipement de laboratoire standard. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement grâce à la visualisation et à la dynamique de caractéristiques morphologiques complexes. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle utilise un équipement de laboratoire standard et nécessite un minimum d’expérience préalable.

Jungang Huang, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après la dissection et la fixation de l’embryon comme décrit dans le protocole textuel, remplacez le fixateur par une solution éclaircissante et faites pivoter doucement l’échantillon sur une bascule à température ambiante pendant une à deux semaines. À la fin de l’incubation, transférez l’échantillon dans du formol à 10 % et laissez-le sur le berceau pendant deux jours supplémentaires.

Le troisième jour, lavez l’échantillon dans du PBS pendant trois lavages de cinq minutes. Ensuite, déshydratez les échantillons dans une série ascendante d’éthanol à température ambiante, sur une bascule douce pendant deux heures pour chaque concentration. Après la déshydratation à 100 % d’éthanol, transférez l’échantillon dans une solution de coloration pendant une heure, à l’abri de la lumière.

Ensuite, remplacez la solution par une solution de coloration fraîche pour l’étiquetage de nuit de l’échantillon. Le lendemain matin, immergez l’échantillon dans un mélange volume à volume de solutions d’infiltration et de coloration fraîchement préparées pendant au moins trois heures sur une bascule à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, transférez l’embryon dans une solution d’infiltration pour une autre incubation à bascule de trois heures.

Remplacez ensuite le surnageant par une solution d’infiltration fraîche pour trois jours supplémentaires de balancement à quatre degrés Celsius. Le quatrième jour, orientez l’embryon dans un moule d’enrobage et placez le moule sur de la glace. Mélangez la solution B avec la solution d’infiltration, puis immergez doucement le moule dans une solution d’enrobage à froid à quatre degrés Celsius.

Après environ trois heures, utilisez un embout pour confirmer que la solution s’est solidifiée et poussez l’échantillon hors du moule. Coupez tout excès de matériau d’enrobage, puis réorientez le bloc d’échantillon dans un nouveau moule en orientation transversale. Ensuite, placez l’ensemble de l’installation sur de la glace dans une hotte.

Ajoutez doucement la solution d’enrobage dans le nouveau moule jusqu’à ce que le moule soit immergé. Ensuite, placez un porte-bloc sur le dessus du moule. Au bout de trois à quatre heures, décollez le moule d’enrobage et placez le bloc sous un stéréomicroscope avec éclairage oblique pour déterminer la position de l’échantillon à l’intérieur du bloc.

Sur la face du bloc, marquez des lignes de grille autour de l’échantillon et utilisez les lignes comme guides pour couper tout excès de matériau d’enrobage. Pour imager l’échantillon, fixez d’abord le bloc à un microtome et obtenez une coupe de surface fraîche de l’échantillon. Montez ensuite un microscope à zoom stéréoscopique horizontalement face à la face du bloc de l’échantillon, puis allumez le microscope et l’ordinateur qui l’accompagne.

Ensuite, démarrez le logiciel d’acquisition d’images et utilisez le mode d’affichage en direct dans le logiciel d’imagerie pour focaliser l’optique sur la face du bloc. Alignez le microscope et le microtome si nécessaire, de sorte que la face du bloc soit au centre du viseur. L’une des étapes les plus critiques de cette procédure consiste à acquérir des images à la position d’origine fixe du microtome.

Ajustez le zoom pour vous assurer que toute la face du bloc se trouve dans le viseur. Sélectionnez ensuite le filtre protéiné fluorescent vert. Procédez à la prédécoupe du bloc jusqu’à ce que le tissu de l’échantillon apparaisse, et recentrez l’image si nécessaire.

Après avoir mesuré et réglé manuellement le temps d’exposition, acquérez et enregistrez des images de la face du bloc après chaque nouvelle coupe, et enregistrez les paramètres importants d’acquisition d’images. À la fin de la session d’imagerie, exportez et convertissez tous les fichiers d’image au format JPEG, et utilisez le logiciel de traitement d’image approprié pour inverser toutes les images d’origine, en ajustant la luminosité et le contraste des images si nécessaire. Téléchargez toutes les images traitées dans un logiciel de visualisation 3D, en suivant les instructions.

Alignez toutes les images à l’aide du mode automatique et affichez les résultats 3D et 2D. Dans cette image représentative d’une vue de surface complète d’un embryon de souris de jour 15,5, préparé et imagé comme nous venons de le démontrer. Les caractéristiques morphologiques détaillées de la peau, y compris les coussinets de moustaches et les follicules pileux en développement, peuvent être observées.

Il est important de noter que la résolution de la vue en coupe virtuelle d’un échantillon embryonnaire du jour 15,5 imagé par cette méthode est similaire à celle d’une coupe histologique standard. Une fois maîtrisé, l’ensemble de la procédure après le prétraitement avec la solution de clarification peut être terminé en une semaine, s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder la solution de coloration à l’abri de la lumière à quatre degrés pendant l’étape d’infiltration et d’intégration.

Après cette procédure, d’autres méthodes, comme la coloration à l’échelle, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les modèles de distribution spécifiques aux types de cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’équipement de laboratoire pour acquérir des images 3D haute résolution d’échantillons biologiques pour leur analyse morphométrique. N’oubliez pas que travailler avec une solution de fixation, de coloration et d’infiltration peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’utilisation d’une hotte et le port de gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.