Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Brug RNA-sekventering til Detect Novel Splice Varianter Relateret til Drug Resistance i Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54714
Automatic Translation
1,2,3, 1, 4, 3, 5, 6, 1,7, *1, *3,8,9
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokol til formål at undersøge effekten af ​​afvigende splejsning på resistens i solide tumorer og blodkræftsygdomme. Til dette mål, vi analyserede transkriptom profiler af forældrenes og resistente in vitro modeller gennem RNA-seq og etablerede et QRT-PCR-metode til at validere kandidatgener.

Abstract

Lægemiddelresistens fortsat et stort problem i behandlingen af ​​kræft for såvel blodkræftsygdomme som solide kræftsvulster. Iboende eller erhvervet resistens kan være forårsaget af en række mekanismer, herunder øget lægemiddelelimination, nedsat optagelse af lægemiddel, medikament inaktivering og ændringer af lægemiddelkandidater. Nylige data viste, at anden måde end ved kendte genetiske (mutation, amplifikation) og epigenetiske (DNA hypermethylering, histon post-translationel modifikation) modifikationer, drug resistensmekanismer kan også reguleres ved splejsning aberrationer. Dette er en hastigt voksende felt af undersøgelse, der fortjener fremtidig opmærksomhed for at planlægge mere effektive behandlingsmetoder. Den i dette dokument Protokollen skal undersøge virkningen af ​​uregelmæssig splejsning på lægemiddelresistens i solide tumorer og hæmatologiske maligniteter. Til dette mål, vi analyserede transkriptom profiler af flere in vitro modeller gennem RNA-seq og etablereed en QRT-PCR-metode til at validere kandidatgener. Især vi vurderet den differentielle splejsning af DDX5 og PKM udskrifter. Den uregelmæssig splejsning detekteres af beregningsmæssige værktøj MATS blev valideret i leukæmiceller, der viser, at forskellige DDX5 splejsningsvarianter er udtrykt i de parentale vs. resistente celler. I disse celler har vi også observeret en højere PKM2 / PKM1-forhold, som ikke blev detekteret i Panc-1 gemcitabin-resistent modstykke i forhold til parentale Panc-1-celler, hvilket antyder en anden mekanisme af lægemiddel-resistens fremkaldt af gemcitabin eksponering.

Introduction

Trods betydelige fremskridt i kræftbehandlingen, modstand af maligne celler til kemoterapi, enten iboende eller erhvervet ved længere tids påvirkning af narkotika, er den vigtigste årsag til behandlingssvigt i en bred vifte af leukæmi og solide tumorer 1.

For at afgrænse mekanismerne bag resistens, in vitro cellelinie modeller er udviklet ved trinvis udvælgelse af kræftceller resistente over for kemoterapeutiske midler. Denne procedure efterligner regimer anvendt i de kliniske omgivelser og tillader derfor indgående efterforskning af relevante resistensmekanismer. Resistente celler, som overlever behandling derefter skelnes fra parentale følsomme celler ved hjælp cellelevedygtighed / cytotoksicitetsassays 2. In vitro medikamentresistens profiler af primære celler har vist sig at være signifikant relateret til klinisk respons på kemoterapi 3.

High-throughput cytotoxicity assays udgør en bekvem metode til at bestemme lægemiddelfølsomhed in vitro. Heri er levedygtigheden af celler vurderet ved for eksempel 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid - MTT assay 4, som er baseret på metabolisk omdannelse af visse substrater (dvs. tetrazoliumsalte) i farvede produkter, og dermed afspejler den mitokondrielle aktivitet af celler. Alternativt kan det cellulære proteinindhold kvantificeres ved anvendelse af sulforhodamin B (SRB) assay 5. Her er antallet af levedygtige celler er proportional med den optiske densitet (OD) målt ved en passende bølgelængde i et spektrofotometer, uden behov for omfattende og tidskrævende celletælling procedurer. Vækstinhiberingen induceret af en bestemt kemoterapeutisk lægemiddel kan beregnes på basis af OD af brøndene, hvor celler blev behandlet med et testmiddel og sammenlignes med OD af ubehandlede kontrolceller. En dosis-respons-kurve er SKAFFESined ved afbildning lægemiddelkoncentrationer versus procentdele af levedygtige celler i forhold til kontrolceller. Endelig kan lægemiddelfølsomhed rapporteres som den koncentration, som resulterer i 50% af cellevækstinhiberingen sammenlignet med ubehandlede celler (IC50).

Mekanismerne bag lægemiddelresistens omfatter mange forskellige abnormiteter, såsom ændringer påvirker genekspression af determinanter for lægemiddelaktivitet og cellulær metabolisme. Disse molekylære læsioner, herunder mutationer, afvigelser på en transkriptionel og post-transkriptionel niveau samt forstyrret epigenetisk regulering påvirker ofte gener involveret enten i stofskiftet stof eller apoptose 6.

Alternativ præ-mRNA splejsning og dens indviklede regulering har for nylig fået stor opmærksomhed som en ny enhed, der kan diktere resistens af kræftceller 7. Op til 95% af humane gener er alternativt splejset i normale celler ved hjælp af dennestramt reguleret proces, som frembringer mange forskellige protein-isoformer fra det samme gen. Alternativ splejsning er ofte dereguleret i cancer og flere tumorer er karakteriseret ved ændret splejsning af et stigende antal gener involveret i lægemiddelmetabolisme (dvs. deoxycytidinkinase, folylpolyglutamate syntetase, eller multiresistens proteiner) 6,8. Imidlertid er omfattende analyse af splejsning profiler af lægemiddelresistente celler smerteligt mangler. Derfor er det bydende nødvendigt at udvikle høje throughput metoder til alternativ splejsning analyse. Dette kunne være med til at udvikle mere effektive behandlingsmetoder.

I det seneste årti, har den hurtige udvikling af næste generations sekventering (NGS) teknologier beriget biomedicinsk forskning med nye indsigter i de molekylære mekanismer, der styrer reguleringen af genom udtryk og deres rolle i forskellige biologiske processer 9. RNA-sekventering (RNA-seq) er en kraftfuld sub-ansøgningaf NGS inden for transcriptomics. Det tillader en genom-dækkende profilering (både kvalitativt og kvantitativt) af ekspressionsmønstre for tusinder af gener samtidigt og er velegnet til karakterisering af hidtil ukendte kodende mRNA'er såvel som lang ikke-kodende RNA, miRNA, siRNA, og andre små RNA klasser (f.eks snRNA og Pirna) 10,11.

RNA-Seq har mange fordele i forhold til tidligere teknologier til transkriptom karakterisering (f.eks Sanger sekventering og ekspression microarrays). Den er ikke baseret på eksisterende genom annotation, det har en enkelt-nukleotid niveau af opløsning og det har en bredere dynamisk område til ekspression estimering. Kort beskrevet er den grundlæggende eksperimentelle arbejdsgang af RNA-seq eksperimenter består af polyadenyleret transkript (mRNA) udvælgelse og fragmentering, efterfulgt af omdannelse til cDNA, bibliotekskonstruktion og endelig massivt parallelle dyb sekventering 12,13. På grund af hurtig dråbe sequencing omkostninger over sidste par år, RNA-seq gradvist at erstatte andre teknologier og der gøres en stor indsats for at forbedre biblioteket forberedelse protokoller. For eksempel er det nu muligt at tilbageholde strengen informationer om mRNA-transkripter ved at markere den anden streng cDNA med deoxyuridintriphosphat (dUTP) og, før PCR-amplifikation, fordøjelse af mærket strengen med uracil-DNA-glycosilase (UDG). Denne proces øger nøjagtigheden af gen annotation og estimering af ekspressionsniveauerne 14,15.

Analysen og fortolkningen af RNA-seq data kræver komplekse og kraftige beregningsmæssige softwarepakker og forarbejdning i bioinformatiske rørledninger 16,17. For det første rå læser gennemgår kvalitetskontrol ved at fjerne tekniske og biologiske genstande og kassere (trimning) de sekvenser, som ikke når strenge kvalitetskrav. Efterfølgende læser for hver prøve mappes på en reference-genom og indeksereti gen-niveau, exon-niveau, eller transkript-plan, for at bestemme den overflod af hver kategori. Afhængig af anvendelsen, er raffinerede data beregnes derefter gennem statistiske modeller til identifikation af allel-specifikke udtryk, alternativ splejsning, genfusioner og enkeltværelser nukleotid polymorfier (SNPs) 12. Endelig kan anvendes differentiel analyse på valgte niveau (dvs. genekspression eller alternativ splejsning) at sammenligne prøver opnået under forskellige betingelser.

Differential splejsning analyse beskriver forskellene i brugen splejsningssted mellem to prøver. Et stigende antal softwarepakker, der afsættes til dette formål findes baseret på forskellige statistiske modeller, forestillinger og brugergrænseflade 18. Blandt disse, MATS (multivariat analyse af Transcript splejsning) fremstår som en frit tilgængelig og præcis beregningsmæssige værktøj baseret på en Bayesian statistiske rammer og designet til at detektere diffedifferentielle splejsning begivenheder fra enten enkelt eller parret ende RNA-seq data. Startende fra de justerede (.bam) filer, kan MATS detektere alle vigtige typer alternative splejsningsbegivenheder (exon skipping, alternative 3'-splejsningssted, alternative 5'-splejsningssted, som gensidigt udelukker hinanden exoner og intron retention - se også figur 1).

Først software identificerer læser som understøtter en vis splejsning begivenhed, for eksempel exon skipping, og klassificerer dem i to typer. "Inklusion læser" (for den kanoniske splejse begivenhed) kort inden den undersøgte exon og span splejsningspunkter mellem den specifikke exon og de to opstrøms og nedstrøms flankerende exons. "Skipping læser" (for den alternative splejsning begivenhed) spænde krydset mellem de to flankerende exons. Efterfølgende MATS returnerer normaliserede inklusion niveauet for både de kanoniske og alternative arrangementer og sammenligner værdierne mellem prøver eller betingelser. I sidste ende, det beregner P-værdi ennd falsk opdagelse sats (FDR) antager, at forskellen i variant forholdet af et gen mellem to betingelser overstiger en given brugerdefineret tærskel for hver splejsningsbegivenhed 19,34.

Efter differentiel splejsning analyse i forbindelse med RNA-seq, er en omfattende eksperimentel validering berettiget for at identificere ægte positive gen kandidater 18. Kvantitativ revers transkriberet-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) er den mest almindeligt anvendte og optimale metode i validering af ansøgere opnået fra RNA-Seq analyse 20. Formålet med dette oplæg er at give en robust metode til at undersøge resistens-relaterede splejsning profiler i solide tumorer og blodkræftsygdomme. Vores tilgang udnytter RNA-seq-baserede transkriptom profilering af udvalgte cellelinje modeller af lægemiddelresistente kræftformer i kombination med en etableret QRT-PCR-metode til validering af kandidatgener impliceret i resistens.

21,22 og methotrexat (MTX) resistent sublinie CEM / R30dm 23. Selvom nuværende behandlinger baseret på GC'ers og MTX etablere klinisk fordel i omkring 90% af tilfældene, fremkomsten af ​​GC-resistens udgør stadig et uløst problem med en uklar molekylære mekanisme. Til isolering GC-resistente sub-kloner, CEM-WT-celler blev dyrket i 1 uM dexamethason (Dex) i 2 til 3 uger. MTX-resistente sublinie CEM / R30dm blev udviklet gennem gentagne korte (24 timer) eksponering af CEM-WT celler til 30 uM MTX som efterligner af kliniske protokoller. Interessant denne cellelinie viste også krydsresistens over for Dex (upublicerede resultater), hvor mekanismen ikke er helt forstået.

Det faste tumeller model undersøgt i den foreliggende undersøgelse er pancreatisk duktalt adenokarcinom, berygtet for sin usædvanlige resistens over for kemoterapi. Til dette formål valgte vi Panc-1-cellelinien og dets gemcitabin-resistente sub-klon Panc-1R fremstillet ved kontinuerlig inkubering med 1 uM af medikamentet 24. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at opdage hidtil ukendte mekanismer bag in vitro resistens ved at kombinere tre protokoller: kolorimetriske cytotoksicitetsanalyser at vurdere lægemiddelfølsomhed i leukæmiske celler og cancerceller fra solide tumorer, RNA-seq-baseret pipeline til at identificere hidtil ukendte splejsningsvarianter relateret til lægemiddelfølsomhed / modstand og RT-PCR og QRT-PCR-analyse for at validere potentielle kandidater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Karakterisering af Drug Resistance profiler gennem cytotoksicitetsanalyser

  1. Leukæmiske cellelinje Culture
    1. Opretholde den parentale T-celle ALL cellelinje CCRF-CEM (CEM-WT) samt dens lægemiddelresistente underlinjer, herunder CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3, i 25 cm2 i 10 ml RPMI-1640 medium indeholdende 2,3 uM folinsyre suppleret med 10% føtalt kalveserum og 100 enheder / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin.
    2. Dyrke cellerne i en fugtig atmosfære ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
    3. Tillad cellevækst for koncentrationer mellem 2 - 3 i x 10 6 celler / ml.
    4. Split cellerne to gange om ugen med en initial koncentration på 0,3 x 10 6 celler / ml (fx hvis cellekoncentrationen er 3 x 10 6 celler / ml overføres 1 ml cellesuspension i en ny kolbe indeholdende 9 ml frisk medium). Kassér kultur efter 20 på hinanden følgende passager.
    Pankreatisk carcinomacellelinie Culture
    BEMÆRK: Oprethold den humane pancreas carcinoma-cellelinie Panc-1 i 75 cm 2-dyrkningskolber i 10 ml DMEM-medium med højt glucoseindhold og L-glutamin tilsat 10% føtalt bovint serum og 100 enheder / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin . Det drug-resistente variant, Panc-1R, dyrkes i det samme dyrkningsmedium indeholdende 1 uM gemcitabin opløst i sterilt vand. Yderligere oplysninger findes i 24.
    1. Dyrke cellerne ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
    2. Split cellerne hver 2 - 3 dage ved et forhold på 1: 5, når cellerne når konfluens på ca. 90%.
    3. At opdele cellerne, vaskes to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), der tilsættes 1 ml trypsin / EDTA pr 75 cm2 dyrkningskolbe og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
    4. Tilføj 9 ml medium og høste løsnede celler i et 15 ml rør. Seed 2 ml cellesuspension i en ny kolbe contalingen 8 ml medium. Kassér kultur efter 20 på hinanden følgende passager.
  2. MTT Assay for leukæmiceller
    1. Forberede sig på forhånd MTT-opløsning: Opløs 500 mg MTT formazan i 10 ml PBS og omrør (beskyttet mod lys) med en magnetisk omrører i ca. 1 time. Sterilisere opløsningen med et 0,22 um filter. BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares i 10 ml portioner ved -20 ° C. Beskyt mod direkte lys efter optøning.
    2. Forberede sig på forhånd den forsurede isopropanol: tilsættes 50 ml 2 M HCl til 2,5 liter isopropanol. BEMÆRK: løsningen Opbevar i mindst en måned ved stuetemperatur før brug. Hvis isopropanol ikke forsures korrekt, kan det danne bundfald med mediet og kompromittere spektrofotometrisk udlæsning.
    3. Forbered en separat 96-brønds fladbundet "Day 0" (kontrol) plade for at sikre mere præcis vurdering af vækstinhibering: dedikere 3 til 6 brønde pr cellelinie, tilsættes 30 pi vækstmedium og 120 ul cellesuspension (8000 celler) pr hver brønd og 150 pi vækstmedium til brønde svarende til blindprøver (ingen celler). Fortsæt fra trin 1.3.9 til trin 1.3.13 i dette afsnit til at måle den optiske densitet (OD). BEMÆRK: Yderligere oplysninger findes i fire.
    4. Der fremstilles en 96-brønds fladbundet eksperimentel plade: dedikerer 30 brønde til medikamentkoncentrationer (10 koncentrationer, hver i tre eksemplarer), 10 brønde med kontrolceller og 10 brønde til kontrol medium uden celler (blanks) og forberede et lægemiddel fortyndinger af dexamethason ( Dex) under anvendelse dimethylsulfoxid som opløsningsmiddel.
      BEMÆRK: CEM-WT celler Dex fortynding er mellem 2 uM og 0,97 nM. For CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3 celler Dex fortynding er mellem 640 uM og 0,33 nM.
    5. Tilsæt 30 pi fra hver Dex fortynding i en passende brønd af 96-brønds plade. Sørg for at medtage hver koncentration i tredobbelt.
    6. Tilføj 30 pi vækstmedium til godts svarende til kontrolceller og 150 pi vækstmedium til brønde svarende til blanktegn.
    7. Harvest eksponentielt voksende celler og resuspender på deres optimale såning koncentration.
      BEMÆRK: For at bestemme optimale udgangspunkt cellekoncentrationer, anbefales det at vurdere vækstprofilen af ​​hver cellelinje cellelinje i en plade med 96 brønde ved at pode celler i flere koncentrationer og måle det dagligt i mindst 4 dage. Vælg en seeding koncentration, som forhindrer overvækst af celler efter 72 timer, da dette vil påvirke eksperimentet ved at mætte OD-værdierne. For CEM-WT, CEM-C5 og CEM-R5 den optimale seeding koncentrationen er 8.000 celler / brønd, mens det for CEM / R30dm det er 5.000 celler / brønd.
    8. Tilføj 120 pi cellesuspension til hver brønd indeholdende enten lægemiddelopløsningen eller vækstmediet (brønde svarende til kontrolceller). Fyld de tomme ydre brønde i pladen med 150 pi PBS for at sikre god fugtighed i pladen og inkuber the plader i 72 timer ved 37 ° C med 5% CO2 i en cellekultur inkubator.
    9. Der tilsættes 15 ul af MTT-opløsning til hver brønd og ryste pladen i 5 minutter med en pladeryster op til et maksimum på 900 shakes / min.
    10. Placer pladerne tilbage ved 37 ° C med 5% CO2 i en cellekultur inkubator og inkuberes i yderligere 4 - 6 timer.
    11. Tilføj 150 pi af den syrnede isopropanol til hver brønd og bland godt med en multikanalpipette til grundigt at opblande alle formazankrystallerne. Start med de tomme brønde og sørg for at skylle de tips godt før man går videre til en anden række af pladen.
    12. Inkubér pladen ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter.
    13. Ved hjælp af en mikropladelæser, fastlægge OD ved 540 og 720 nm for at sikre en nøjagtig måling ved at korrigere for baggrunden OD. Derefter gemme data i et regneark fil og analysere den 4.
  3. SRB-assay for pancreas carcinomceller
    1. Opløs SRB reagens i 1% eddikesyre i en slutkoncentration på 0,4% (vægt / volumen).
    2. Opløs trichloreddikesyre (TCA) i ultrarent vand ved en slutkoncentration på 50% (vægt / volumen).
    3. Opløs Tris (hydroxymethyl) -aminomethan i ultrarent vand ved en slutkoncentration på 10 mM.
    4. Forbered en separat 96 brønde flad bund "Dag 0" kontrol plade for at sikre en mere præcis vurdering af væksthæmning: frø 6 brønde med celler, der vokser i eksponentiel fase i 100 pi medium ved passende såning koncentration og tilsættes 100 pi medium kun til brønde svarende til blanks. Inkuber natten over ved 37 ° C med 5% CO2 for at sikre korrekt adhæsion af cellerne til pladen. Derefter tilsættes 100 pi medium til alle brøndene og gå videre til trin 1.4.8 - 1.4.16 i denne sektion.
    5. Der fremstilles en 96-brønds fladbundet eksperimentel plade: frøceller vokser i eksponentiel fase tre gange i 96 brønde fladbundede plader ved en passende densitet i 100 pi migdium ved anvendelse af en multikanal pipette.
      BEMÆRK: For at bestemme optimale udgangspunkt cellekoncentrationer, anbefales det at vurdere vækstprofilen af ​​hver cellelinje cellelinje i en plade med 96 brønde ved at pode celler i flere koncentrationer og måle det dagligt i mindst 4 dage. Vælg en seeding koncentration, som forhindrer overvækst af celler efter 72 timer, da dette vil påvirke eksperimentet ved at mætte OD-værdierne. For Panc-1 og Panc-1 R-celler, den optimale såning koncentrationen er 8000 celler / brønd.
    6. Tilsæt 100 pi medium til medium, der kun brønde og inkuberes natten over ved 37 ° C med 5% CO2 for at sikre korrekt adhæsion af cellerne til pladen.
    7. Forbered et lægemiddel fortynding vifte af gemcitabin mellem 1 pM og 10 nM for Panc-1 og 1 mM og 100 nM for Panc-1R celler. Tilsæt 100 pi fra hver fortynding i en passende brønd af 96-brønds plade ved anvendelse af en multikanal pipette. Sørg for at have hver koncentration i tre eksemplarer. Desuden,tilsæt 100 pi medium til medium-only brønde og kontrol- celler. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 72 timer.
    8. 25 pi kold TCA-opløsning til brøndene ved anvendelse af en multikanal pipette og inkuber pladerne i mindst 60 minutter ved 4 ° C for at udfælde og løse proteinerne i bunden af ​​brøndene.
    9. Tøm plade ved at fjerne medium og tørre kortvarigt på et væv.
    10. Vask 5 gange med ledningsvand, derefter tømme pladen og lad tørre ved stuetemperatur.
    11. Der tilsættes 50 pi SRB-opløsning per brønd ved anvendelse af en gentagen pipette og pletter i 15 minutter ved stuetemperatur.
    12. Tøm plade ved at fjerne SRB pletten.
    13. Vask 4 gange med 1% eddikesyre, derefter tømme pladen og lad det tørre ved stuetemperatur.
    14. Tilsæt 150 pi Tris-opløsning per brønd ved anvendelse af en multikanal pipette og bland i 3 minutter på en pladeryster op til et maksimum på 900 shakes / min.
    15. Læs den optiske densitet ved 540 nm (eller 492 nm hvis than OD-værdier er for høje).
    16. Analyser af data.
  4. Dataanalyse for MTT og SRB-assays
    1. Beregn OD-værdierne af celler på "dag 0" ved hjælp af følgende formel: OD Dag 0 = OD kontrol celler - Gennemsnitlige OD tomme brønde
    2. Beregn procentdelen af overlevende celler for hver medikamentkoncentration efter følgende formel:% Behandlede celler = Gennemsnitlig [OD behandlede celler - Gennemsnitlige OD blank brønde - OD Dag 0] / [OD kontrol celler - Gennemsnitlige OD blank brønde - OD Dag 0] * 100
    3. Plot dosis-respons kurve (lægemiddelkoncentration vs. væksthæmning i%).
    4. Beregning af koncentrationen af lægemidlet, som inhiberer væksten af celler med 50% (IC50) under anvendelse af dosis-respons-kurve.

2. RNA Isolation og Bibliotek Forberedelse til RNA-sekventering

  1. Prøve Collfdeling og RNA Isolation
    1. For CEM-celler: høst 10 6 celler direkte fra dyrkningsmediet.
    2. For Panc-1 og Panc-1R: fjerne medium, vaske cellerne to gange med PBS og løsnes ved tilsætning af trypsin-EDTA og inkubering ved 37 ° C i 3 minutter. Tilføj dyrkningsmedium og høste 10 6 celler.
    3. Spin ned prøver ved 300 xg i 3 min, fjern supernatanten og ekstrahere total mRNA ved anvendelse af kommercielt tilgængelige silica membran spin-søjler, ved at følge manufacturer`s protokol.
    4. Bestemme koncentrationen og renheden af ​​totalt RNA ved anvendelse af en UV-Vis spektrofotometer.
      BEMÆRK: RNA betragtes med høj renhed, hvis 260 nm / 280 nm absorbans forholdet er større end 1,8. Prøverne kan opbevares ved - 80 ° C.
    5. Vurdere total RNA integritet ved elektroforese af 200 ng prøve på 1% agarosegel farvet med ethidiumbromid.
      BEMÆRK: detektion af to intakte bånd svarende til pattedyr 28S og 18S rRNA'er ved ca.2 kb og 1 kb i størrelse indikerer god total RNA integritet.
  2. Sequencing Bibliotek Forberedelse
    1. Brug 2 ug totalt mRNA per hver prøve. Følg mRNA bibliotek forberedelse protokol i henhold til producentens anvisninger.
    2. Bestem kvalitet og koncentration af hvert bibliotek ved anvendelse af et Bioanalyzer system. Pool bibliotekerne i en enkelt prøve op til en endelig koncentration på 10 nmol / L og måle det med Bioanalyzer.
    3. Brug high-throughput sekventering-system med Single Læs 100 bp-tilstand.
      BEMÆRK: Læs længde> 80 bp er nødvendig for at identificere transkriptionelle isoformer.

3. Påvisning af Differential splejsning fra sekventering Læser

  1. Tilpasning af Læser til Henvisning genom og Kvalitet Check
    1. Udarbejde en gen annotation (.gtf fil) fra NCBI refGene tabel ved hjælp UCSC table browser (25,963 gener).
    2. Udføreannotation-aware gapped tilpasning af sekventering læser til referencen genom (GRCh37) ved hjælp af STAR.
    3. Sorter og indeksere de resulterende tilpasning filer med Picard værktøjer.
    4. Udfør efterfølgende kortlægning kvalitetskontrol ved hjælp RSeQC og samtools.
  2. Differential splejsning Detection mellem Sample grupper
    1. Installer Python og tilsvarende versioner af NumPy og SciPy. Download og installer samtools. Download og installer bowtie og Tophat,
    2. Tilsæt Python, bowtie, hatteskinne og samtools mapper til $ PATH miljøvariablen. Hent præ-bygget bowtie indekser (hg19). Hent rMATS versionen 3.0.9.
      BEMÆRK: Yderligere oplysninger om rMATS findes i 19 og 34.
    3. Detect alternative splejsningsbegivenheder ved at sammenligne hver Dex-resistent cellelinje til CEM-WT og Panc-1 til Panc-1R i separat MATS løber ifølge figur 5A.
    4. For at detektere differentiel splejsning begivenheder fra previously justeret sekventering læser (.bam filer), køre MATS ved hjælp af kommandoer fra figur 5B for CEM-WT vs CEM- C3, CEM-WT vs CEM-R5, CEM-WT vs CEM / R30dm og Panc1 at Panc- 1R sammenligninger.
      BEMÆRK: MATS vil skabe et output mappe med to .txt filer med resultater pr type splejsningsbegivenhed analyseret (SE - exon skipping, A5SS - alternativ 5'-splejsningssted, A3SS - alternativ 3 splejsningssted, MEX - gensidigt udelukkende exons og RI - intron retention): en fil, der indeholder resultater baseret på kun junction tæller og en anden fil med resultater baseret på krydset tæller og læser på målet. Desuden er en ekstra .txt fil med et resultat overblik genereres i den samme mappe.
    5. For SE, A5SS, A3SS og RI import til regneark de .txt filer baseret på junction tæller og læser på målet. For MEX importere .txt filer baseret på kun junction tæller.
      BEMÆRK: MATS output fil er ordnet efter stigende P-værdier og indeholder flere parametre: gen-id, gen-symbol, Kromosom og streng position, genomiske koordinater for de alternativt splejsede fragmenter, tæller samt længden af ​​integration og springe formularer til både analyserede prøver, længden af ​​inklusion og springe anvendte form for normalisering, p-værdi, falsk opdagelse sats (FDR ), inklusion niveau for hver prøve baseret på normaliserede tæller og score forskellen inklusion (gennemsnit (IncLevel1) - gennemsnit (IncLevel2)).
    6. Vælg statistisk signifikante kandidatgener med en FDR <10% for yderligere validering (f.eks DDX5 og PKM2).
    7. Visualisere alternative splejsningsbegivenheder med Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), som rapporteret i figur 5.

4. Validering af resultaterne ved RT-PCR og QRT-PCR assays

  1. primer design
    BEMÆRK: For at tilvejebringe en pålidelig validering af resultater opnået ved anvendelse af bioinformatik rørledning, mRNA transcripts følge af alternativ splejsning events amplificeres ved anvendelse af RT-PCR og visualiseret ved agarosegelelektroforese af PCR-produkterne. Cyanin grøn farvestof, såsom SYBR green QRT-PCR-assay anvendes til at kvantificere specifik splejsningsvarianter forhold til en husholdning gen. Figur 7 viser strategien anvendt til at visualisere exon 12 skipping tilfælde af DDX5 genet og at kvantificere gensidigt udelukker exon 9 og exon 10 i PKM-genet.
    1. For RT-PCR analyse, design primerpar som annealer til konstitutive exons (exon 10 og exon 13) placeret opstrøms og nedstrøms de alternative splejsning sites (Figur 7A).
      BEMÆRK: amplikonstørrelse bør dække mellem 100 og 800 bp for at sikre en klar adskillelse af de forudsagte PCR-produkter på agarosegel. Annealingstemperatur af primerne skal være mellem 55 og 65 ° C, og GC-indhold ikke bør overstige 60%.
    2. Cyanin grøn assay (figur 7B). Kontroller sekvenshomologi på de to indbyrdes eksklusive exoner og design to primerpar, som hver specifikt og udelukkende detekterer kun én af de to splejsningsvarianter.
      BEMÆRK: PKM, den reverse primer annealer til exon 11 fælles for begge varianter, mens de fremadrettede primere er variant-specifikke og annealer til exon 9 (PKM1) eller exon 10 (PKM2).
    3. For at detektere DDX5 gen i fuld længde, anneale den reverse primer inden for den oversprungne exon (exon 12).
      BEMÆRK: den specifikke påvisning af DDX5 ΔEx12 variant reverse primer spænder over exon11 / exon13 grænsen. Brug samme fremadrettede primer som annealer til konstitutiv exon 10 for begge reaktioner.
      BEMÆRK: amplikonstørrelse skal være mellem 80 og 200 bp.
  • Første streng cDNA-syntese
    1. Oprette revers transkription af 1 pg af det isolerede RNA til cDNA ved anvendelse af 200 U / pl af Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) reverSE transkriptase i sin reaktionsbuffer fortyndet 1: 5 med sterilt vand. Tilføj DTT 1 pM, 0,05 ug vilkårlige hexamerer, deoxynukleotid mix (dNTP) 1 mM og 40 U / pl af ribonuklease-inhibitor.
    2. Vortex kortvarigt og inkuberes reaktionsblandingen ved 37 ° C i 2 timer.
    3. Inkubér reaktionsblandingen ved 70 ° C i 5 minutter til inaktivering af revers transkriptase, overføre blandingen på is og spin ned ved hjælp af en mikrocentrifuge. Prøver kan anvendes straks eller opbevares ved - 20 ° C.
  • RT-PCR Reaction Agarose Gel
    1. Opsæt PCR-reaktionen i et PCR-rør for hver prøve ved at blande 12,5 pi 2x koncentreret PCR mastermiksens, 1,25 pi 10 pM forward primer og det samme beløb for den reverse primer op til et endeligt volumen på 25 pi med sterilt vand.
    2. Tilsæt 1 pi cDNA til mix og placere rørene i thermocycler. Kør programmet som følger: indledende denaturering: 95 ° C i 2 min.Gentage følgende trin for 35 cykler: denaturering ved 95 ° C i 25 sekunder; annealing ved 52 ° C i 35 sek; forlængelse ved 72 ° C i 1 min. Indstil endelig ekstension ved 72 ° C i 5 min.
    3. Forberede 1% agarosegel ved at opløse 1 g agarose i 100 ml 1x TBE buffer. Tilføj 2,5 pi ethidiumbromid til opløsningen. ADVARSEL: ethidiumbromid er kræftfremkaldende, håndtag med omhu ved hjælp af en stinkskab.
    4. Indlæse prøverne og køre gelen i 1 x TBE-buffer ved 100 V i ca. 30 minutter i et elektroforese-system.
    5. Reveal gelen med et digitalt UV kamera og gemme billedet.
  • QRT-PCR og dataanalyse
    1. Opsætning af Cyanin grønne PCR-reaktion for hver prøve ved at blande 12,5 pi 2x grønne PCR Mastermix, 2 pi af 5 uM fremadrettet primer og det samme beløb for den reverse primer op til et endeligt volumen på 15 pi med sterilt vand i et PCR-rør . Forbered en blanding for hver specifik splejsningvariant, der skal detekteres (PKM1, PKM2, DDX5 fuld længde, DDX5 ΔEx12) og for husholdning genet (GUS).
    2. Indlæse mastermiksen på en hvid plade med 96 brønde og forberede dubletter pr hver prøve.
    3. Fortynd cDNA 10x i vand, tilsættes 5 pi til hver blanding og placere pladen i thermocycler. Kør programmet som følger: indledende denaturering: 95 ° C i 5 min. Gentage følgende trin i 45 cyklusser: denaturering ved 95 ° C i 10 sek; annealing ved 58 ° C (for DDX5 og DDX5 ΔEx12 blander) eller 60 ° C (for PKM1 og PKM2 blander) i 20 sekunder. Indstil endelig ekstension ved 72 ° C i 20 sek. Set smeltekurveanalyse ved at påføre en gradient fra 65 97 ° C.
    4. For at vurdere specificiteten af ​​de primersættene til deres mål, kontrollere smeltekurveme og kontrollere, at en enkelt top dannes pr hver primer sæt.
    5. Beregn den anden afledte værdier af forstærkning kurver og eksportere tærskelværdier cyklus værdier (Ct).
    6. Calculate de relative ekspressionsniveauer (rel) af mRNA splejsningsvarianter forhold til GUS husholdning (reference) gen i hver prøve ved hjælp af "delta Ct (ACt)" metode. Formlen er: REL = 2 - ACt, hvor ACt = Ct target splejsningsvariant - Ct henvisning gen
    7. For at kvantificere den relative forekomst af splejsningsvarianter, beregne REL-forholdet ved hjælp af formlen: Ratio REL ratio = REL splejse variant 1 / REL splejsning variant 2.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    De cytotoksicitetsassays beskrevet i protokollen tilvejebringe en pålidelig og robust metode til at vurdere modstanden af cancerceller til kemoterapimidler in vitro. Ved hjælp af MTT-assayet, blev følsomhed over for Dex bestemt i fire T-ALL cellelinjer, herunder Dex-følsomme parentale CEM-WT-celler, og tre Dex-resistente underlinjer: CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3. To forskellige koncentrationsintervaller skulle anvendes på grund af den store forskel i følsomhed mellem CEM-WT (2 uM - 0,97 nM) og DEX resistente cellelinier (640 uM - 0,33 nM). MTT-assayet viste tydeligt Dex resistens i CEM / R30dm (IC50 = 456 ± 49 pM), CEM-R5 (IC50> 640 uM) og CEM-C3 (IC50 = 386 ± 98 pM) sammenlignet med den CEM- WT-celler (IC50 = 0,028 ± 0,003 uM). Tilsvarende SRB-assayet demonstreret høj gemcitabin resistens i Panc-1R cellelinien (IC50 = 3.16 ± 0,01 uM) sammenlignet med de parentale Panc-1-celler (IC50 = 0,077 ± 0,03 uM) som vist i figur 2.

    Efter bekræftelse af resistens i alle betragtes cellelinjer, vi næste fortsatte til mRNA isolation, bibliotek forberedelse og RNA-sekventering. Ekstraktion af totalt mRNA ved anvendelse af silica membran spin-søjler er den foretrukne valg over andre metoder, da den undgår phenol og protein kontaminering og tilvejebringer høj renhed af prøven med 260 nm / 280 nm absorbansforhold godt stykke over 1,8. Dette er et afgørende krav til komplekse efterfølgende anvendelser såsom dyb sekventering. Den anvendte metode til at kontrollere integriteten af RNA-prøver ved agarose 1% er særlig egnet til frisk isolerede celler (figur 3). Da formålet med denne protokol er at opdage alternative splejsningsvarianter afvigende udtrykt i lægemiddelresistente cellelinier, vælger vi positive selection af polyadenyleret mRNA til fremstilling sekventering bibliotek, ved brug af trådet mRNA kit. Elektroferogrammer af enkelte og puljede biblioteker er afbildet i figur 4, der viser en gennemsnitlig fragmentstørrelse på ca. 300 bp, i overensstemmelse med sekventering systemkrav. De fremstillede biblioteker blev derefter sekventeret ved anvendelse af en chip med enkelt læser 100 bp tilstand. Valget af sekventering læser af 100 bp er nødvendig for at detektere alternativ splejsning gennem downstream bioinformatiske rørledninger.

    Efter indledende bearbejdningstrin og kvalitetskontrol, læser den rene tilpasset til humane genom (hg19) blev underkastet differentiel splejsning analyse under anvendelse måtter. I denne analyse vi sammenligninger mellem lægemidlet sensitive parentale cellelinje og hver af dens lægemiddelresistente underlinjer separat (dvs. CEM WT vs. CEM / R30dm, CEM WT vs. CEM-C3, etc.). MATS bygger på en fleksibel og nøjagtige statistiske modelanvendes til at påvise differentiel splejsning mellem prøver. Ved at bruge standard analysemuligheder og en FDR-værdi <10% som en cut-off (afbildet i figur 5B), var vi i stand til at identificere 38 ± 12 signifikante forskelligt splejsede gen kandidater pr sammenligning bestilt af typen af alternativ splejsning begivenhed, med de fleste hits klassificeret som exon skipping. Figur 6 illustrerer en typisk analyse udgang til sammenligning Panc-1 vs. Panc-1R.

    Vi fokuserede yderligere vores undersøgelse på to mest almindelige typer af alternative splejsning begivenheder: exon skipping og gensidigt udelukkende exon begivenheder med en repræsentant kandidat hver kategori beskrevet nedenfor. DDX5 (DEAD-box helicase 5) er blevet opdaget af MATS analyse som statistisk signifikant i sammenligning CEM-WT vs CEM-C3 og CEM-R5, men ikke signifikant i sammenligning CEM-WT vs CEM / R30dm. I betragtning af dets formodede rolle i leukæmi 25,26, vivælger denne kandidat til yderligere validering. Det anbefales stærkt at visualisere RNA-seq data i et genom browser-lignende værktøj. IGV giver en alsidig og brugervenlig grænseflade til dette formål, som vist i figur 7 for genet kandidat DDX5. PKM (pyruvatkinase muskel isozym) er en statistisk signifikant gensidigt udelukkende exon begivenhed i sammenligning CEM-WT vs alle Dex resistente underlinjer, men ikke i sammenligningen Panc-1 vs. Panc-1R. I betragtning af relevansen af dette enzym i fast tumor stofskifte 27,28 og det nye rolle cellemetabolisme i glukokortikoid modstand i T-ALL 29, vælger vi denne kandidat til yderligere validering ved hjælp af RT-PCR.

    Primer design skal udføres med største omhu for at forstærke den korrekte amplicon, især når primere annealer til exon-exongrænser (i tilfælde af den bagudrettede primer påvisning DDX5 ΔEx12 variant) eller når they annealing til udelukker hinanden exons med høj sekvenshomologi (exon 9 og exon 10 af PKM). Figur 8 viser primer design strategi, mens figur 9 viser resultaterne af en RT-PCR for DDX5 gen kandidat. DDX5 ΔEx12 detekteres i prøven CEM-WT og CEM / R30dm men ikke i CEM-C3 og CEM-R5, hvilket bekræfter MATS data i en kvalitativ måde. Cyanin grøn QRT-PCR-assay kvantificerer præcist mRNA ekspressionsniveauer af DDX5 og PKM splejsningsvarianter, som vist i figur 10 og figur 11, henholdsvis.

    figur 1
    Figur 1: Skematisk repræsentation af alternativ splejsning events. Skematisk gengivelse af de mulige mønstre af alternativ splejsning af et gen. Kasser er diskrete exoner der kan uafhængigt inkluderet eller udelukket fra mRNA udskrift. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2: Resultater af cytotoksicitetsanalyser. (A) MTT assay for leukæmiske cellelinier viser høje niveauer af dexamethason resistens i CEM-C3 (IC50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC50> 640 uM) og CEM / R30dm (IC50 = 456 ± 49 pM ) sammenlignet med den parentale CEM-WT (IC50 = 0,028 ± 0,003 uM). (B) SRB-assays for pancreatisk carcinom-cellelinier afslører høje niveauer af gemcitabin resistens i Panc-1R (IC50 = 3,16 ± 0,01 uM) sammenlignet med den parentale Panc-1 (IC50 = 77,22 ± 2,76 nM). Graferne rapporterer gennemsnitlig cellevækst% ± SEM af tre independent eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3: RNA Quality Assessment hjælp en agarosegel. To hundrede ng af totalt mRNA blev kørt på 1% agarosegel farvet med ethidiumbromid. Tilstedeværelsen af ​​intakte bånd svarende til ribosomalt RNA (rRNA) arter 18S og 28S og fraværet af smears ved lavere molekylvægte er indikative for god kvalitet RNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4: <strong> Bioanalyzer Spor af Sequencing Biblioteker. (A) elektroferogrammer af sekventering biblioteker viser toppe ved ca. 300 bp, hvilket er tegn på god kvalitet. Prøve 1 til 6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 og Panc-1R. (B) elektroferogram af de poolede prøver (FU, fluorescensenheder).

    Figur 5
    Figur 5: Påvisning af Differential Splejsning med MATS. (A) Gruppe sammenligninger og (B) scripts bruges til at køre måtter. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6: MATS Output List. Figuren viser en typisk output MATS analyse i et software med regneark: her rapporteres de forskelligt splejsede kandidater i sammenligning Panc-1 vs Panc-1R for exon springe begivenheder (FDR <10%). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 7
    Figur 7: Visualisering af Differential splejsning af DDX5 Kandidat Gene gennem IGV Genome Browser. Filer med justeret læser (.bam) svarende til leukæmiceller er blevet uploadet på IGV genom browser og visualiseres ved hjælp af Sashimi plots (minimum junction tæller værdi = 10 at visualisere betydelige splejsningsbegivenheder). Splice junction tæller er repræsenteret ved at forbinde linjer oget nummer svarende til RNA-seq læser spænder exonerne. CEM-WT og CEM / R30dm viser springer tæller spænder exon 11 til exon 13 i forhold til CEM-C3 og CEM-R5, som ikke viser nogen exon 12 skipping. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 8
    Figur 8: Primer Design for RT-PCR og Cyanin Green QRT-PCR. (A) RT-PCR: primerpar detektering differentiel splejsning af DDX5 annealer til konstitutive exoner (exon 10 og exon 13) placeret opstrøms og nedstrøms fra alternativt splejsede exoner. (B) QRT-PCR-assay: for det relative kvantificering af transkripter følge af exon skipping begivenheder sammenlignet med de kanoniske transkripter, den reverse primer annealer enten i sprunget exon (alternativ variant) ellertil exon11 / exon13 grænsen (kanonisk variant) af DDX5 genet. Til kvantificering af indbyrdes udelukkende exoner, den reverse primer annealer til exon 11 fælles for begge isoformer, mens den fremadrettede primer annealer enten til exon 9 (PKM1) eller exon 10 (PKM2). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 9
    Figur 9: RT-PCR Validering af DDX5 differentiel splejsning. 1% agarosegel viser differentiel splejsning af DDX5 genet i leukæmiceller. Fragmentet svarende til DDX5 fuld længde amplikon (650 bp) forstærkes i alle prøver, mens DDX5 ΔEx12 (430 bp) variant forstærkes i CEM-WT og CEM / R30dm prøver og størrelsen svarer til Exon 12 skipping. Dette er ikke påvist i CEM-C3 og CEM-R5-celler, som afskrækkeudvindes af Mats analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 10
    Figur 10: mRNA-ekspressionsniveauer af DDX5 splejsningsvarianter i CEM-celler. (A) QRT-PCR-assay. Mean relative ekspressionsniveauer og standardfejl på middelværdien (REL ± SEM) af to uafhængige forsøg. (B) Ratio REL (± SEM) af splejsningsvarianter. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 11
    Figur 11: mRNA-ekspression Levels af PKM Splice varianter i CEM og Panc-1 celler. (A) QRT-PCR-assay. Mean relative ekspressionsniveauer og standardfejl på middelværdien (REL ± SEM) af to uafhængige forsøg og forholdet REL af splejsningsvarianter for CEM-celler. (B) QRT-PCR-assay. Mean REL ± SEM af to uafhængige forsøg og forholdet mellem REL (± SEM) af splejsningsvarianter for Panc-1-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her beskriver vi en ny tilgang, der kombinerer veletablerede cytotoksicitet screeningsteknikker og kraftfuld NGS-baserede transkriptom analyser for at identificere differentiel splejsning hændelser i forhold til medikamentresistens. Spektrofotometriske analyser er praktisk og robust high-throughput metoder til at vurdere narkotika følsomhed i in vitro kræftmodeller og repræsenterer det første valg for mange laboratorier, der udfører cytotoksicitet screeninger. Fejlfinding samt mulige variationer til denne metode blev udførligt beskrevet andetsteds 4,5.

    High-throughput genomisk analyser øjeblikket bruges til at udforske drug resistensmekanismer hovedsagelig baseret på SNP'er afsløring og differential udtryk estimering af gener, der er forbundet med en vis lægemiddel-resistente fænotype. I denne undersøgelse beskriver vi brugen af ​​RNA-sekventering metoder, sammen med robuste bioinformatiske rørledninger til præcis annotation af mRNA-transkripter og detektion af difspændet splejsning. Et særligt vigtigt træk ved den beskrevne protokol er evnen til at identificere hidtil ukendte splejsningsvarianter mellem to prøvegrupper med særskilte lægemiddelfølsomhed profiler. Et af de afgørende skridt for en præcis og objektiv analyse er isolering af RNA, der skal være af høj renhed og integritet.

    MATS er den software, vi vælge blandt en række lignende bioinformatiske værktøjer til rådighed (f.eks Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice og Splejsning Compass) til påvisning af alternativ splejsning 18. De vigtigste centrale funktioner, der gør det den foretrukne løsning er dens overlegne præcision og nøjagtighed samt muligheden for at identificere nye begivenheder. MATS genererer to typer af output indeholder differential splejsning analyse: den første er kun baseret på exon junction tæller, og den anden er baseret på junction tæller samt læser på målet. Mens sidstnævnte er foretrukket til påvisning af exon skipping begivenheder, anbefales det atbruge den første mulighed for analyse af gensidigt eksklusive exoner da denne fremgangsmåde reducerer antallet af falsk positive kandidater til denne særlige form for splejsning ændring.

    Desuden til analyser med fokus på intron fastholdelse, alternative 3 'og 5'-splejsningssted begivenheder, bør der anvendes en .gtf fil med kommenterede introns. I sidste ende, for at mindske biologiske og tekniske variabilitet inden prøven grupper og sikre høje sande positive satser, anbefales det kraftigt til sekvens mindst tre replikater 34. Udvælgelsen af ​​differentielt splejsede gen kandidater baseret på måtter output blev kombineret med et valideringstrin anvendelse af RT-PCR. Dette er kritisk vigtigt for valget af sande positive varianter blandt en lang liste af statistisk signifikante kandidater. Den afgørende faktor for en nøjagtig validering er udformningen af ​​oligonukleotider og optimering af PCR-reaktionerne ifølge molekylærbiologiske standarder. særlig omhubør tages ved udformningen primere spænder exon-exon kryds og yderligere validering trin, såsom sekventering af amplikoner ved Sanger-metoden, er berettiget til at bekræfte deres specificitet.

    Den differentielle splejsning af DDX5 og PKM udskrifter opdaget af MATS repræsenterer to eksempler på en afvigende splejsning relateret til resistens. DDX5 ΔEx12 blev ikke udtrykt i GC-resistente cellelinier (CEM-C3 og R5), som er blevet udvalgt efter langvarig Dex eksponering. DDX5 ΔEx12 blev udtrykt i den parentale cellelinie, men også i subklon CEM / R30dm, som blev udvalgt for resistens over for det kemoterapeutiske middel MTX stedet Dex. I kræftceller, blev PKM2 stærkt udtrykt i forhold til sin splejsningsvariant PKM1, men forholdet PKM2 / PKM1 var højere i Dex-resistente celler, som foreslået af NGS resultater. Dette blev ikke observeret for Panc-1 prøve sammenlignet med dens gemcitabin-resistent modstykke og faktisk dette kandidat-gen var ikke blandtde statistisk signifikante begivenheder i MATS analysen. Dette kan afspejle de forskellige celletype og mekanisme af lægemiddel-resistens induceret af gemcitabin eksponering.

    Afslutningsvis denne protokol udgør en hensigtsmæssig strategi for opdagelsen af splejsningsvarianter, der kan ligge til grund for lægemiddelresistens og kan anvendes til enten leukæmiceller 30 eller faste tumorceller 31. En klar begrænsning er, at tumorcellelinier indfange kun en lille del af kræft heterogenitet. Endvidere har de fleste cellelinier blevet opretholdt i mange år i monolag i vækstfremmende medier. Disse betingelser påvirker de cellulære egenskaber, som fører til udvælgelse af subpopulationer, der afviger drastisk fra cellerne fra de primære tumorer, hvorfra de stammer. Men mange af de gener, der er involveret i resistens er også involveret i andre pivotale cellefunktioner såsom cellevækst og apoptose, der kan blive påvirket af langvarig culturin g i plast. Derfor, for at forbedre studiet af lægemiddelresistens, skal rettes større indsats mod udviklingen af prækliniske modeller, såsom primære kulturer og xenotransplantater, som i højere grad efterligner in vivo cancer mikromiljø for at undgå relevante ændringer i cellulære egenskaber forårsaget af længere perioder cellekultur og dyrkningsbetingelser. 32 Bemærkelsesværdigt, vores protokol kan også anvendes til primære celler, ved anvendelse cytotoksicitetsassays for at bestemme ex vivo IC50-værdier. En anden begrænsning er, at eftersom mange resistensmekanismer findes for hver anticancer lægemiddel, kan tilsvarende eller forskellige resistensmekanismer udvikle sig i celler udsat for identiske men uafhængige behandlinger. Derfor bør en sammenlignende udvælgelsesprocedure strategi involverer parallelle valg og analyser, herunder genetiske analyser på splejsning varianter, af de samme parentale celler behandlet med det samme kemoterapi agent.

    jove_content "> Ekstra tilgange til funktionel validering bør sigte mod overekspression splejse variant af interesse i cellelinjer eller specifikt nedregulere deres udtryk ved hjælp af RNA-interferens eller splice-skifte oligonukleotider 33.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
    2. McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
    3. Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
    4. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
    5. Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
    6. Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
    7. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
    8. Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
    9. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
    10. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
    11. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
    12. Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
    13. Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
    14. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
    15. Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
    16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
    17. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
    18. Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
    19. Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
    20. Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
    21. Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
    22. Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
    23. McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
    24. Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
    25. Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
    26. Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
    27. Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
    28. Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
    29. Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
    30. Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
    31. Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
    32. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
    33. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
    34. Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).

    Tags

    Cancer Research kemoterapi modstand cytotoksicitet alternativ splejsning RNA-seq transcriptomics
    Brug RNA-sekventering til Detect Novel Splice Varianter Relateret til Drug Resistance i<em&gt; In vitro</em&gt; Kræft Modeller
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A.,… More

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter