Summary
Niet-invasieve bepaling van de endotheelfunctie bij de mens kan worden bepaald door de flow gemedieerde dilatatie techniek. Hoewel duizenden studies deze techniek gebruikt, heeft geen enkele studie deze techniek uitgevoerd op niet-invasieve bij ratten. Het volgende artikel wordt niet-invasieve meting van de flow gemedieerde dilatatie in de brachiale en oppervlakkige femorale slagaders van ratten.
Introduction
Het vasculaire endotheel is een cellulaire monolaag die lijnen de lumen van de slagaders en is een belangrijke regulator van de vasculaire functie. Er zijn talrijke moleculen vrijgemaakt uit het endotheel die resulteren in modulatie van diameter bloedvat. Onder deze moleculen, stikstofmonoxide (NO), lijkt de primaire vaatverwijdende molecuul vrijgemaakt uit het vasculaire endotheel in reactie op stimulatie (bijvoorbeeld, insuline, acetylcholine, of veranderingen in shear stress) 1. In het vasculaire endotheel, wordt NO door endotheliale het enzym NO synthase (eNOS) en vervolgens vrijgemaakt uit endotheelcellen 2. NO diffundeert naar de vasculaire gladde spieren, waar het veroorzaakt ontspanning en verhoogde vaatdiameter 3.
Endotheeldisfunctie kan niet-invasief worden beoordeeld bij de mens met de flow-gemedieerde dilatatie (FMD) techniek 4,5. MKZ is voorgesteld om een functionele bioassay te vertegenwoordigen endotheel-afgeleideNO biologische beschikbaarheid bij de mens, en wordt gewoonlijk beoordeeld op de brachiale of oppervlakkige dijbeenslagader in reactie op reactieve hyperemie na een ~ 5 min occlusie 6. Reactieve hyperemie verhoogt laminaire afschuifkrachten die worden getransduceerd met de endotheelcellen 7, signalering vrijkomen van NO 8. Hoewel in de afgelopen jaren, het aandeel vaatverwijding geïnitieerd door de NO is besproken 9,10 MKZ is indicatief voor endotheel afhankelijke dilatatie en heeft consequent aangetoond dat cardiovasculaire gebeurtenissen te voorspellen 11-13.
Tot op heden zijn duizenden studies het MKZ toegepaste techniek voor niet-invasieve meting van de endotheelfunctie bij mensen. Gezien de recente verschuiving in focus translationeel onderzoek, zou richtlijnen voor de niet-invasieve meting van FMD in knaagdieren zeer waardevol zijn. Overeenstemming met een translationele benadering, werd dit protocol vastgesteld voor de meting van MKZ in arm en superficial femorale arteriën van ratten, zoals die sites worden meestal gemeten in mensen. Dit protocol resulteert in een robuust en herhaalbare MKZ respons bij ratten, maar meting van MKZ bij ratten is technisch veeleisend en kunnen moeilijk zijn voor andere onderzoekers om te repliceren zonder video demonstratie. Daarom zal de volgende voorwerp een werkwijze voor de niet-invasieve meting van FMD in de brachiale en oppervlakkige femorale arteriën van ratten tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures voldeden aan de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren 14 en werden goedgekeurd door de Universiteit van Utah en Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Animal Care en gebruik.
1. Dierlijke Voorbereiding
- Plaats dier in anesthesie inductie kamer met 3% isofluraan in 100% zuurstof. Laat het dier in de inductie kamer tot deze reageert op externe stimuli.
- Verwijder het dier uit de inductie kamer en plaats het op een verwarmde onderzoekstafel uitgerust met elektrocardiogram (ECG) elektroden. Handhaaf anesthesie op 3% isofluraan in 100% zuurstof. Brachial en oppervlakkige dijbeenslagader MKZ kunnen niet tegelijkertijd worden uitgevoerd. Daarom worden bereidingsinstructies voor elke meting hieronder.
2. slagader Voorbereiding
- Plaats het dier in rugligging en beperken de linker bovenste ledematen en elk onderste ledematen van de eeniMAL de onderzoekstafel met chirurgische tape.
- Restrain rechts bovenste ledematen van de dieren, zodat het onderste gedeelte van de bovenste ledematen enigszins verhoogd (~ 0,2-0,5 cm) boven het platform.
- Solliciteer ontharingsmiddel (bijv Nair) naar rechts bovenste ledematen van het dier om haar te verwijderen.
- Plaats een occlusie cuff (10 mm lumendiameter standaard vasculaire occlusie) rechts bovenste ledematen distaal van de elleboog. Laat de occlusie-inrichting niet rusten op het platform, aangezien de inflatie / deflatie de ledematen bewegen en verstoren echografie beelden.
- Stel het echoapparaat aan B-modus met behulp van de echo toetsenbord.
- Breng een kleine hoeveelheid ultrasoongel de bovenste ledematen van de dieren, proximaal van de occlusie cuff.
- Handmatig uitlijnen een ultra-hoge frequentie lineaire array transducer gekoppeld aan een stereotactische houder met de bovenste ledematen. De slagader moet zichtbaar 2-3 mm diep zijn.
- Om te bevestigen dat de slagader, niet de brachiale ader, wordtafgebeeld, overschakelen naar de PW-modus met behulp van de echo toetsenbord. De slagader zal pulsatiele bloedstroom in tegenstelling tot de naburige ader die continue bloedstroom hebben.
3. Oppervlakkige Femorale arterie Voorbereiding
- Plaats het dier in rugligging en beperken de bovenste ledematen en de linker onderste ledematen aan de onderzoekstafel met chirurgische tape.
- Restrain de juiste onderste ledematen van het dier naar een verhoogde positie (~ 0,5-1 cm) boven het platform met behulp van een pad (bv gevouwen papieren handdoeken).
- Solliciteer ontharingsmiddel (bijv Nair) naar rechts van het dier onderste ledematen om haar te verwijderen. Na ontharing moet de lies duidelijk zichtbaar op de bovenste binnenkant van de dijen zijn.
- Plaats een occlusie cuff (10 mm lumendiameter standaard vasculaire occlusie) proximaal aan de rechter enkel. Laat de occlusie-inrichting niet rusten op het platform, aangezien de inflatie / deflatie de onderste ledematen bewegen en verstoren echografie beelden.
- Stel de ultrasone machineB-mode.
- Een kleine hoeveelheid van ultrageluid gel aan de onderste ledematen van het dier, proximaal van de occlusie cuff.
- Handmatig uitlijnen ultrahoge frequentie lineaire array transducer die aan een stereotactische houder met de femorale ader, welke zichtbaar is door de huid. De oppervlakkige dijbeenslagader moet zichtbaar <1 mm diep zijn.
- Om te bevestigen dat de oppervlakkige dijbeenslagader, niet de lies, wordt afgebeeld, overschakelen naar de PW-mode. De slagader zal pulsatiele bloedstroom in tegenstelling tot de naburige ader die continue bloedstroom hebben.
4. basislijnfase
- Beeld optimaliseren de B-modus, vergelijkbaar met hoe het zou gebeuren bij mensen 15. Zorg ervoor dat een horizontale, longitudinale beeld van het schip met intima-media gevisualiseerd in beide wanden wordt waargenomen. Optimaliseer het beeld door iets aanpassen van de ultrasone sonde plaatsing die zoveel mogelijk van de slagader te waarborgen mogelijk is zichtbaar in de capture-venster.
- Als alternatief stellen echografie instellingen om een beter beeld te krijgen door het veranderen van de helderheid / contrast, focale zones, frequentie, dynamisch bereik, en de lijn dichtheid. Er zijn andere manieren om het ultrasone beeld optimaliseren, maar gedetailleerde beschrijving van deze vallen buiten het bestek van dit protocol.
- Na optimalisatie slagader beelden, zet ECG-gating alleen opnamen tijdens de R-golf zodat slechts één diameter frame verzameld zijn gedurende elke diastolische gedeelte van een hartcyclus weergeven.
LET OP: ECG-gating is beschikbaar op de echografie machine gebruikt in dit protocol door het selecteren van ECG-gating onder de optie fysiologische instellingen, maar deze functie is mogelijk niet beschikbaar op alle ultrasound machines. ECG-gating moet worden ingeschakeld nadat het beeld wordt geoptimaliseerd, omdat het moeilijk is om een beeld te verkrijgen bij lagere framesnelheden (bijv eenmaal per R-golf). Zonder ECG-gating, de combinatie van een hoge hartslag in ratten en vereiste van een hoge framesnelheidrate te vangen van de diastolische gedeelte van de hartcyclus staat alleen voor ~ 10-20 tweede clips. De logge grootte en de hoeveelheid gegevens in elke clip verhoogt de analyse last aanzienlijk. - Record 60 seconden van de baseline-gegevens met behulp van B-mode.
OPMERKING: De ultrasone machine neemt altijd echter niet alle beelden worden opgeslagen op de ultrasone machine, aangezien er een limiet aan het aantal frames dat per echografie clip kan worden opgenomen. De clip lengte (dat wil zeggen, het aantal frames) kan worden aangepast in de instellingen. Er wordt voorgesteld om ingesteld voor maximale aantal frames per clip. Wanneer de opname is aan het einde van een clip (dat wil zeggen, maximum aantal beelden bereikt), de opname voortgezet, maar de clip naar voren rolt vastleggen van de laatste frames. In dit geval worden frames die eerder buiten de maximale Afslagschakelaars werden gevangen vervolgens verwijderd. Hoewel deze complicaties bij de registratie verschillen tussen machines, kan een aanpassing van opnametijd nodig. - Switch naar PW-mode. Plaats de cursor in het midden van het lumen. Sample poorten worden automatisch met betrekking tot de cursor geplaatst, maar kan worden aangepast aan de breedte met de ultrasone toetsenbord. Handhaaf een insonatie hoek van ≤60 °.
- Pas de insonatie hoek door het veranderen van het Doppler stralingshoek. Maak fijne aanpassingen aan de hoek met behulp van de ultrasone toetsenbord. Als geen van deze bieden een hoek geschikt voor het meten, handmatig aanpassen van de ultrasone sonde door het kantelen van de slagader naar een meer optimale hoek. Als een aanpassing van de echografie hoek wordt uitgevoerd, te heroveren B-modus beelden.
- Neem 10 seconden snelheidsgegevens.
5. Occlusie Phase
- Pomp de vasculaire occlusie-inrichting met een luchtgevulde 10 ml spuit. Om de luchtdruk constant in de vasculaire occlusie-inrichting te houden, vouw de buis op zichzelf en plaats een bindmiddel clip op de gevouwen buis.
- Overschakelen naar PW-modus om manchet occlusie te bevestigen, zoals blijkt uiteen grote reductie in het bloed snelheid.
- Schakel over naar de B-modus en opnemen van gegevens in 60 seconden clips, totdat 04:45 min van occlusie.
- Overschakelen naar PW-mode. Een register bijhouden van de hartslag en de tijd van elke ultrageluid clip voor analyse.
6. hyperemic Phase
- Laat de manchet tijdens het opnemen in de PW-modus door het verwijderen van het bindmiddel clip van de gevouwen buis. Neem 5 seconden vóór en 5 seconden na cuff release.
- Schakel over naar de B-modus en opnemen van gegevens in 60 seconden clips tot 3 minuten na occlusie. Een register bijhouden van de hartslag en de tijd van elke ultrageluid clip voor analyse.
- Na voltooiing van MKZ verwijder het dier uit de onderzoekstafel en bewaken totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
7. Analyse
- Voor de analyse, export ultrasound zoals DICOM-bestanden naar een offline computer uitgerust met edge-detectie software, die het mogelijk maakt voor de onpartijdige af te schrikkenling van slagader diameter op elk frame. Analyse is mogelijk op de echografie-machine, maar het niet aan te raden, want het is zeer tijdsintensief en onder voorbehoud van onderzoeker vooringenomenheid.
- Analyseren van gegevens slagader diameter in 60 seconden segmenten tijdens de baseline en occlusie fase en in 10 seconden segmenten tijdens de hyperemic fase.
- Analyseer bloed snelheid gegevens met behulp van de flow-analyse mogelijkheden van de geautomatiseerde edge-detectie software. Bepaal gemiddelde bloed snelheid door het meten van 5 of meer opeenvolgende golfvormen van uniform uiterlijk tijdens de baseline en occlusie fasen. Bepaal gemiddelde bloed snelheid tijdens reactieve hyperemie bloed snelheden direct na cuff release. De golfvorm met de hoogste bloed snelheid wordt beschouwd piekplasmaspiegel velocity.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flow-gemedieerde dilatatie werd uitgevoerd op de brachiale en oppervlakkige femorale slagader van 8 Wistar ratten. Plaatsing van een rat wordt getoond in figuur 1.
Representatieve ultrasone beelden van de oppervlakkige femorale slagader worden weergegeven in figuur 2.
Figuur 1. rat en echografie positionering.
Plaatsing van rat voor meting van brachialis (A) en oppervlakkige femorale (B) slagader FMD. Positionering van ultrasone sonde en occlusie manchet voor het meten van brachialis (C) en oppervlakkige femorale (D) slagader MKZ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger van echobeelden.
Ultrasoundafbeelding van de oppervlakkige femorale slagader middels B-modus beeldvorming voor waarin de diameter (A). Bloedsnelheid werd bepaald met PW-modus. Getoond in de figuur zijn bloed snelheid bij aanvang (B), de verlaging van bloed snelheid tijdens de afsluiting fase (C), en de snelle toename van het bloed snelheid bij manchet vrijkomen tijdens de hyperemic fase (D). Klik hier om te bekijken grotere versie van dit cijfer.
Zoals getoond in figuur 3, is een soortgelijke vaatverwijdende respons tussen de arm en oppervlakkige femorale slagaders. Uitgedrukt als percentage van de baseline, MKZ was vergelijkbaar tussen de slagaders, maar als expressed als absolute verandering van de uitgangswaarde, MKZ was significant hoger in de brachiale slagader (P <0,05). Dit verschil is waarschijnlijk het gevolg van een grotere diameter vaartuig in de brachiale slagader dan in de oppervlakkige femorale slagader (498 ± 28 vs. 397 ± 11 pm, P <0,05). Net als bij de meting van MKZ in de mens 16, intersession variatiecoëfficiënt voor arm en oppervlakkige femorale MKZ waren 9 ± 1 en 10 ± 4%, respectievelijk. Ondanks verschillen in grootte vat, was er een sterk lineair verband tussen arm en oppervlakkige dijbeenslagader FMD uitgedrukt als een percentage of absolute verandering van basislijn.
Figuur 3. Flow-gemedieerde dilatatie in ratten.
Vasodilatatie van de brachiale en oppervlakkige femoralartery na een 5 min periode van ischemie, uitgedrukt als percentage (A) en absolute (B) Te wijzigen ten opzichte van baseline. MKZ was vergelijkbaar tussen slagaders uitgedrukt als percentage van de basislijn (C). Echter, uitgedrukt als een absolute verandering van de uitgangswaarde (D), FMD was significant hoger in de brachiale slagader. Of uitgedrukt als een percentage (E) of absolute (F) verandering van de uitgangswaarde, was er een sterke relatie voor MKZ tussen arm en oppervlakkige femorale slagaders. * P <0,05 vs. slagader. Waarden zijn gemiddelden ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zoals getoond in Tabel 1, werden cardiovasculaire variabelen gemeten bij basislijn, occlusie en hyperemic fasen. Aderdiameter werd bepaald met de intima-aan-intima of media naar media weg tijdens de diastole gedeelte van de hartcyclus. Aderdiameter werd gemeten gedurende 60 seconden bij continu gemeten in ~ 60 seconde door de occlusie en hyperemic fasen. Bloedsnelheid werd bepaald volgens de gemiddelde arteriële snelheid van bloed in het lumen tijdens één hartcyclus. Bloedstroming werd berekend volgens de vergelijking: bloedstroming (pl / min) = (bloedsnelheid (um / sec) · π · [verblijf diameter (um) / 2] 2 · 60). Afschuifsnelheid werd berekend volgens de vergelijking: afschuifsnelheid (s-1) = bloed snelheid · 8 / vaartuig diameter. MKZ werd berekend volgens de vergelijking: FMD = (piek vaartuig diameter - basislijn diameter vat) / basislijn vaartuig diameter.
| Armslagader | Oppervlakkige Femorale arterie | |
| basislijnfase | ||
| Hartslag, bpm | 367 ± 12 | 368 ± 16 |
| Diameter urn | 498 ± 28 | 397 ± 11 * |
| Blood Velocity, um / sec | 85 ± 8 | 76 ± 11 |
| Blood Flow, pl / min | 1027 ± 147 | 568 ± 90 * |
| Shear Rate, s -1 | 1,4 ± 0,1 | 1,5 ± 0,2 |
| occlusie Phase | ||
| Hartslag, bpm | 362 ± 12 | 359 ± 14 |
| Diameter urn | 499 ± 32 | 390 ± 11 * † |
| Blood Velocity, um / sec | 63 ± 9 † | 38 ± 8 † |
| Blood Flow, pl / min | 722 ± 122 † | 272 ± 62 * † |
| Shear Rate, s -1 | 1,0 ± 0,2 † | 0,8 ± 0,2 † |
| hyperemic Phase | ||
| Hartslag, bpm | 363 ± 12 | 357 ± 12 |
| Peak Diameter, um | 586 ± 22 † ‡ | 457 ± 15 * † ‡ |
| Peak Blood Velocity, um / sec | 149 ± 11 † ‡ | 205 ± 12 * † ‡ |
| Peak Blood Flow, pl / min | 1778 ± 229 † ‡ | 1495 ± 127 † ‡ |
| Peak Shear Rate, s -1 | 2,5 ± 0,3 † ‡ | 3,7 ± 0,2 * † ‡ |
| * P <0,05 vs. slagader. </ Td> | ||
| † P <0,05 versus basislijn fase. | ||
| ‡ P <0,05 vs. Occlusie fase. | ||
| Waarden zijn gemiddelden ± SEM. |
Tabel 1. Cardiovasculaire variabelen door elke fase van het protocol.
Er waren geen veranderingen in hartslag gedurende ofwel protocol, alsook tussen slagader metingen (P> 0,05). De diameter van de arteria brachialis was aanzienlijk groter dan de oppervlakkige femorale slagader (P <0,05). Tijdens de fase occlusie, was er een significante vermindering van bloedsnelheid, bloedstroming en afschuifsnelheid vergelijking met de uitgangswaarde in beide arteriën (P <0,05). Na manchet release, piekplasmaspiegel snelheid, de doorbloeding, en afschuifsnelheid waren significant hoger dan basislijn of occlusie fasen zowel slagaders (p <0,05). Soortgelijke meting van reactieve hyperemie bij mensen 16, intersession variatiecoëfficiënt voor brachiale en oppervlakkige femorale reactieve hyperemie waren 24 ± 9 en 19 ± 5%, respectievelijk. Er waren verschillen in bloedsnelheid, bloedstroming en afschuifsnelheid tussen slagaders als gevolg een groot deel aan het verschil in aderdiameter.
Na normaliseren tot afschuifsnelheid piek, vasodilatatie hoger in de brachiale slagader (figuur 4). Dit was ook het geval voor MKZ uitgedrukt als een absoluut verandering ten opzichte van baseline. Ondanks verschillen in grootte, was er een sterk lineair verband in procenten en absolute FMD genormaliseerd naar afschuifsnelheid tussen de arm en oppervlakkige dijbeenslagader piek.
/54762fig4.jpg "/>
Figuur 4. Flow-mediated dilatatie genormaliseerd naar afschuifsnelheid bij ratten piek.
Na normaliseren tot afschuifsnelheid piek MKZ expressedas procent (A) of absolute verandering (B) vanaf de basislijn groter in de brachiale slagader opzichte van de oppervlakkige femorale slagader.
Ondanks verschillen tussen slagaders in MKZ genormaliseerd tot afschuifsnelheid piek, was er een sterke relatie tussen arm en oppervlakkige femorale bloedvaten als MKZ werd uitgedrukt als een percentage (C) of absolute verandering (D) ten opzichte van baseline. * P <0,05 vs. slagader. Waarden zijn gemiddelden ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie, een niet-invasieve meting van MKZ werd aangetoond in de brachiale en oppervlakkige femorale slagaders van ratten. Vergelijkbaar met de mens 6, na een 5 min occlusie periode was er een snelle toename van bloedsnelheid (reactief hyperemie) waardoor schuiven toenemend op de slagaderwand waardoor de daaropvolgende vasodilatatie van de slagader. MKZ werd waargenomen in zowel de brachiale en oppervlakkige femorale slagaders. Bovendien was er een sterke relatie tussen MKZ slagaders. Hoewel de piek afschuifsnelheid was hoger in de oppervlakkige dijbeenslagader, MKZ genormaliseerd piek afschuifsnelheid onderhouden een sterke relatie tussen de slagaders. Tezamen geven deze resultaten aan dat de niet-invasieve meting van MKZ goed worden uitgevoerd bij ratten.
Uit meting van MKZ werd uitgevoerd op twee verschillende slagaders, de grootte van MKZ was vergelijkbaar uitgedrukt als percentage verandering van de uitgangswaarde. however, uitgedrukt als een absolute verandering van de uitgangswaarde, MKZ was hoger in de slagader, als die slagader had een ~ 25% groter rust diameter dan de oppervlakkige femorale slagader. Deze resultaten zijn vergelijkbaar met die van humane studies waarin MKZ werd gemeten in de brachiale oppervlakkige femorale slagaders in dezelfde onderwerpen 17,18. Ondanks de verschillen in arteriële diameter, de verhouding van MKZ, uitgedrukt als percentage of absolute verandering van de uitgangswaarde, is zeer sterk tussen slagaders.
Flow gemedieerde dilatatie is voorgesteld om een functionele bioassay voor endotheelafhankelijke NO biologische beschikbaarheid bij de mens 6 vertegenwoordigen, zoals vasodilatatie treedt via de NO uit het endotheel bij toenemende afschuifsnelheid 1,3. Dus een hogere MKZ genormaliseerd piek afschuifsnelheid vertegenwoordigt een endotheel dat gevoeligheid een bepaalde toename afschuifsnelheid toegenomen. Na het normaliseren van MKZ te afschuifsnelheid piek, MKZ was hoger in de brachial slagader, ongeacht of het wordt uitgedrukt als een percentage of absolute verandering ten opzichte van baseline. Ondanks verschillen in grootte van MKZ genormaliseerd op afschuifsnelheid tussen arm en oppervlakkige femorale slagaders piek, was er een sterke lineaire relatie in procenten en absolute FMD genormaliseerd naar afschuifsnelheid tussen slagaders piek.
In deze studie wordt de niet-invasieve meting van MKZ beschreven in de brachiale en oppervlakkige femorale slagaders met manchet occlusie distaal van de ultrasone sonde. Deze cuff werd geselecteerd om verschillende redenen, 1) bij mensen, dit is het meest gebruikte methode voor het meten MKZ, 2) de bijdrage van NO aan MKZ is aangetoond beter zijn aderdiameter meting proximaal occlusieplaats 9 , en 3) was er moeite met het ultrasone beeld behoud na cuff inflatie als de meetlocatie was distale occlusie. Hoewel deze procedure vertegenwoordigt een niet-invasieve meting van MKZanderen MKZ uitgevoerd in levende ratten met een chirurgische occlusie van de arteria iliaca communis met ultrasone meting distale occlusie in de femorale arterie 19. De MKZ-respons met behulp van het protocol voor het eerst beschreven door Heiss et al. werd geremd door infuus van eNOS remmers. Inderdaad, deze procedure is gebruikt om aan te tonen dat farmacologische toename in intracellulaire NO verbetert MKZ in twee ratmodellen van endotheliale dysfunctie en hypertensie 20, en de blootstelling aan tweedehands rook resulteert in een bijzondere waardevermindering van MKZ in ratten 21,22. Deze studies tonen de bijdrage van NO MKZ bij ratten en stellen de relatie van MKZ de cardiovasculaire gezondheid. Aangezien deze techniek is invasief, kan het de mogelijkheid om MKZ longitudinaal meten dezelfde ratten gedurende weken tot jaren beperken. Met behulp van een werkwijze vergelijkbaar met dit onderzoek werden twee recente studies niet-invasieve meting van MKZ uitgevoerd in de achterpoot van muizen 23,24,maar er waren een aantal technische verschillen tussen de studies (dwz meting tijdsverloop en de plaatsing van de ultrasone sonde en occlusie cuff). Door verschillen tussen deze studies en moeilijk kunnen repliceren deze resultaten, werd de niet-invasieve meting van FMD in ratten plaats getracht ratten gewoonlijk gebruikt worden bij translationeel onderzoek, maar een groter geheel en bloedvaten omvang dan muizen. Terwijl de meting van MKZ in de femorale slagader van knaagdieren in het algemeen niet nieuw, heeft geen enkele studie het meten van MKZ uitgevoerd in de slagader van elke levende knaagdieren. De sterke relatie MKZ tussen ledematen in de onderhavige studie de systemische aard van endotheelfunctie illustreren, maar ook een werkwijze om niet-invasief meten FMD bij dieren die de bloedstroom in de achterste ledematen (bijv femorale arterioveneuze fistel) hebben verstoord.
Het optimaliseren en onderhouden van een hoge kwaliteit ultrasound beelden zijn kritische vaardigheden die nodig zijn voor deze proceduRe en vereist uitgebreide praktijk. Bijvoorbeeld, voor het meten van MKZ bij de mens, wordt voorgesteld dat tenminste 100 gecontroleerde scans worden uitgevoerd vóór scanprocedure onafhankelijk 5. Op sommige momenten, kan het beeld verschuiven tijdens manchet occlusie en vereisen kleine aanpassingen van de ultrasone sonde. Een cruciale stap in dit protocol is het schakelen tussen B-modus en PW-modus op specifieke tijdstippen. Gelijktijdig B-modus en PW-beeldvormende zijn niet mogelijk op de echo machine gebruikt in dit protocol. Daarom is het nodig om snel te schakelen tussen modi om ultrasone snelheid en diameter metingen opneemt tijdens bepaalde tijdsegmenten. Het hebben van een uitgeschreven protocol en de praktijk van de uitvoering van het protocol zal de efficiëntie van het schakelen tussen ultrasound modes sterk verbeteren. Gezien de tijd-gevoelige aard van ultrageluid opnames tijdens dit protocol, zal er fouten optreden, dus wees voorbereid te noteren een protocol afwijkingen, zoals het vergeten om een echografie clip vast te leggen.Mist een echografie clip in de occlusie fase is niet kritisch, maar als een opname verloren tijdens de reactieve hyperemie fase wordt voorgesteld om de procedure opnieuw uit te voeren na ten minste 30 minuten zijn verstreken 25.
Zoals bij elke studie zijn er beperkingen aan de experimentele protocol. In deze studie, werd anesthesie toegediend aan ratten onder 100% zuurstof, waardoor metingen van MKZ Ook tijdens vasoreactivity te hyperoxie. Andere vormen van anesthesie, zoals natrium pentobarbital kunnen worden gebruikt om een representatieve bloedgas profiel voor mens en nam de deze zorg. De bloeddruk werd niet gecontroleerd op elk punt van dit protocol. Hoewel bloeddruk niet verandert in respons op acute occlusie cuff bij de mens, het is onbekend of elke voorbijgaande verandering in bloeddruk zou voorkomen bij ratten. Daarnaast werd perslucht gebruikt om de vasculaire occlusie te vullen worden vullen met water kan hebben geleid tot een steviger occlusievan bloedstroom water is minder samendrukbaar als lucht. Tenslotte non-invasieve meting van FMD onder omstandigheden waarin eNOS wordt geremd (dat wil zeggen L-NMMA infusie) werden niet uitgevoerd. Zo is de bijdrage van NO van MKZ, want het is uitgevoerd in dit protocol, is nog niet vastgesteld.
Tot slot, is dit artikel een protocol voor de niet-invasieve meting van MKZ in de arm en oppervlakkige femorale slagaders van ratten aangetoond. In combinatie met de recente verschuiving in focus translationeel onderzoek, kan de beoordeling van MKZ in ratten een waardevol hulpmiddel voor het vertalen resultaten bij mensen aan ratten, en de mogelijkheid bieden endotheelfunctie beoordeeld op verschillende tijdstippen in longitudinale studies van ratten ontvangen verschillende behandelingen. Inderdaad, vermindering MKZ vergezeld gaan van arteriële verstijving aorta werden waargenomen na nierschade in een rattenmodel van chronisch nierfalen (ongepubliceerde resultaten), waarvan de toepassing aantoontmaking van niet-invasieve FMD als marker van vasculaire functie in lengterichting dierstudies. Toekomstige studies naar mechanismen van MKZ in ratten worden gerechtvaardigd te onderzoeken en zou verder inzicht geven in niet-invasieve MKZ-meting bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Optional |
| Signacreme electrode cream | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Transpore surgical tape | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Depilatory cream (e.g., Nair) | General supply | ||
| Cotton swabs | General supply | ||
| Ultrasound gel | General supply | ||
| Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| 10 ml syringe with Luer-Lok tip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Paperclip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Hypodermic needle – 18 gauge | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus | |
| Medium binder clip | General Supply | Used for occlusion cuff apparatus |
References
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S.
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C.
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070 (2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
